Summary
Hier presenteren we een protocol om machine-vision-software te gebruiken om dynamische processen tijdens TEM-beeldvorming te stabiliseren, terwijl tegelijkertijd meerdere stromen metadata naar elke afbeelding worden geïndexeerd in een navigeerbare tijdlijn. We laten zien hoe dit platform geautomatiseerde kalibratie en mapping van de elektronendosis in de loop van een experiment mogelijk maakt.
Abstract
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) stelt gebruikers in staat om materialen op hun fundamentele, atomaire schaal te bestuderen. Complexe experimenten genereren routinematig duizenden afbeeldingen met tal van parameters die tijdrovende en gecompliceerde analyse vereisen. AXON-synchroniciteit is een machine-vision synchronisatie (MVS) softwareoplossing die is ontworpen om de pijnpunten aan te pakken die inherent zijn aan TEM-studies. Eenmaal geïnstalleerd op de microscoop, maakt het de continue synchronisatie mogelijk van beelden en metadata gegenereerd door de microscoop, detector en in situ systemen tijdens een experiment. Deze connectiviteit maakt de toepassing van machine-vision-algoritmen mogelijk die een combinatie van ruimtelijke, straal- en digitale correcties toepassen om een interessant gebied binnen het gezichtsveld te centreren en te volgen en onmiddellijke beeldstabilisatie te bieden. Naast de aanzienlijke verbetering van de resolutie die door een dergelijke stabilisatie wordt geboden, maakt metadatasynchronisatie de toepassing mogelijk van computationele en beeldanalyse-algoritmen die variabelen tussen afbeeldingen berekenen. Deze berekende metadata kunnen worden gebruikt om trends te analyseren of belangrijke interessegebieden binnen een dataset te identificeren, wat leidt tot nieuwe inzichten en de ontwikkeling van meer geavanceerde machine-vision-mogelijkheden in de toekomst. Een dergelijke module die voortbouwt op deze berekende metadata is dosiskalibratie en -beheer. De dosismodule biedt state-of-the-art kalibratie, tracking en beheer van zowel de elektronenfluentie (e-/Å 2·s-1) als de cumulatieve dosis (e-/Å2) die pixel-voor-pixel aan specifieke delen van het monster wordt geleverd. Dit maakt een uitgebreid overzicht mogelijk van de interactie tussen de elektronenbundel en het monster. Experimentanalyse wordt gestroomlijnd door middel van speciale analysesoftware waarin datasets bestaande uit afbeeldingen en bijbehorende metagegevens eenvoudig kunnen worden gevisualiseerd, gesorteerd, gefilterd en geëxporteerd. Gecombineerd vergemakkelijken deze tools efficiënte samenwerkingen en experimentele analyse, moedigen ze datamining aan en verbeteren ze de microscopie-ervaring.
Introduction
Transmissie-elektronenmicroscopen (TEM's) en hun mogelijkheden hebben enorm geprofiteerd van de vooruitgang in camera's, detectoren, monsterhouders en computertechnologieën. Deze vooruitgang wordt echter belemmerd door losgekoppelde gegevensstromen, beperkingen van de menselijke werking en omslachtige gegevensanalyse 1,2. Bovendien passen in situ- en operando-experimenten TEM's aan tot real-time laboratoria op nanoschaal, waardoor monsters in gas- of vloeistofomgevingen kunnen worden bestudeerd en tegelijkertijd een reeks externe stimuli 3,4,5 kunnen worden toegepast. De adoptie van dergelijke complexe workflows heeft deze beperkingen alleen maar vergroot, en de daaruit voortvloeiende toename van de omvang en complexiteit van deze gegevensstromen is een gebied van groeiende zorg. Er is dus een groeiende nadruk op het gebruik van machine-actionability om gegevens te vinden, te openen, samen te werken en te hergebruiken, een praktijk die bekend staat als de FAIR-principes6. Het publiceren van onderzoeksgegevens in overeenstemming met het FAIR-principesconcept heeft gunstige aandacht gekregen van overheidsinstanties over de hele wereld7,8, en de toepassing van de FAIR-principes met behulp van machine-vision-software is een belangrijke stap in hun adoptie.
Een machine-vision synchronisatie (MVS) softwareplatform is ontwikkeld als antwoord op de specifieke pijnpunten die inherent zijn aan het uitvoeren en analyseren van complexe, metadata-zware TEM-experimenten (met name in situ en operando experimenten)9. Eenmaal geïnstalleerd op de TEM, verbindt, integreert en communiceert de MVS-software met de microscoopkolom, detectoren en geïntegreerde in-situ systemen. Dit stelt het in staat om continu afbeeldingen te verzamelen en die afbeeldingen uit te lijnen met hun experimentele metadata, waardoor een uitgebreide doorzoekbare database wordt gevormd, een tijdlijn van het experiment van begin tot eind (figuur 1). Deze connectiviteit stelt de MVS-software in staat om algoritmen toe te passen die op intelligente wijze een interessegebied (ROI) volgen en stabiliseren, zelfs wanneer monsters morfologische veranderingen ondergaan. De software past indien nodig aanpassingen toe aan podium-, balk- en digitale correcties om de ROI te stabiliseren via de functies Drift Control en Focus Assist . Naast het verrijken van de afbeeldingen met de onbewerkte metadata die worden geproduceerd door de verschillende experimentele systemen, kan de software nieuwe, computationele metadata produceren met behulp van beeldanalyse-algoritmen om variabelen tussen afbeeldingen te berekenen, waardoor het automatisch kan corrigeren voor monsterdrift of veranderingen in focus.
TEM-afbeeldingen en de bijbehorende metagegevens die via de MVS-software worden verzameld, zijn georganiseerd als een experimentele tijdlijn die door iedereen kan worden geopend en bekeken via de gratis, offline versie van de analysesoftware, Studio (hierna de analysesoftware genoemd)10. Tijdens een experiment synchroniseert en registreert de MVS-software drie soorten beelden van de camera of detector van de microscoop, die bovenaan de tijdlijn onder de beeldviewer worden weergegeven: single acquisition (individuele single acquisition-beelden die rechtstreeks uit de TEM-software zijn verkregen), raw (beelden van de detector / camera livestream waarvoor geen digitale driftcorrecties zijn toegepast; deze beelden kunnen fysiek zijn gecorrigeerd via podiumbeweging of bundelverschuiving) en drift gecorrigeerd (beelden van de detector/camera livestream die digitaal zijn afgedreven). Gegevens die tijdens een experiment of sessie worden verzameld, kunnen verder worden verfijnd tot kleinere secties of gegevensfragmenten, ook wel verzamelingen genoemd, zonder verlies van ingesloten metagegevens. Vanuit de analysesoftware kunnen afbeeldingen, afbeeldingsstapels en metagegevens rechtstreeks worden geëxporteerd naar een verscheidenheid aan open afbeeldingen en spreadsheettypen voor analyse met behulp van andere tools en programma's.
Het raamwerk van microscoopbesturing, stabilisatie en metadata-integratie mogelijk gemaakt door de MVS-software maakt ook de implementatie van extra machine-vision-programma's of -modules mogelijk, ontworpen om beperkingen in de huidige TEM-workflows te verlichten. Een van de eerste modules die is ontwikkeld om te profiteren van dit synchronisatieplatform is elektronendosiskalibratie en ruimtelijke tracking van aan de bundel blootgestelde gebieden in het monster. Alle TEM-beelden worden gevormd uit de interactie tussen het monster en de elektronenbundel. Deze interacties kunnen echter ook resulteren in negatieve, onontkoombare effecten op het monster, zoals radiolyse en knock-on schade 11,12, en vereisen een zorgvuldige balans tussen het toepassen van een voldoende hoge elektronendosis om het beeld te genereren en het minimaliseren van de resulterende bundelschade 13,14.
