Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל cryoinjury כדי לגרום נזק עמוק של כמה מיומרים caudal בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מספקת גישה חדשה לחקר התחדשות שרירי השלד לאחר אובדן חמור של רקמה אצל בעלי חוליות שאינם יונקים.
Abstract
שרירי השלד עוברים התחדשות ושיקום לאחר פציעה קלה באמצעות הפעלת תאי גזע דמויי לוויין. פציעות חמורות של השרירים לעיתים קרובות להוביל פיברוזיס בבני אדם. בהשוואה ליונקים, לדגי זברה יש יכולת מולדת גבוהה יותר להתחדשות איברים, מה שמספק מודל רב עוצמה לחקר שיקום רקמות לאחר נזק נרחב לאיבר. כאן, מודל cryoinjury מתואר כגורם נזק עמוק לארבעה מיומרים של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים. קריופרוב בהתאמה אישית תוכנן כך שיתאים לצורת הגוף ויפצע באופן בלתי ניתן לשחזור את השרירים הרוחביים מהעור לקו האמצע. חשוב לציין כי שלמות הגוף נותרה ללא פגע, והדגים המשיכו בפעילות השחייה שלהם. שינויים בשרירי השלד הוערכו על ידי צביעה היסטולוגית וצביעה פלואורסצנטית של חלבונים סרקומריים על חלקי רקמות. שיטה זו תפתח כיווני מחקר חדשים שמטרתם להבין כיצד ניוון שריר השלד גורם לתגובות מתקנות ובכך להפעלה מחדש של התוכנית המיוגנית בדגי זברה בוגרים.
Introduction
אצל בעלי חוליות, חלקים פגועים של רקמות שונות עוברים התחדשות ושיקום הומיאוסטטיים במהלך החיים. יכולת זו להתחדשות ושיקום תלויה בדרך כלל בנוכחות תאי גזע מוכשרים או ביכולת ההתרבות של התאים הבוגרים 1,2. שרירי השלד מורכבים ממיוסיבים פוסט-מיטוטיים, הקשורים לתאי גזע מקומיים, הנקראים תאי לוויין 3,4,5,6. לפיכך, רקמה זו מכילה מקורות סלולריים לאיטום יעיל של אזורים של רצף קטוע או לתיקון פצעים קלים. עם זאת, הפסדים נפחיים גדולים יותר בשרירי השלד של יונקים מלווים לעתים קרובות בתיקון לא רגנרטיבי, כגון פיברוזיס7. מודלים של בעלי חיים יכולים לספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים הביולוגיים המקדמים התחדשות של איברים שניזוקו באופן נרחב.
דג הזברה הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב עם יכולת התחדשות גבוהה. דגי זברה בוגרים יכולים לחדש חלק קטוע של הסנפיר הקאודלי שלהם או את הקודקוד המנותח של חדר הלב 8,9,10,11. בנוסף, שיטת cryoinjury יושמה בעבר לחקר סנפיר והתחדשות לב בדגי זברה12,13,14,15. במקרה של איברים פנימיים, לשיטת cryoinjury יש את היתרון של גרימת מוות תאי מבלי לשבש את שלמות האיברים, ובכך לחקות תנאים פיזיולוגיים16,17. פסולת רקמות מתפרקת על ידי פינוי טבעי במהלך ריפוי הפצע, ואחריו תהליכי תיקון. עם זאת, עדיין לא ברור אם ניתן ליישם שיטה זו על שרירי השלד.
בדגים, השרירים הרוחביים מאפשרים כיפוף מצד לצד של החדק במהלך שחייה18. שרירי השלד מאורגנים ביחידות מטמריות, הנקראות מיומרים, המופרדות על ידי רקמת חיבור 5,19. דגי זברה יכולים לחדש את שריריהם לאחר הפרעות קלות ברקמות, כגון אלה הנגרמות על ידי אבלציה בלייזר או פצע דקירה 20,21,22,23,24, אך עדיין לא ידוע אם מיומרים שלמים יכולים להתחדש לאחר פציעה נרחבת. פער הידע הזה נובע כנראה מהיעדר מודל פגיעה מתאים. פרוטוקול זה קובע גישה חדשה לגרימת פציעה נרחבת של שריר השלד, המשתרעת על פני מספר מיומרים. שיטת cryoinjury המתוארת מבוססת על הקפאה והפשרה מהירה של myofibers עם מכשיר נירוסטה מקורר מראש. למרות הנזק הרב, רווחתם של הדגים לא נפגעה קשות. מיומרים שלמים יכולים להיות משוחזרים, ולכן עבודה זו מספקת מערכת מודל חדשה לחקר מנגנוני התחדשות השרירים בדגי זברה בוגרים.