Hoewel veel gebruikers vertrouwen op schermstroommetingen om de elektronendosis te schatten, is aangetoond dat deze methode de werkelijke bundelstroom op grote schaal onderschat15. Kwalitatieve dosiswaarden kunnen worden verkregen via de schermstroom op dezelfde microscoop met dezelfde instellingen, maar het reproduceren van deze dosiscondities met behulp van verschillende microscopen of instellingen is zeer subjectief. Bovendien vereisen alle aanpassingen van de beeldparameter die de gebruiker tijdens het experiment heeft aangebracht, zoals spotgrootte, diafragma, vergroting of intensiteit, een afzonderlijke meting van de schermstroom om de resulterende dosis te berekenen. Gebruikers moeten ofwel de beeldvormingsomstandigheden die tijdens een bepaald experiment worden gebruikt, strikt beperken of elke gebruikte lensconditie nauwkeurig meten en registreren, waardoor het experiment aanzienlijk wordt bemoeilijkt en verder wordt uitgebreid dan haalbaar is voor een normale werking van de microscoop16,17.
Dosis, voor dit protocol dosissoftware genoemd, is een softwaremodule voor dosiskalibratie die gebruik maakt van een speciale kalibratiehouder die is ontworpen om geautomatiseerde stroommetingen mogelijk te maken. Een Faraday-beker, de gouden standaard voor nauwkeurige bundelstroomkalibratie15, is geïntegreerd in de punt van de kalibratiehouder. De MVS-software voert een reeks bundelstroom- en bundelgebiedkalibraties uit voor elke lensconditie en integreert die waarden op de beelden op pixelniveau.
In dit videoartikel worden MVS-softwareprotocollen die zijn ontworpen om alle gebieden van de TEM-workflow te verbeteren, gepresenteerd met behulp van representatieve nanomateriaalmonsters. Een bundelgevoelig zeoliet nanodeeltjesmonster14 wordt gebruikt om de kalibratie- en dosisbeheerworkflows te demonstreren. We voeren een representatief in situ verwarmingsexperiment uit met behulp van een Au/FeOx nanokatalysator18,19 monster dat significante morfologische veranderingen ondergaat bij verhitting. Dit in situ experiment benadrukt de stabilisatiealgoritmen van de software en het vermogen om meerdere stromen metadata te verzamelen, wat een inherente uitdaging is voor in situ en operando studies. Hoewel niet beschreven in het protocol, vanwege de unieke gevoeligheid voor elektronendosis, bespreken we representatieve voorbeelden van het nut van de software voor vloeistof-EM-studies (protocollen waarvoor eerder zijn gerapporteerd in de literatuur20,21,22), en hoe deze technieken kunnen worden toegepast om het begrip van het effect van dosis op vloeistof-EM-experimenten te verbeteren. Ten slotte laten we zien hoe gegevensanalyse wordt gestroomlijnd met behulp van de offline analysesoftware om een verscheidenheid aan afbeeldings-, video- en gegevensbestanden te visualiseren, filteren en exporteren naar andere toegankelijke indelingen.
Figuur 1: Voorbeelden van gebruikersinterfaces voor MVS en analysesoftware . (A) Het beeldweergavevenster en het bedieningspaneel van de synchronisatiesoftware. Een verbinding tussen de TEM en de synchronisatiesoftware wordt tot stand gebracht door de Connect-knop te activeren, die de afbeeldingen en metadata van de microscoop naar de synchronisatiesoftware streamt. Vanuit de image viewer kan de machinist verschillende machine-vision ondersteunde bewerkingen uitvoeren, zoals Drift Correct en Focus Assist. Het biedt ook de mogelijkheid om tagafbeeldingen en beoordelingssessies toe te passen zonder de gegevensverzameling te verstoren. (B) Schermafbeelding van de beeldanalysesoftware die de locatie van de afbeeldingsweergavepoort, tijdlijn en het deelvenster Metagegevens en analyse markeert. De analysesoftware kan op elk moment tijdens een experiment worden geopend om de tot dat tijdstip verkregen afbeeldingen te bekijken met behulp van de knop Sessie controleren . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
1. Methode 1: Dosiskalibratie van de transmissie-elektronenmicroscoop voor TEM- en scanning-TEM (STEM)-beeldvormingsmodi
- Zet de picoammeter aan en laat deze minimaal 30 minuten opwarmen voordat u met een dosiskalibratie begint. Plaats de dosiskalibratiehouder in de TEM en sluit de kalibratiehouder aan op de picoammeter met behulp van de snelverbindingskabel.
- Open met de microscoop in TEM-modus de kolomkleppen en lokaliseer het fiduciale gat van 35 μm op de dosishouder (figuur 2). Start de MVS-softwaretoepassing en selecteer Dosis (kalibratieautomatisering) uit de experimentopties.
OPMERKING: De locatie van het fiduciale gat wordt na de eerste kalibratie door de software opgeslagen, zodat de software automatisch zijn positie kan bepalen voor toekomstige kalibraties. - Klik op het pictogram Verbinden (figuur 1A) en selecteer de microscoop om de verbinding tussen de TEM en de MVS-software te activeren. Eenmaal verbonden, zijn de beelden van de camera / detector zichtbaar in de beeldviewer van de software.
OPMERKING: Het is niet nodig om de eucentrische hoogte te optimaliseren en de rand van het fiduciale gat kan wazig lijken vanwege de dikte van de punt. Dit heeft geen invloed op de huidige metingen. - Navigeer naar het tabblad Dosis en vervolgens naar Dosiskalibratie. Selecteer Dose Area Calibration process (Kalibratieproces van het dosisgebied), volg de aanwijzingen van de software en voer de gevraagde door de gebruiker configureerbare waarden in (zoals de diafragma- en monochromatorinstellingen). Nadat de kalibratie van het dosisgebied is voltooid, selecteert u het proces voor de kalibratie van de dosisstroom en volgt u de softwareaanwijzingen.
- Herhaal het kalibratieproces (stap 1.4) voor elke spotgrootte, diafragma of monochromatorinstelling die tijdens het experiment kan worden gebruikt.
- Wanneer het kalibratieproces voor de TEM-modus is voltooid, kalibreert u de elektronendosis voor de STEM-modus door stap 1.4 te herhalen.
OPMERKING: Voor de STEM-modus hoeft de kalibratie van het dosisgebied niet te worden uitgevoerd. - Wanneer alle gewenste kalibraties zijn voltooid, klikt u op Sessie sluiten, verwijdert u de dosiskalibratiehouder en keert u terug naar het startscherm van de MVS-software.
2. Methode 2: Bepaling van de dosisdrempel met behulp van de MVS- en dosissoftware
- Laad een standaard TEM-rooster met een monster (in de handel verkrijgbare ZSM-5 zeoliet-nanodeeltjes werden in dit voorbeeld gebruikt) in een standaard TEM-houder. Plaats de houder in de TEM en zoek een interessant gebied (kristallijne zeoliet nanodeeltjes).
- Open de MVS-softwaretoepassing en selecteer Overige.
OPMERKING: Aanvullende informatie over het monster (bijv. monsteridentificatie en -beschrijving, de naam van de operator en experimentnotities) kan worden toegevoegd aan het veld met experimentele parameters. - Herhaal stap 1.3 om verbinding te maken met de MVS-software en navigeer naar het tabblad metagegevens van afbeeldingen in de MVS-software-interface om de volgende metagegevens te selecteren die u wilt overlayen op de beeldstroom die op de live weergave wordt weergegeven: Vergroting, Maximale dosis en Dosistempo. Andere metagegevens kunnen worden opgenomen als de gebruiker dat wenst. Een screenshot van de MVS-software-interface met de dosisbeheersingsregelaars is te vinden in Aanvullend Bestand 1.
- Open het tabblad Dosis en selecteer Dosisbeheer en Dosisbewaking inschakelen om geautomatiseerde elektronendosistracking te activeren. Selecteer Dosislaag weergeven om de dosiskleuroverlay weer te geven.