Protocol
מחקר זה נערך בהתאם לכל כללי האתיקה הרלוונטיים. דגי הזברה גודלו וגודלו ותוחזקו בהתאם להנחיות הפדרציה האירופית למדעי חיות מעבדה (FELASA)25. שיכון בעלי החיים וכל הליכי הניסוי אושרו על ידי המשרד הווטרינרי הקנטונלי של פריבורג, שוויץ.
1. ציוד והתקנה
- לארגן את הייצור של cryoprobe נירוסטה בסדנה טכנית שיכולה לייצר מכשירים למחקר.
הערה: ספק עיצוב של המכשיר עם המידות הספציפיות (איור 1A). - כדי למנוע כוויות קור בעת הטיפול בבדיקה במהלך ההליך, הכנס את הידית לקצה פיפטה ועטוף אותה בנייר דבק.
- הכינו לתמיסת העבודה בהרדמה, כף לטיפול בדגים, ספוג לח ומיכל עם מי מערכת כדי לאפשר לדגים להתאושש לאחר ההליך.
- הכינו את פתרון העבודה טרי לפני כל ניסוי. כדי להכין את פתרון העבודה, הוסף 4 מ"ל של תמיסת מלאי טריקאין ל -100 מ"ל של מי מערכת בכד.
הערה: תמיסת מלאי ההרדמה מורכבת מ-4 גרם טריקאין מומס ב-980 מ"ל מים מזוקקים. לאחר התאמת ה- pH ל- 7 עם 1 M Tris-HCl, pH 9, מלא את התמיסה ל- 1 L במים מזוקקים. תמיסת המלאי רגישה לאור ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C בבקבוק ענבר.
2. הליך cryoinjury שרירים
- התחל את ההליך על ידי טבילת הבדיקה בחנקן נוזלי למשך 3 דקות לפחות. הרטיבו את הספוג במי המערכת והניחו אותו על משטח שטוח.
- העבירו דג זברה בוגר אחד לתמיסת העבודה של הטריקאין, ואשרו את חוסר התגובה שלו על ידי נגיעה עדינה בדג עם הכפית לאחר דקה או 2 דקות. אם הדג עדיין תגובתי, חכו עוד קצת.
- הניחו את הדג המרדים על הספוג הרטוב. אתר את הפדונקל הקאודלי אחורי לסנפיר פי הטבעת וקדמי לסנפיר הקאודלי.
- הסר את cryoprobe מן החנקן הנוזלי. נערו את הגשושית בעדינות כדי לוודא שלא נותרו שאריות חנקן נוזלי בקצה.
- הניחו את קצה המרית בניצב לגוף על הפדונקל הקאודלי (איור 1C). שמרו על הגשושית במצב הזה במשך 6 שניות בלי להפעיל לחץ (איור 1D).
הערה: משקל ההקפאה מספיק כדי להבטיח מגע בין המכשיר לרקמה. - שחרר את cryoprobe מן הרקמה, ולהעביר את הדגים לתוך המיכל עם מי המערכת.
- יש לעקוב אחר הדג בזמן שהוא חוזר לנשום ולשחות לאחר שהתעורר מההרדמה. אם תנועות אופרקולריות אינן מתרחשות לאחר 30 שניות, עוררו את הדג על ידי הזרמת מים לתוך הזימים עד שבעל החיים מתחיל נשימה בעצמו.
הערה: על הדג לחזור לשחות תוך מספר דקות במיכל ההתאוששות.