- Stel de waarden in voor het hoge dosisniveau en het hoge dosistempo en druk op Opslaan (in dit voorbeeld werden waarden van respectievelijk 60.000 e-/Å 2 en 500 e-/Å2·s gebruikt).
- Navigeer naar het tabblad Instellingen, selecteer Dosis en stel de waarden voor de dekking van de dosisnavigatiekaart Dekking en Dosis afbeeldingsoverlay in (in dit voorbeeld werden waarden van respectievelijk 0,50 en 0,30 gebruikt).
- Activeer in het venster Live Image Viewer driftcorrectie door op Drift Correct te klikken.
- Navigeer naar het tabblad Gegevensweergave en plot de metagegevenswaarden Onscherpte en Focusquotiënt op de Y-as.
OPMERKING: Alle beschikbare metagegevenswaarden kunnen tijdens het experiment in realtime worden uitgezet vanuit de tabel met gegevensweergaven. - Activeer Focus Assist en selecteer vervolgens Focus kalibreren om de geautomatiseerde kalibratie van de focusassistent uit te voeren. Zodra de routine Focus kalibreren is voltooid, sluit u het tabblad Gegevensweergave .
- Open het tabblad Beeldanalyse in de MVS-software en activeer de opties Live FFT en Quadrants 1 &; 2 .
- Gebruik de softwarebesturingen van de microscoop om de bundelcondities aan te passen zodat de elektronenflux ~ 500 e-/Å2·s. is en ga naar een nieuw gebied in het monster en centreer de ROI van het monster in de liveweergave van de MVS-software.
OPMERKING: Bij het maken van grote podiumbewegingen worden driftcontrole en focusassistent automatisch gedeactiveerd en moeten ze opnieuw worden ingeschakeld zodra de nieuwe ROI is geselecteerd. - Noteer de dosiscondities in de software met behulp van de tagfunctie . Markeer het tagpictogram en voer de gewenste tekst in om een specifieke reeks afbeeldingen binnen de tijdlijn aan te geven. Afbeeldingen worden getagd met deze tekst totdat het tagpictogram is uitgeschakeld.
- Handhaaf een constant dosistempo terwijl u continu dezelfde ROI in beeld brengt totdat de pieken die overeenkomen met de atomaire structuur in de FFT-plot zijn verdwenen.
- Verlaag de vergroting, open het tabblad Dosisbeheer en activeer Doseerlaag weergeven om een kleurgecodeerde dosiskaart te bedekken.
OPMERKING: Deze functie biedt een visuele referentie van de gebieden van het monster die zijn blootgesteld aan de elektronenbundel en hun relatieve dosisblootstelling. Door deze gebieden in afzonderlijke afbeeldingen met de cursor te markeren, worden hun respectieve dosiswaarden aangegeven. - Verbreek de verbinding en beëindig de sessie door Verbinding maken uit te schakelen en vervolgens Sessie sluiten te selecteren. Sla een kopie van de sessiegegevens op in een externe bron om te voorkomen dat de gegevens die zijn opgeslagen in de MVS-software worden overschreven tijdens volgende experimenten (aanvullend bestand 2).
3. Methode 3: Metadata en trendanalyse en gegevensexport met behulp van de analysesoftware
- Start de analysesoftware (de offline software voor het bekijken van de volledig gesynchroniseerde gegevenssets) en open het experimentsessiebestand door het te selecteren in de bestandsbibliotheek.
OPMERKING: Gebruikers hebben tijdens een experiment ook toegang tot de analysesoftware via het pictogram Beoordelingssessie in de MVS-software. - Geef de driftgecorrigeerde afbeeldingen weer door het tabblad DC onder de Image View Port te activeren en selecteer de gewenste gegevensoverlays door hun respectievelijke overlaygegevensvakken aan te vinken op het tabblad Metagegevens van afbeeldingen (in dit voorbeeld werden microscoop, datum/tijd, dosissnelheid, maximale dosis en vergroting gebruikt). Andere metagegevens kunnen naar wens van de gebruiker worden uitgezet.
- Vink het selectievakje Tijdlijn aan voor Maximale dosis en dosissnelheid om een grafische plot van deze waarden aan de tijdlijn toe te voegen. Markeer of blader door deze grafische plots om de afbeelding bij te werken die in de viewport wordt weergegeven. Krijg toegang tot een verscheidenheid aan hulpprogramma's via de tabbladen Notities, Beeldanalyse, Werkset en Gegevensweergave .
- Open de FFT voor elke afbeelding via het tabblad Beeldanalyse en klik op Live FFT om de FFT bij te werken terwijl u door afbeeldingen scrolt.
- Gebruik het vervagen van de FFT-pieken om het tijdstip te bepalen waarop de zeolietstructuur kristalliniteit verliest. Noteer de maximale dosiswaarde die met die afbeelding is geregistreerd.
- Gebruik de optie Filter om grote gegevenssets eenvoudig te filteren in kleinere, deelbare gegevenssets zonder de bijbehorende metagegevens te verliezen. Open het filterpaneel en pas de schuifregelaars zo aan dat alleen gegevens met een dosistempo gelijk aan of hoger dan ~500 e-/Å2·s worden geselecteerd en sla de nieuwe verzameling op onder de naam Dose Threshold Study.
OPMERKING: Filters kunnen worden toegepast voor elk van de bijbehorende metagegevenstypen. - Exporteer de afbeeldingen en metagegevens van de sessie naar andere bestandstypen die zijn verrijkt met schaalbalken en metagegevensoverlays.
- Markeer de verzameling in het bibliotheekvenster en selecteer Publiceren door met de rechtermuisknop op de selectie te klikken. Selecteer in het venster Publiceren de gewenste opties voor de export van het bestandstype.
- Selecteer het tabblad met voor drift gecorrigeerde gegevens en pas overlays toe van alle gewenste metagegevens en de FFT (positioneer de FFT-overlay naar wens; voorbeelden van afbeeldingen die met de FFT zijn geëxporteerd, worden weergegeven in figuur 3).
- Exporteer de afbeeldingsreeks als een filmbestand met dezelfde optie Publiceren . Selecteer de afbeeldingen door ze in de tijdlijn te markeren, de filteropties te gebruiken of het volledige databasebestand te exporteren. Selecteer de gewenste filmindeling, framesnelheid en bestandslocatie. Een filmpje van het zeolietafbraakexperiment verkregen met behulp van een 200 kV TEM is opgenomen in aanvullend dossier 3.
- Exporteer de metagegevens afzonderlijk van de verkregen afbeeldingen als een CSV-bestand door de optie Metagegevens (CSV) te selecteren tijdens het publiceren.
OPMERKING: Raw- en driftgecorrigeerde afbeeldingen worden geëxporteerd als afzonderlijke CSV's (Aanvullend bestand 4 en Aanvullend bestand 5).
4. Methode 4: In situ verwarmingsonderzoek van goud op ijzeroxide nanodeeltjes
- Dropcast een nanokatalysator (Au/FeOx) gesuspendeerd in ethanol op een in situ heater E-chip, een mico-elektrochmechanische (MEM) monsterondersteuning, en laat deze aan de lucht drogen. Monteer het monster in de in-situ verwarmingshouder, plaats de houder met het monster in de TEM en sluit de houder met de meegeleverde kabel aan op de voeding. Zoek een voorbeeld van een ROI met behulp van de TEM-besturingselementen.
OPMERKING: Dit experiment gebruikte een verwarmingshouder die volledig is geïntegreerd met de MVS-software, waardoor temperatuurmetagegevens kunnen worden ingebed in de afbeeldingen. - Selecteer de juiste workflowoptie in de MVS-software (in dit voorbeeld is de Fusion Workflow gebruikt, maar andere verwarmingshouders van de fabrikant kunnen worden gebruikt door Overige te selecteren).
- Volg de workflow-aanwijzingen om de elektrische verbinding tussen de houder en de verwarmings-E-chip te bevestigen door het kalibratiebestand te laden en een apparaatcontrole uit te voeren.
- Sluit de microscoop aan op de MVS-software, zoals eerder getoond in stap 2.3-2.10 (in dit voorbeeld zijn de metadatawaarden voor dosistempo, maximale dosis, matchcorrelatie, driftsnelheid en kanaal A-temperatuur geselecteerd) en centreer de ROI van het monster in het gezichtsveld.
- Open het tabblad Fusion AX en stel een temperatuur in en pas deze toe.
- Klik op de knop Kanaal A instellen om de instellingen voor temperatuurregeling te openen. Selecteer de temperatuurfunctie en de handmatige bedieningsmodus.
- Klik op de knop Experimenteren om toegang te krijgen tot de experimentele besturingselementen. Stel de hellingsnelheid in op 10 °C/s en het doel op 600 °C. Klik op Toepassen om het experiment te starten.
OPMERKING: Het experiment kan op elk gewenst moment worden gepauzeerd of gestopt met behulp van de knoppen voor snelle toegang in de rechterbenedenhoek van de MVS-software, zonder het tabblad Fusion AX te openen. - Nadat de ingestelde temperatuur van 600 °C is bereikt, opent u het tabblad Fusion AX en selecteert u Experimenteren. Wijzig de hellingsnelheid in 2 °C en het doel in 800 °C. Klik op Toepassen om het experiment te starten.
OPMERKING: De procedure voor het aanbrengen van een oprit is afhankelijk van het gebruikte verwarmingssysteem ter plaatse . De hierboven gemarkeerde stappen om de temperatuurstijging toe te passen, zijn van toepassing op het systeem dat in dit voorbeeld wordt gebruikt. - Markeer gebeurtenissen of nuttige punten tijdens het experiment met behulp van de tagfunctie, zoals weergegeven in stap 2.10. Ga verder met het afbeelden van het monster en pas het temperatuurprofiel naar wens aan. Wanneer u klaar bent, klikt u op Sessie beëindigen en slaat u het gegevensbestand op met behulp van de analysesoftware (een deel van het databasebestand dat in de representatieve resultaten wordt besproken, wordt geleverd als aanvullend bestand 6).
- Open de analysesoftware om de sessie te bekijken. Plot de temperatuur, sjabloon morphing factor, dosistempo en cumulatieve dosis in de tijdlijn. Exporteer afbeeldingen en films naar wens met behulp van de stappen die worden beschreven in stap 3.6 en 3.7. Afbeeldingen en films kunnen worden geëxporteerd met of zonder de overlays van de dosistoewijzing (figuur 4).
Representative Results
Dit werk benadrukt het nut van data-acquisitie met behulp van MVS-software voor TEM-beeldvorming en in situ-experimenten. Microscoopuitlijning en conditie-instelling werden uitgevoerd en geselecteerd via de standaardbesturingselementen van de TEM-fabrikant. Na de eerste installatie werden de protocollen die in dit videoartikel worden gepresenteerd, uitgevoerd via de MVS-software. Een TEM van 300 kV werd gebruikt voor alle experimenten in het videoprotocol en representatieve gegevens, met uitzondering van de vergelijkingszeolietgegevens die werden verkregen met behulp van een 200 kV koude FEG (figuur 3D-F en tabel 1). Alle metadata werden automatisch verzameld en afgestemd op de respectievelijke afbeeldingen door de MVS-software.
Na het starten van de software en het selecteren van de juiste workflow in het menu, wordt een verbinding met de microscoop tot stand gebracht door de knop Verbinden in de werkbalk helemaal links van de afbeeldingsviewer te activeren, zoals weergegeven in figuur 1A. Wanneer de knop Verbinden is gemarkeerd, worden afbeeldingen en bijbehorende metagegevens van de microscoop automatisch naar de MVS-software gestreamd en weergegeven in het beeldweergavevenster. Deze afbeeldingen en de bijbehorende metagegevens worden chronologisch opgeslagen in een tijdlijn die kan worden geopend, beoordeeld en geanalyseerd zonder de opname van nieuwe gegevens in de tijdlijn te onderbreken (figuur 1B). Streaming kan op elk moment door de gebruiker worden onderbroken door het pictogram Verbinden te deactiveren.
Zodra de verbinding is geactiveerd, zijn andere workflows toegankelijk die afhankelijk zijn van het MVS-softwareframework. In de voorbeelden in dit videoprotocol moet een dosiskalibratie worden uitgevoerd voordat de andere functies van de MVS-software worden gebruikt. Dosiskalibratie is een geautomatiseerd proces dat wordt aangestuurd door de MVS-software; het maakt gebruik van een speciale Faraday cupdosiskalibratiehouder om de stroom en het gebied van de bundel te meten voor de combinatie van parameters. De kopkalibratiehouder van Faraday, weergegeven in figuur 2, wordt aangesloten op een externe picoammeter, die de straalstroom nauwkeurig meet. Eenmaal in de microscoop geplaatst, wordt het fiduciale uitlijningsgat gecentreerd en worden de gewenste te kalibreren bundelcondities (spotgroottes, diafragma's en vergrotingen) in de software ingevoerd. De software voert een reeks kalibratiestappen uit voor elke combinatie van de geselecteerde omstandigheden. Tijdens de dosiskalibratie beweegt de houder automatisch tussen de geïntegreerde Faraday-stroomafnemerbeker en het doorgaande gat. De huidige meting voor elke combinatie van lenscondities wordt gemeten op de Faraday cup door de picoammeter. Vervolgens vertaalt de software het podium om de balk in het door-gat te centreren en wordt het straalgebied bepaald door middel van machine-vision-algoritmen. Deze reeks metingen bouwt een profiel op van de relatie tussen de intensiteit / helderheid en het bundeloppervlak. Hierdoor kan de software het bundelgebied extrapoleren als de intensiteits- / helderheidsinstelling tijdens een experiment wordt aangepast, ongeacht het gezichtsveld. Waarden voor cumulatieve dosis en dosistempo worden berekend met behulp van deze bundelstroom- en bundeloppervlakmetingen en er wordt een dosiskalibratiebestand gegenereerd. Dit proces definieert in wezen een dosis "vingerafdruk" voor de TEM en de individuele lenscondities. Zodra de dosis is gekalibreerd voor de TEM, kan de gebruiker normaal werken en de vergroting en intensiteit vrij aanpassen zonder verlies van dosisinformatie of handmatige notities17. Nadat de kalibratie is voltooid, wordt de dosiskalibratiehouder verwijderd, zodat het monster normaal kan worden ingebracht. Het kalibratieproces voor zowel de TEM- als de STEM-modus duurt normaal gesproken minder dan 10 minuten.
Na het kalibreren van de dosiscondities werd een commercieel gekocht zeoliet nanodeeltje (ZSM-5) monster in beeld gebracht onder omstandigheden met een hoog dosistempo om de drempel (cumulatieve) dosis te bepalen waarbij het monster te beschadigd is om structurele informatie te verstrekken. De ZSM-5 nanodeeltjes werden gesuspendeerd in ethanol en dropcast op een conventioneel koperen TEM-rooster. Ze werden continu in beeld gebracht bij 300 kV in TEM-modus met een spotgrootte van 3 en een condensoropening van 100 μm. Het dosistempo dat door de MVS-software werd afgelezen onder omstandigheden met een hoog dosistempo was 519 e-/Å2·s. Nanodeeltjes in het gezichtsveld werden continu in beeld gebracht totdat de pieken in de FFT verdwenen, wat wijst op degradatie van de kristallijne structuur, zoals weergegeven in figuur 3A-C en aanvullend bestand 3. Overlays (die kunnen worden toegevoegd tijdens een live experiment of daarna in de analysesoftware) werden toegepast op de TEM-afbeeldingen om de datum en tijd, het dosistempo, de maximale (cumulatieve) dosis en de vergroting weer te geven. Het dosistempo werd constant gehouden tijdens experimenten, waarbij de cumulatieve dosis (maximale dosis) toenam als functie van de tijd. De FFT-pieken begonnen te verdwijnen na 42 s continue beeldvorming (figuur 3B). Bij 1 min en 20 s en een cumulatieve dosis van ~60.000 e-/Å2 waren de FFT-pieken volledig verdwenen (figuur 3C).