הערה: בימים שלאחר מכן, ניתן לצלם את הדגים כדי לעקוב אחר פעילות השחייה שלהם (וידאו 1 ווידאו 2). לפני הקלטת הווידאו, העבירו את הבקר והדגים הפצועים למיכל הזדווגות שקוף, ותנו להם להתרגל לפחות דקה אחת.
3. איסוף פדונקל קאודלי וקיבוע
- הכינו 2 מ"ל של 4% פורמלין או קיבוע אחר המתאים לבדיקות הבאות, צלחת פטרי, מלקחיים ומספריים כירורגיים.
- יש להרדים את הדג בנקודת זמן נבחרת לאחר ההקפאה בהתאם להיתר החוקי שניתן על ידי המשרד הווטרינרי האזורי.
הערה: המתת חסד מבוצעת על ידי מנת יתר של תמיסת טריקאין (300 מ"ג / ליטר) במשך כ -10 דקות. אובדן תנועת הזימים ורפלקס צביטת סנפיר הזנב מאשר את המוות. יש לבחור את נקודות הזמן של המתת חסד בהתאם לשלב ההתחדשות: לדוגמה, מ 1 יום לאחר cryoinjury (dpci) ל 3 dpci עבור פינוי הפצע; מ 3 DPCI ל 10 DPCI עבור ייזום התחדשות שרירים; מ 10 DPCI ל 30 DPCI עבור התחדשות מתקדמת; ואחרי 30 DPCI להשלמת שיקום רקמות. לכן, כדי להעריך את השלבים השונים ואת התהליכים הביולוגיים של ניוון שרירים והתחדשות, קבוצות של דגים צריך להיות מאומת בנקודות זמן שונות לאחר cryoinjury. - הניחו את הדג שעבר המתת חסד בצלוחית פטרי המכילה מים שעברו דה-יוניזציה. השתמשו במספריים כדי לבצע חתך דרך הגוף הקדמי והאחורי לפדונקל הקאודלי (איור 1E). תנו לרקמה לדמם החוצה במים נטולי היונונים של צלחת הפטרי.
- לאסוף את peduncle קאודלי, ולהעביר אותו עם מלקחיים לתוך פתרון קיבוע מוכן בצינור microcentrifuge.
הערה: הפוך בזהירות את הצינורות מספר פעמים, ושמור אותם למשך הלילה ב 4 ° C.
4. הרכבת הפדונקל הקאודלי
- שטפו את הרקמה הקבועה ב-1x PBS למשך 10 דקות על נדנדה. לאחר מכן, להעביר אותו לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מקורר מראש 30% סוכרוז במים deionized ב 4 ° C, בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים. השאר את צינורות microcentrifuge לפחות 24 שעות ב 4 °C במצב זקוף.
הערה: הפדונקל הקאודלי יצוף על גבי תמיסת הסוכרוז ויתחיל לשקוע כאשר הרקמה מתייבשת. - ממלאים תבנית הטבעה בשכבה 5 מ"מ של אמצעי הרכבה O.C.T. השתמש במלקחיים כדי להתאים את הפדונקל הקאודלי בתווך. הניחו אותו בתחתית התבנית, והתאימו את כיוונו לחתכים רוחביים או קורונליים (איור 1F).
- תן למדיום להקפיא בקופסת קרח יבש. ברגע שהרקמה מיוצבת במיקום הרצוי, ממלאים את שאר התבנית לפני שה- OCT קופא לחלוטין. אחסנו את התבנית למשך שעה לפחות בטמפרטורה של -80°C.
הערה: בתנאים אלה, ניתן לאחסן את הרקמות במשך חודשים רבים.
5. חיתוך החלקים עם cryostat
- הגדר cryostat עם עובי חיתוך של 25 מיקרומטר. כוונן את טמפרטורת התא ל-26°C-, את טמפרטורת הדגימה ל-24°C ואת זווית החיתוך ל-12°.
- מניחים את הגוש הקפוא עם הדגימה בהקפאה, וקובעים את כיוונו על מנת לחתוך במקביל לתחתית הבלוק. גזור עד שתגיע לדגימה, ולאחר מכן חתוך את הבלוק כדי להקל על איסוף הדגימה.
- הכינו שש שקופיות הדבקה. תייג את השקופיות במספרים עוקבים כדי להכין עותקים משוכפלים של הדגימה.
- התחל לחתוך, ואסוף את קטעי הרקמה בשקופיות ההדבקה המסומנות. סדרו את הקטעים בשקופיות בהתאם לדרישות הניסוי הנוספות.
- הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אחסנו אותם בקופסאות סגורות בטמפרטורה של -20°C.
הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בבטחה במצב זה למשך עד שנה אחת.
Representative Results
ניטור של הדג לאחר cryoinjury
כדי לקבוע את ההשפעה של cryoinjury myomere על בעלי חיים, הקלטת וידאו של שליטה דגים cryoinjury ב 1 ימים לאחר cryoinjury (dpci) ו 5 dpci בוצע. כל קבוצה הכילה חמישה דגים. ב-1 dpci, הדגים הקרופידיים שחו פחות באופן פעיל, אך הם לא הציגו תנועות חריגות, כגון הסתחררות, פיתול או שיווי משקל מופחת (וידאו 1). במערכת הגידול, מיקומם במיכל ובצריכת המזון היה דומה לזה של הדגים שלא נפגעו. ההתנהגות הרגילה נמשכה לאורך כל הימים הבאים, כפי שהודגם בסרטון ב- 5 dpci (סרטון 2). לסיכום, הליך cryoinjury של peduncle caudal לא השפיע קשות על רווחתם של בעלי החיים.
ניתוח היסטולוגי של קטעי הפדונקל הקאודלי
כדי להעריך את היקף הפציעה, נבחרה נקודת הזמן של 4 dpci, שכן זה כאשר פסולת מיופייבר נספגה לחלוטין בפצע. כדי לנתח את ההשפעות של קריו-פציעה לאורך הצירים הגב-גחוני והקדמי-אחורי של הגוף, השתמשו בשתי קבוצות דגים (כלומר, חלקים קורונליים ורוחביים של הפדונקל הקאודלי, בהתאמה) (איור 1F).
הקטעים נותחו על ידי צביעת טריכרום המורכבת מכחול אנילין, חומצה פוקסין ותפוז G (AFOG). באמצעות שילוב זה של ריאגנטים, שרירים שלמים הוצגו בכתום, חוט השדרה באדום כהה, ומטריצת הקולגן בכחול. כדי לקבוע את מספר המיאומרים הפגועים, שהם היחידות המטמריות של שרירי הדגים, נותחה סדרה של מקטעים (איור 2). גבולות מיומרים, הנקראים מיוקומטה, זוהו על ידי שקיעת קולגן, כפי שזוהה על ידי צבע כחול. האזורים הפגועים נקבעו על ידי היעדר כתמים כתומים. בחינה מדוקדקת יותר של דגימות עם מיוקומטות ניכרות גילתה כי כארבעה מיומרים רצופים ניזוקו, כפי שהוסק מהיעדר כתמים כתומים (n, מספר דגים = 4; איור 3א,א'). הצד הלא פצוע של אותו דג שימש כנקודת ייחוס פנימית.
כדי לבחון את עומק הפצע בניצב לציר הגוף, הוכנו חתכים רוחביים באמצעות דגי זברה בעוצמה של 4 dpci ו-7 dpci. נקודת הזמן האחרונה תואמת את ההפעלה של התוכנית המיוגנית, ובכך, את תחילת התחדשות השרירים. צביעת AFOG של הדגימות האלה הראתה מחסור נרחב בכתמים כתומים באגף הקפואה של הגוף, התוחם את האזור של שרירי השלד המנוונים (איור 3B,C). ב 4 dpci ו 7 dpci, אזור הפצע השתרע רקמות מן העור לכיוון המחיצה האנכית. זה מדגים כי שיטת cryoinjury התמקדה עמוק חצי צדדי אחד של peduncle caudal, אשר נשאר ללא שריר פונקציונלי במשך 7 ימים לאחר ההליך. יחד, ארבעה מיומרים ניזוקו עמוקות בצד אחד של הפדונקל הקאודלי.