Om aan te tonen dat deze kalibratiemethode kwantitatieve dosismetingen genereert die kunnen worden toegepast op andere microscopen die onder verschillende instellingen werken, werd hetzelfde kalibratieproces en zeolietafbraakexperiment uitgevoerd met behulp van een 200 kV cold field emission gun (FEG) TEM en een spotgrootte van 1. Deze microscoop werd gekalibreerd volgens dezelfde procedure als beschreven in methode 1 en hetzelfde experiment dat in methode 2 werd beschreven, werd uitgevoerd met behulp van de nieuwe spotgrootte en diafragma-instellingen. De bundelinstellingen werden zo aangepast dat het verschil in het toegepaste dosistempo tussen de twee experimenten verwaarloosbaar was (499 e-/Å 2·s vs. 519 e-/Å2·s). Zoals weergegeven in figuur 3D-F en samengevat in tabel 1, verdwijnen de FFT-vlekken volledig na 1 min en 50 s continue beeldvorming en een cumulatieve dosis van 58.230 e-/Å 2, wat overeenkomt met de waarden die in het eerste experiment zijn verkregen.
Een voorbeeld van hoe de MVS-software kan profiteren van in situ experimenten werd getoond door een verwarmingsexperiment uit te voeren. Een representatief nanokatalysatormonster, Au/FeOx (gesynthetiseerd volgens een gepubliceerde procedure19), werd geselecteerd als voorbeeldsysteem omdat het dynamische morfologische en structurele veranderingen ondergaat bij hoge temperaturen. Deze door temperatuur geïnduceerde mobiliteit maakt het een uitdaging om de ROI gecentreerd te houden binnen het gezichtsveld vanwege de eigen beweging van het monster en de thermische uitzetting van het monster zelf tijdens temperatuurveranderingen18. Met de functies Drift Correct en Focus Assist ingeschakeld, werd het monster afgebeeld over een periode van ~ 30 s bij 800 °C. Bij verhoogde temperaturen migreerden de gouden nanodeeltjes in de Au/FeOx langs het oppervlak van de ijzeroxidesteun en sinterden om grotere deeltjes te vormen, zoals weergegeven in figuur 4 en als een film in aanvullend bestand 7. Figuur 5 toont een reeks TEM-snapshots (figuur 5A-F) van een poreus gebied binnen een Au/FeOx nanokatalysator, geregistreerd op verschillende tijdstippen (figuur 5G) tijdens een in situ verwarmingsexperiment. De gecoördineerde driftwaarde van de ROI werd automatisch berekend door de software. De gecoördineerde drift- en temperatuurwaarden van de beelden in de loop van de serie worden grafisch weergegeven in figuur 5G. Zoals verwacht, neemt de gecoördineerde drift van het monster toe naarmate het temperatuurprofiel toeneemt, van een snelheid van ~ 9 nm / min tot ~ 62 nm / min, en begint af te nemen in de richting van afvlakking naarmate de temperatuur constant wordt gehouden. Ondanks deze hoge snelheid van drift en veranderingen in de morfologie van het monster, worden beelden met een hoge resolutie gemakkelijk verkregen tijdens temperatuurverhoging, waardoor beweging binnen het poreuze gebied wordt onthuld, zoals weergegeven in aanvullend bestand 8. Raadpleeg Aanvullend bestand 9 voor downloadinstructies en computerspecificaties.
Figuur 2: Kalibratie en tracking van de elektronendosis . (A) De dosis wordt gekalibreerd met behulp van een speciale monsterhouder die een stroomafnemer bevat die op het monstervlak is geplaatst voor bundelstroommetingen. (B) Illustratie van de kenmerken van het tipontwerp: Links: Faraday-kop; Midden: fiduciaal gat; Rechts: doorgaand gat (C). De toegepaste elektronendosis kan in de software worden gevisualiseerd met behulp van kleurgecodeerde kaarten om verschillende dosisblootstellingen in een afbeelding aan te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Door elektronendosis geïnduceerde afbraak van zeoliet (ZSM-5) nanodeeltjes. (A-C) Momentopnamen genomen over een periode van 1 min en 20 s met afbraakgegevens verkregen met een FEG van 300 kV en een gemeten dosissnelheid van 519 e-/Å2·s; het zeoliet degradeert binnen 1 min en 20 s. (D-E) Snapshots genomen over een periode van 1 min en 50 s met degradatiegegevens verkregen met een 200 kV koude FEG TEM en een elektronendosissnelheid van 499 e-/Å2·s; de inzetstukken laten zien dat de FFT-spot in de loop van de tijd vervaagt. De schaalbalk is 60 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: AXON-synchroniciteit past machine-vision-algoritmen toe om dynamisch evoluerende monsters te volgen en te stabiliseren. Metagegevens die tijdens het experiment worden gegenereerd, kunnen langs de tijdlijn worden uitgezet, zodat de gebruiker snel een afbeelding kan koppelen aan de bijbehorende metagegevens terwijl ze door de afbeeldingsreeksen bladeren die tijdens het experiment zijn gegenereerd. (A-H) Beelden van een nanokatalysatormonster (Au/FeOx) bij 800 °C geregistreerd over een periode van 28 s, zowel met (A-D) als zonder (E-H) de dosiskaartoverlay. Rode gebieden in de overlay geven gebieden aan met een hoge cumulatieve dosisblootstelling en gele gebieden geven gebieden met een lagere blootstelling aan. Als u een afzonderlijke pixel markeert, wordt de cumulatieve dosis voor die pixel aangegeven. Witte pijlen in panelen E-H geven twee deeltjes aan die tijdens het experiment samensmelten en de oranje pijl geeft de baan van een bewegend gouddeeltje aan. (I) De experimenttijdlijn gegenereerd door de analysesoftware voor de beeldreeksen weergegeven in A-H. De oranje stippen boven aan de tijdlijn geven onbewerkte (niet-digitaal gecorrigeerde) afbeeldingen aan en de blauwe stippen geven driftgecorrigeerde afbeeldingen aan. De oranje verticale balken geven de punten op de tijdlijn aan die overeenkomen met de getoonde afbeeldingen panelen A-H. De schaalbalk is 40 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: TEM snapshots van een poreus gebied binnen een Au/FeOx nanokatalysator op verschillende tijdstippen. De MVS-software stabiliseert en centreert het monster, zelfs tijdens hoge driftsnelheden, zoals die optreden tijdens een temperatuurstijging door de toepassing van fase-, bundelverschuivings- en digitale correcties, zoals aangegeven door machine-vision-algoritmen. (A-F) TEM snapshots van een poreus gebied binnen een Au/FeOx nanokatalysator, vastgelegd op verschillende (G) tijdstippen tijdens een in situ verwarmingsexperiment. De driftsnelheid van de ROI wordt automatisch berekend en geregistreerd tijdens een experiment door de MVS-software. Zoals uitgezet in (G), als het temperatuurprofiel wordt gewijzigd (de blauwe lijn), neemt de driftsnelheid (oranje lijn) toe naarmate de temperatuur stijgt en afneemt naarmate de temperatuur constant wordt gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Microscoop Type | 300 kV FEG TEM | 200 kV Koude FEG TEM |
| Spot Grootte/Condensor 2 Diafragma | 3/100 μm | 1/100 μm |
| Dosistempo | 519 e-/A2•s1 | 499 e-/A2•s1 |
| Verlies van structuur gemeten met FFT (Geaccumuleerde dosis) |
60.270 e-/A2 | 58.230 e-/A2 |
Tabel 1: Beknopte vergelijking van de resultaten van de afbraak van zeoliet verkregen uit verschillende microscopen.
Aanvullend bestand 1: Screenshot van de MVS-software-interface met het tabblad dosisbeheer geopend. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: MVS-softwaredatabasebestand van het door bundels geïnduceerde zeolietafbraakexperiment. Deze kijk-/analysesoftware is gratis te downloaden. Zie Aanvullend bestand 9 voor downloadinstructies en computerspecificaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: Film van de door de bundel geïnduceerde zeolietafbraak. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 4: CSV-bestand 1 (zeolietafbraak: ruwe gegevens [alleen mechanische correctie]) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 5: CSV-bestand (zeolietafbraak: driftgecorrigeerd [mechanisch + digitale correctie]) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 6: MVS software database bestand nanokatalysator in situ verwarmingsexperiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 7: Film van de nanokatalysator bij 800 °C met dosisoverlays. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 8: Film van de nanokatalysator tijdens een temperatuurstijging met gecoördineerde driftwaarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 9: Instructies voor het downloaden van de gratis analysesoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De interpretatie van TEM-experimentele resultaten is vaak afhankelijk van vele onderling verbonden experimentele parameters, zoals microscoopinstellingen, beeldvormingsomstandigheden en in het geval van operando- of in situ-experimenten, veranderingen in de omgeving of stimuli 1,23. Nauwkeurige analyse van grote TEM-datasets, waarover deze parameters voortdurend kunnen worden gewijzigd, vereist aanzienlijke aandacht van de operator om elke voorwaarde en instelling voor elke afbeelding nauwkeurig vast te leggen in een laboratoriumjournaal of een andere externe documentatiebron. Naarmate TEM-datasets groter en complexer worden, wordt handmatige archivering onbeheersbaar en kan belangrijke informatie worden gemist of onnauwkeurig worden vastgelegd. De hier beschreven MVS-software consolideert de metadata die tijdens een experiment worden gegenereerd door de microscoop, de detector / camera en andere systemen (zoals in situ monsterhouders) en stemt ze uit op hun respectieve afbeeldingen.
Naast metadataconsolidatie past de software machine-vision-algoritmen toe om het gezichtsveld te volgen en te stabiliseren door een combinatie van ruimtelijke, straal- en digitale correcties met behulp van de Drift Correct - en Focus Assist-functies . Wanneer de Drift Correct-functie is ingeschakeld, wordt een cross-correlatie 'sjabloon'-afbeelding gegenereerd met behulp van de eerste afbeelding die in de MVS-software wordt getrokken. De sjabloon wordt vervolgens vergeleken met binnenkomende afbeeldingen om de richting en grootte van de monsterdrift of -beweging te berekenen. Met deze informatie past de MVS-software automatisch de nodige correcties toe om de beeldfuncties op dezelfde plaats te houden door ten minste een van de drie parameters aan te passen: podiumlocatie, bundel- of beeldverschuiving en digitale beeldcorrectie. De Focus Assist-functie maakt gebruik van een combinatie van algoritmen om een focuswaarde toe te wijzen, de focusscore aan elke afbeelding genoemd, en die scores worden vergeleken om de grootte en richting van de onscherpte-aanpassing te bepalen die moet worden toegepast om het monster scherp te houden. In de STEM-beeldvormingsmodus probeert de MVS-software het contrast te maximaliseren door middel van een eigen versie van genormaliseerde variantie om de focusscore toe te wijzen. In de TEM-modus wordt een radiale som van de intensiteit berekend in de FFT en gebruikt om de focusscore te berekenen. Beperkingen aan het vermogen van de MVS-software om de focus te optimaliseren, treden op wanneer deze de juiste focusscore voor een afbeelding niet nauwkeurig kan berekenen. Dit gebeurt meestal wanneer de microscoop verkeerd is uitgelijnd of het monster tijdens de kalibratie aanzienlijk onscherp is, waardoor de software de juiste waarde voor de startfocusscore niet correct kan berekenen. De MVS-software kan moeite hebben met het berekenen van de focusscore voor monsters met goed gedefinieerde roosterranden, omdat de roosterranden in de FFT het focusscorealgoritme kunnen 'overweldigen'; Als een steekproef dus onscherp wordt, geeft de focusscore mogelijk niet nauwkeurig de verandering in focus weer. Omgekeerd kan het werken met lage vergrotingen of met een monster met een laag FFT-signaal het ook een uitdaging maken om een goede focusscore te berekenen. Om deze problemen te verminderen, bevat de MVS-software een aantal extra algoritmen die door de gebruiker kunnen worden geselecteerd voor het berekenen van de focusscore als de standaardinstellingen niet geschikt zijn voor de steekproef. Deze moeten van geval tot geval worden getest en toegepast om de beste algoritmen voor een bepaald experiment te bepalen.
Morfologische veranderingen in de steekproefstructuur in de loop van de tijd worden verantwoord met behulp van een sjabloonmorfingsfactor. Dit filter is instelbaar door de operator, zodat registratie-algoritmen rekening houden met morfologische veranderingen in de loop van de tijd. Bovendien bewaakt de software het continue beeld, de microscoopinstellingen en de camera- of detectorinstellingen om de sjabloon automatisch bij te werken wanneer deze wordt geactiveerd door wijzigingen in de monsterstructuur en na door de operator veroorzaakte wijzigingen in de parameters van de microscoop, camera of detector. Zoals weergegeven in figuur 4, figuur 5, aanvullend bestand 7 en aanvullend bestand 8, biedt de MVS-software effectieve, onmiddellijke stabilisatie, waardoor beeldvorming met hoge resolutie van dynamisch bewegende of veranderende monsters mogelijk is. Hoewel de software in staat is om zeer hoge driftsnelheden of monsterbewegingen te regelen, zoals die optreden bij het toepassen van een verwarmingshelling tijdens een in situ experiment, zijn er beperkingen aan de maximale fasecorrecties of bundelverschuivingen die de software kan regelen als het monster beweegt of zeer snel drijft. Deze limiet is een functie van de beeldupdatesnelheid, de grootte van het gezichtsveld en de driftsnelheid. Voor een bepaald gezichtsveld en beeldupdatesnelheid is er een maximale driftsnelheid die kan worden gecorrigeerd, en als de fysieke bewegingen het niet kunnen bijhouden, kan het proces eindigen of onstabiel worden. Uit de registratiesjablonen die worden gegenereerd wanneer functies zoals Drift Correct worden toegepast, kunnen extra berekende metagegevens worden gegenereerd. Matchcorrelatie is bijvoorbeeld een numerieke registratie van de mate van verandering tussen sjablonen in een reeks en wordt gebruikt om punten in een experimentele tijdlijn te identificeren waarin de steekproef is gewijzigd. Een hoge matchcorrelatiewaarde komt overeen met een steekproef die veranderingen in zijn morfologie heeft ondergaan, en een lage matchcorrelatiewaarde komt overeen met een steekproef waarvan de structuur relatief statisch blijft. Matchcorrelatie is met name waardevol voor in situ studies omdat het grafisch kan worden uitgezet, waardoor de gebruiker snel afbeeldingen in de reeks kan lokaliseren die overeenkomen met significante steekproefverandering. Het is echter belangrijk om te begrijpen dat correlatiewaarden met een hoge overeenkomst ook kunnen overeenkomen met veranderingen in beeldvormingsomstandigheden, zoals het verplaatsen van het podium of het wijzigen van de vergroting, als deze acties worden uitgevoerd terwijl de driftcorrectiefunctie actief blijft.