ניתוח immunofluorescence של החלקים הרוחביים
כדי להעריך את הדינמיקה של התחדשות שרירים, קבוצות ניסוי של דגים הומתו ב 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci, ו 30 dpci. החלקים הרוחביים של הפדונקל הקאודלי סומנו על ידי צביעה פלואורסצנטית צבעונית באמצעות פאלואדין (שנקשר לאקטין נימה [F-actin]), נוגדן טרופומיוזין-1, המזהה חלבון סרקומרה, ו- DAPI, המסמן גרעינים. בכל נקודות הזמן, המחצית הלא נפגעת של הגוף סיפקה בקרה פנימית; גם F-actin וגם Tropomyosin 1 זוהו בחוזקה בחלקי הבקרה שלא נפגעו, מה שמצביע על רקמה שלא ניזוקה (איור 4).
ב-4 dpci, הצד הפגוע של הפדונקל הקאודלי הכיל שפע של תאים חיוביים ל-DAPI, אולם נצפו מעט מאוד F-אקטין וטרופומיוזין 1 אימונופלואורסצנטיים, מה שמצביע על אזור הפצע עם שרירים מנוונים (איור 4A-B'). ב-7 dpci, טרופומיוזין 1 ו-F-אקטין יכולים להיות מזוהים בחלק של הפצע קרוב לקו האמצע האנכי של הגוף (איור 4C-D'). דפוס ביטוי זה תוחם את המיקום שבו מתחילה היווצרות של מיופייברים חדשים בפדונקל הקאודלי. ב-10 dpci, שני סמני השרירים התרחבו לכיוון פני השטח של הגוף, מה שמרמז על התחדשות מתקדמת של שריר השלד (איור 4E-F'). ב-30 dpci, שני צידי הגוף הראו התפלגות דומה של צביעת F-אקטין (איור 4G-H'). ממצא זה מצביע על כך ששריר השלד שוקם ביעילות לאחר הקפאת הפדונקל הקאודלי.
איור 1: התקנה ניסיונית עבור myomere cryoinjury. (A) מידות ה-cryoprobe המיוצר בהתאמה אישית עשוי מפלדת אל-חלד. החלק הדיסטלי של המכשיר מורכב מרית עם קצה קעור בעומק של 1 מ"מ כדי להסביר את העקמומיות של גוף דג הזברה. החלק האמצעי של הכלי כולל גליל המתפקד כמשקולת ומאגר לשמירה על הטמפרטורה הנמוכה של המרית במהלך ההליך. הקצה הפרוקסימלי של המכשיר הוא בצורת ידית מתכת דקה. (ב,ג) דג בוגר מורדם על ספוג לח עם cryoprobe על peduncle קאודלי. הגשושית הייתה בטמפרטורת החדר. (B) שולי הגשושית ממוקמים אופקית בקרבת הפדונקל הקאודלי כדי להציג את הגודל היחסי בין הדג לכלי. (C) עבור cryoinjury, קצה הכלי ממוקם בניצב לדג. (D) המחשה סכמטית של הליך ההקפאה מהצד הגחוני של הדג כדי להראות את המניפולציות באופן מקיף. הקריופרוב היה מקורר מראש בחנקן נוזלי והונח מיד בצד אחד של הדג למשך 6 שניות. (E) בנקודת זמן מסוימת לאחר הקפאה, הדגים הומתו והפדונקלים הקאודליים שלהם נאספו לקיבוע. (F) החומר הקבוע עובד באופן היסטולוגי ונחתך לאורך מישור העטרה או המישור הרוחבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח היסטולוגי של מיומרים פגומים בפדונקל הקאודלי מהמיקום הגבי ועד למצב הגחוני של הגוף. צביעת AFOG של סדרה של חתכים קורונליים ב 4 ימים לאחר cryoinjury (dpci). החתכים הם מהגבי לכיוון הצד הגחוני, כפי שמצוין בחלק העליון של הלוח הראשון והאחרון. הקטעים אינם סמוכים, עם מרווח של כ -150 מיקרומטר ביניהם. השריר שלא נפגע מזוהה על ידי צביעה כתומה של