De hier gepresenteerde kalibratieworkflow maakt gebruik van een unieke kalibratiehouder en een semi-geautomatiseerde kalibratieroutine om de bundel nauwkeurig te kalibreren onder verschillende lensomstandigheden met minimale tussenkomst van de operator. De dosiskalibratieroutine is toegankelijk via de MVS-software die op de TEM is geïnstalleerd. De MVS-software leest automatisch de relevante microscoopinstellingen om alle metingen op te slaan als referentie voor latere experimenten. Op sommige TEM's is het niet mogelijk om de diafragma- of monochromatorinstellingen te lezen en deze moeten door de operator tijdens kalibraties en tijdens gebruik in de MVS-software-instellingen worden ingevoerd. Er zijn herinneringen ingebouwd in de software om deze operatorinvoerinstellingen up-to-date te houden door de programmaprompts te volgen. De ontwikkeling van een houder met een ingebouwde stroomcollector, in plaats van te vertrouwen op een houder die elders in de microscoopkolom is geïntegreerd, is een bewuste ontwerpkeuze. Hierdoor kan de stroomcollector op hetzelfde vlak als een monster worden geplaatst, waardoor fouten in de stroommeting worden geëlimineerd die worden veroorzaakt door bundelafbuiging of verschillen in de absorptie van elektronen door openingen op verschillende bundelposities. De MVS-software volgt een geautomatiseerde routine om de straalstroom en het gebied te meten voor elke combinatie van lensomstandigheden. De software kan deze gemeten kalibraties vervolgens correleren met de camera- of schermstroom en eventuele veranderingen in vergroting enz. extrapoleren naar het straalgebied tijdens het experiment. Eenmaal gegenereerd, kunnen deze kalibratiebestanden onmiddellijk worden gebruikt en worden ze automatisch opgeslagen voor later gebruik als de software dezelfde instellingen detecteert die tijdens een toekomstige sessie worden gebruikt. Hoewel de levensduur van het kalibratiebestand varieert van microscoop tot microscoop, hebben de auteurs ontdekt dat ze dezelfde kalibratiebestanden gedurende enkele maanden kunnen gebruiken zonder substantiële veranderingen in de huidige waarden waar te nemen. Er zijn ingebouwde routines die het emissieprofiel van pistolen bewaken om deze kalibraties relevant te houden, vooral op koude FEG-emissiepistolen.
Normalisatie van dosismetingen tussen microscopen en geautomatiseerde tracking van de blootstelling van een monster aan de bundel zijn kritieke functies van de MVS-software, omdat ze kwantitatieve vergelijkingen van dosiscondities tussen experimenten op verschillende microscoopsystemen mogelijk maken. Dosisgeïnduceerde afbraak van een zeolietmonster (ZSM-5), verkregen tijdens identieke experimenten met verschillende microscopen, resulteert in volledige verdwijning van de FFT-vlekken na een maximale cumulatieve of drempel-elektronendosis (~ 60.000 e-/Å 2 bij toepassing van een dosistempo van ~ 500 e-/Å2·s) voor beide opstellingen. Deze vergelijkende resultaten tonen aan dat de dosissoftware reproduceerbare, kwantitatieve dosismetingen mogelijk maakt. Het kleine verschil in de cumulatieve dosis waarbij volledige FFT-spotverdwijning voor elk experiment wordt waargenomen, is waarschijnlijk een gevolg van de verschillende versnellingsspanningen die door de twee microscopen worden gebruikt, met lagere versnellingsspanningen die resulteren in meer stralingsschadepaden en hogere versnellingsspanningen die doorgaans resulteren in meer knock-on schade24. Literatuurresultaten voor de kritische dosis ZSM-5 nanodeeltjes variëren van 9.000-14.000 e-/Å2 met behulp van de eerste FFT-vlekverdwijningen, in plaats van de volledige verdwijning van alle FFT-vlekken 25,26. In onze resultaten komt de eerste FFT-spotverdwijning overeen met een cumulatieve dosis van ongeveer 25.000 e-/Å2. Eerdere studies waren gebaseerd op stroommetingen verkregen met behulp van een fosforscherm, dat goed gedocumenteerd is om bundelstroommetingen te onderschatten in vergelijking met een Faraday cup15. De vastgestelde kritische dosis kan met een factor twee of meer variëren, afhankelijk van welke FFT-piek wordt gebruikt om de dosis te volgen. Dit geeft aan dat de hogere ruimtelijke frequenties eerst degraderen en kunnen resulteren in verschillende waarden, afhankelijk van de zonetoegang die tijdens de metingen wordt gebruikt (onze resultaten waren gericht op FFT-vlekken van het hele zeolietkristal, in plaats van specifieke structurele kenmerken)25,26. Deze verschillen in technieken en huidige kalibratie verklaren het verschil in waarden tussen de twee experimenten die in onze resultaten en eerdere literatuurstudies zijn gerapporteerd.
Hoewel de interacties tussen elektronen een belangrijke factor zijn in veel TEM-experimenten, zijn in situ en specifiek vloeistof-EM-studies bijzonder gevoelig voor de effecten ervan. Radiolyse van vloeistoffen door de elektronenbundel resulteert in een cascade van chemisch reactieve soorten die kunnen interageren met het monster, wat de analyse bemoeilijkt. Zowel het dosistempo of de fluentie die tijdens een vloeistof-EM-experiment wordt gebruikt als de cumulatieve dosis kunnen van invloed zijn op de concentratie van radicale soorten die worden gegenereerd als gevolg van vloeibare radiolyse27,28. Het verzamelen en registreren van zowel cumulatieve dosis- als dosissnelheidsmetagegevens gedurende een experiment maakt dus een directe correlatie mogelijk tussen afbeeldingen en de dosisgeschiedenis van een monster, en is een nauwkeurigere manier om de impact van de elektronenbundel in deze experimenten op te helderen en te beheersen. Hoewel niet behandeld in dit protocol, wordt een voorbeeld van het nut van de dosisbeheersingskenmerken voor vloeistof-EM weergegeven in figuur 6.
Figuur 6: Bundel-geïnduceerde groei van gouden nanodeeltjes tijdens een in situ vloeistof-EM experiment. (A) Low-magnification STEM overzicht van de resulterende deeltjesgroei met een kleuroverlay van de cumulatieve dosiskaart in het hele gebied. Rode gebieden in de overlay geven gebieden aan met een hoge cumulatieve dosisblootstelling en gele gebieden geven gebieden met een lagere blootstelling aan. Als u een afzonderlijke pixel met de cursor markeert of een vak over een gebied tekent met de meegeleverde tekengereedschappen, wordt de cumulatieve dosis voor die pixel of dat gebied aangegeven. De schaalbalk is 2 μm. (B,C) Hogere vergroting STEM-afbeeldingen van de gebieden die worden aangegeven door de oranje vakken (b,c) in A. Gebied b, blootgesteld aan een hogere cumulatieve dosis (10,811 e-/Å 2) bevat grotere deeltjes dan die in gebied c, dat werd blootgesteld aan een lagere cumulatieve dosis (0,032 e-/Å2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het verrijkte dosistempo en de cumulatieve dosismetagegevens vereenvoudigen de analyse van dosisafhankelijke groei- en afbraakroutes van nanomaterialen. Figuur 6 toont de bundel-geïnduceerde reductie van een oplossing van goud auric chloride (HAuCl3) ionen in water tijdens vloeistof-EM experimenten. Uit de kleurdosiskaartoverlay in figuur 6A is het gemakkelijk om te visualiseren dat de cumulatieve elektronendosis de resulterende grootte en vorm van de nanodeeltjes 29,30,31,32 beïnvloedt. Het STEM-overzicht met lage vergroting toont regio's die zijn blootgesteld aan een hoge (rode) en lage (gele) cumulatieve dosis. De deeltjes in het gebied dat wordt blootgesteld aan hogere doses zijn groter dan die in de regio's die worden blootgesteld aan lagere cumulatieve doses. Omdat de dosismetagegevens direct in elke afbeelding op pixelniveau zijn ingebed, kunnen de complexe effecten van elektronendosis in vloeistof-EM-experimenten nu systematisch worden geanalyseerd op een manier die nooit eerder haalbaar was.
In dit protocol hebben we aangetoond dat MVS-software een uitgebreide oplossing biedt voor het kalibreren, bewaken en volgen van zowel de elektronendosis als de totale dosis die pixel voor pixel aan een monster wordt geleverd. Dit vermogen ontsluit een nieuw paradigma voor het afbeelden van dosisgevoelige monsters en het begrijpen van de elektronenbundelinteracties. Het is vooral opwindend voor vloeistof-EM-experimenten, omdat het een effectievere ondervraging mogelijk maakt van de rol die de elektronendosis speelt en de experimentele reproduceerbaarheid verbetert. Het is onze hoop dat dit nieuwe kader de nauwkeurige verzameling van dosistempo en geaccumuleerde dosisinformatie mogelijk zal maken, het delen van deze gegevens met de gemeenschap zal vergemakkelijken voor een nauwkeurigere interpretatie van TEM-resultaten en wetenschappelijke samenwerking en gegevensuitwisseling zal bevorderen door FAIR-hoofdrapportage en -analyse mogelijk te maken.
Disclosures
Alle auteurs zijn medewerkers van Protochips, Inc.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in de Analytical Instrumentation Facility (AIF) aan de North Carolina State University, die wordt ondersteund door de staat North Carolina en de National Science Foundation (awardnummer ECCS-2025064). De AIF is lid van het North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), een site in de National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). De auteurs willen Damien Alloyeau, CNRS Research Director aan de Universiteit Paris Cité, bedanken voor het verstrekken van de 200 kV CFEG zeoliet dosisdrempel studieresultaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARM200F CFEG | JEOL | Transmission Electron Microscope (200 kV) | |
| AXON DOSE Calibration Holder | Protochips, Inc. | AXA-FC-TFS | Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM |
| AXON DOSE Software: Version 10.6.5.3 | Protochips, Inc. | AX-MOD-DOSE-01-1YR | Dose calibration and management software |
| AXON Studio Software: Version 10.6.5.3 | Protochips, Inc. | No Part Number. Available to download at success.protochips.com |
Offline analysis software for AXON datasets. A free copy of the AXON Studio software is available for down load at: success.protochips.com |
| AXON Synchronicity Core | Protochips, Inc. | AXON-CORE | Hardware component of the synchronization software. |
| AXON Synchronicity Software: Version 10.6.5.3 | Protochips, Inc. | AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR | Synchronization software |
| Fusion In-Situ Heating E-chip | Protochips, Inc. | E-FHDC-VO-10 | Sample Support E-chip with carbon film. Used with in situ heating system |
| Fusion Select In Situ Heating System | Protochips, Inc. | FFAD-6200-EXP | In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM. |
| Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790 | Sigma Aldrich | 27988-77-8 | Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst. Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998) |
| Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3) | Sigma Aldrich | 1309-37-1 | Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst. Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998) |
| Titan ChemiSTEM | ThermoFisher Scientific | Transmission Electron Microscope (300 kV) | |
| Zeolite ZSM-5 | Zeolyst | CBV 8014 | Nanocatalyst sample: 80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio |
References
- Thomas, J. M., Leary, R. K., Eggeman, A. S., Midgley, P. A. The rapidly changing face of electron microscopy. Chemical Physics Letters. 631, 103-113 (2015).
- Spurgeon, S. R., et al. Towards data-driven next-generation transmission electron microscopy. Nature Materials. 20 (3), 274-279 (2021).
- Gai, P. L., Boyes, E. D. In situ visualisation and analysis of dynamic single atom processes in heterogeneous catalysts. Journal of Materials Chemistry A. 10 (11), 5850-5862 (2022).
- Zheng, H., Lu, X., He, K. In situ transmission electron microscopy and artificial intelligence enabled data analytics for energy materials. Journal of Energy Chemistry. 68, 454-493 (2022).
- Topsøe, H. Developments in operando studies and in situ characterization of heterogeneous catalysts. Journal of Catalysis. 216 (1), 155-164 (2003).
- Wilkinson, M. D., et al. The FAIR Guiding Principles for scientific data management and stewardship. Scientific Data. 3 (1), 160018 (2016).
- FAIR Principles. Go Fair. , Available from: https://www.go-fair.org/fair-principles/ (2023).
- Draxl, C., Scheffler, M. NOMAD: The FAIR concept for big data-driven materials science. MRS Bulletin. 43 (9), 676-682 (2018).
- Kelly, D. F., et al. Liquid-EM goes viral-visualizing structure and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 75, 102426 (2022).
- AXON Studio Software Download. Protochips, Inc. , Available from: https://success.protochips.com/s/?language=en_US (2023).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
- Grubb, D. T. Radiation damage and electron microscopy of organic polymers. Journal of Materials Science. 9 (10), 1715-1736 (1974).
- Buban, J. P., Ramasse, Q., Gipson, B., Browning, N. D., Stahlberg, H. High-resolution low-dose scanning transmission electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 103-112 (2010).
- Chen, Q., et al. Imaging beam-sensitive materials by electron microscopy. Advanced Materials. 32 (16), 1907619 (2020).
- Krause, F. F., et al. Precise measurement of the electron beam current in a TEM. Ultramicroscopy. 223, 113221 (2021).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Damiano, J., et al. AXON dose: A solution for measuring and managing electron dose in the TEM. Microscopy Today. 30 (4), 22-25 (2022).
- Allard, L. F., Flytzani-Stephanopoulos, M., Overbury, S. H. Behavior of Au species in Au/Fe2O3 catalysts characterized by novel in situ heating techniques and aberration-corrected STEM imaging. Microscopy and Microanalysis. 16 (4), 375-385 (2010).
- Sze, C., Gulari, E., Demczyk, B. G. Structure of coprecipitated gold-iron oxide catalyst materials. Materials Letters. 36 (1-4), 11-16 (1998).
- DiCecco, L. A., et al. Advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856 (2022).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Scheutz, G. M., et al. Probing thermoresponsive polymerization-induced self-assembly with variable-temperature liquid-cell transmission electron microscopy. Matter. 4 (2), 722-736 (2020).
- Howe, J. Y., Allard, L. F., Bigelow, W. C., Demers, H., Overbury, S. H. Understanding catalyst behavior during in situ heating through simultaneous secondary and transmitted electron imaging. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 614 (2014).
- Egerton, R. F. Mechanisms of radiation damage in beam-sensitive specimens, for TEM accelerating voltages between 10 and 300 kV. Microscopy Research and Technique. 75 (11), 1550-1556 (2012).
- Yoshida, K., Sasaki, Y. Optimal accelerating voltage for HRTEM imaging of zeolite. Microscopy. 62 (3), 369-375 (2013).
- Yoshida, K., Sasaki, Y., Kurata, H. High-resolution imaging of zeolite with aberration-corrected transmission electron microscopy. AIP Advances. 3 (4), 042113 (2013).
- Lee, J., Nicholls, D., Browning, N. D., Mehdi, B. L. Controlling radiolysis chemistry on the nanoscale in liquid cell scanning transmission electron microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 23 (33), 17766-17773 (2021).
- Schneider, N. M., et al. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
- Fritsch, B., et al. Radiolysis-driven evolution of gold nanostructures - model verification by scale bridging in situ liquid-phase transmission electron microscopy and x-ray diffraction. Advanced Science. 9 (25), e2202803 (2022).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
- Ahmad, N., Le Bouar, Y., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Growth of dendritic nanostructures by liquid-cell transmission electron microscopy: a reflection of the electron-irradiation history. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 9 (2016).
- Zhang, Y., Keller, D., Rossell, M. D., Erni, R. Formation of Au nanoparticles in liquid cell transmission electron microscopy: From a systematic study to engineered nanostructures. Chemistry of Materials. 29 (24), 10518-10525 (2017).