השריר, ואילו הרקמה הפגועה חסרה את הכתם הזה ונראית אפרפרה (אזור מוקף בקו מקווקו). רקמות המכילות קולגן, כגון העור, מוכתמות בכחול. חוט השדרה מופיע כמבנה דמוי מוט ומוכתם באדום. מספר הדגים, n = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת עומק הפגיעה בפדונקל הקאודלי באמצעות צביעת AFOG. (א,א') החלק העטרתי נמצא בגובה חוט השדרה (מוט אופקי מוכתם באדום). התמונה התחתונה מציגה אזור מוגדל המוקף במסגרת בתמונה העליונה. גבולות המיומרים הרציפים מופיעים כפסים קולגנים (כחולים) הממוקמים באלכסון לחוט השדרה (חיצים אדומים בתמונה המוגדלת A'). (ב,ג) חתכי הרוחב מציגים את האגף שלא נפגע עם שרירים מוכתמים בכתום ואת האגף הקפואה עם כתמים אפרפרים. האזור הפגוע מוקף בקו מקווקו שחור. המחיצה האנכית (המתוארת בקו מקווקו אדום) מחלקת את הגוף לצדדי הבקרה וההקפאה. מספר הדגים, n = 4 לנקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי אימונופלואורסצנטי של חלבוני שריר לאחר קריופציעה. צביעה פלואורסצנטית של חתכי רוחב ב- 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci ו- 30 dpci, כפי שמסומן בצד שמאל ובחלק העליון של הלוחות (A-B'). ב 4 dpci, הרקמה הפגועה (מוקפת בקו מקווקו) היא DAPI חיובי (כחול) אך ללא צביעת פלואדין (ירוק) או Tropomyosin-1 immunoreactivity (אדום), מה שמרמז על ניוון של סיבי השריר לאחר cryoinjury. (ג-ד') ב 7 dpci, שני סמני שריר מופיעים בהדרגה באזור הפגוע, המציין את תהליך ההתחדשות. Tropomyosin-1 נראה אינטנסיבי יותר מאשר F-actin בסיבים החדשים שנוצרו. (ה-ו') ב 10 dpci, אזור הפציעה מלא myofibers חדשים המציגים עוצמה גבוהה יותר של Tropomyosin-1 immunoreactivity בהשוואה F-actin. (ג-ח') ב 30 dpci, דפוס דומה של myofibers מזוהה בשני צידי הגוף. המסגרות בחלוניות A, C, E ו- H מקיפות את האזורים המוגדלים בתמונות הסמוכות מימין. קשקשים עוריים, הנובעים מפלואורסצנטיות מחוץ למיומר, נמחקו מהתמונות באמצעות Adobe Photoshop. מספר הדגים, n = 4 לנקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
דג הזברה מספק אורגניזם מודל של חולייתנים אנמניוטים לחקר מנגנוני התחדשות השרירים. רוב שיטות הפציעה הקיימות, כגון אבלציה בלייזר או פצע דקירה, גורמות להפרעה קלה יחסית ברקמה20,21,22,23. כריתות גדולות בוצעו בשריר חוץ-עיני26. עם זאת, גישה כירורגית זו תהיה כנראה פחות מתאימה לשרירים הרוחביים בשל הסכנות הבריאותיות של חיתוך דופן הגוף. כדי להימנע מהליכים פולשניים כאלה, פרוטוקול זה מתאר צורה קלה יותר של פציעה, שבכל זאת גורמת נזק עמוק לפדונקל הקאודלי. גישה זו מסתמכת על מניפולציה שטחית המאפשרת מיקוד מדויק מאוד של כמה מיומרים בצד אחד של הגוף. נקודות החוזק של מודל cryoinjury טמונות ביכולת השחזור שלו וביכולתו לייצר ניוון שרירים נרחב; בהתבסס על חוזקות אלה, מודל זה מספק נתיב חדש לחקור כיצד הגוף מגיב לאובדן שרירים משמעותי.
היישום של קור קיצוני מוביל להלם תרמי, אשר הורס את קרום פלזמה אברונים ברקמת השריר מושפע27. כתוצאה מכך, שרירי השריר הפגועים עוברים מוות תאי "מקרי"28. כתוצאה מכך, הרקמה הפגועה יכולה להיספג מחדש על ידי מנגנונים טבעיים של פינוי פצעים. דגי זברה סובלים היטב את הליך ההקפאה, שכן שיעור ההישרדות במחקר זה היה כמעט 100%, בהתחשב בכך שהגשושית המקוררת מראש הייתה ממוקמת נכון על הגוף למשך הזמן המדויק. עם זאת, אם הפצע נרחב מדי (למשל, אם מופעל לחץ רב מדי או משך ההקפאה ארוך מדי), הדג עשוי להציג תנועות שחייה חריגות זמן קצר לאחר ההליך, ויש להרדים את בעל החיים כנקודת קצה אנושית. עבור מיני דגים אחרים, יש להתאים את זמן החשיפה לקריופרוב בהתאם לגודל הגוף.
לאחר הקפאה, הדגים יכולים לחדש את פעילות השחייה שלהם ללא כל תסמינים של תנועה חריגה. עם זאת, דגים קריו-פצועים שוחים פחות באופן דינמי מדגי ביקורת, מה שמצביע על כמה ליקויים קלים. יהיה צורך בכימות נוסף של התנהגות הדגים בנקודות זמן שונות לאחר הקפאה כדי לקבוע שינויים זמניים בביצועי השחייה.
ההשפעה של שיטת cryoinjury על רקמות אחרות שאינן שריר של peduncle caudal נשאר להבהיר. ברור ששכבת הגוף החיצונית ביותר (כלומר, העור) נפגעת מההליך. בהקשר זה, שיטת cryoinjury יכולה לספק אסטרטגיה חדשה לחקר ריפוי פצעים, התחדשות קנה מידה, ושחזור דפוס פיגמנטציה. יתר על כן, כלי הדם והעצבוב של המיאומרים יכולים להיות מושפעים גם על ידי cryoinjury, ונושאים אלה דורשים חקירה נוספת.
מודל cryoinjury שימש בעבר לחקר התחדשות הלב של דגי זברה13,14,15,29. שיטה זו הראתה כמה יתרונות בהשוואה לשיטת כריתת החדרים10 בשל שקיעת צלקת עשירה בקולגן, המחקה טוב יותר את תגובת הריפוי של אוטם בבני אדם30. למרבה הפלא, דגי זברה יכולים לחדש את ליבם לאחר פציעות קריו-מרובות31. באופן מעניין, cryoinjury יושם גם על סנפיר דג הזברה, וכתוצאה מכך תהליכים היסטוליטיים12. בניגוד לקטיעת הסנפיר הקלאסית, הגדם הקריופצוע הנותר מכיל שוליים מעוותים עם תערובת של חומר מת ותאים בריאים. מחקרים עם שני איברי דגי הזברה, הלב והסנפיר, חשפו את היכולת החזקה של דגי הזברה לשחזר את המרכיבים הפונקציונליים המקוריים שלהם גם לאחר נזק נרחב לרקמות. השאלה אם שריר השלד הפצוע בהקפאה מפעיל יחסי גומלין בין תהליכים מתקנים ורגנרטיביים מצדיקה מחקרים עתידיים.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לצימרמן על הטיפול בדגים, כמו גם לד"ר תומאס ביס, ד"ר קתרין פפפרלי ולאה גיגון על ייזום הפרויקט ותוצאותיהם הראשוניות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ, מענק מספר 310030_208170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
| Material/ Equipment | |||
| 35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
| Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
| Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Surgical scissors | Any | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Dyes and Antibodies | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
| Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
| Recipies/Solutions | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2.7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Orange G | Sigma | ||
| 1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
| 200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
References
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
- Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Tulenko, F. J., Currie, P. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. Cartner, S. C. , Academic Press. Cambridge, MA. 115-121 (2020).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Pfefferli, C., Jaźwińska, A.
- Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
- Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
- Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
- Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
- Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Kaliya-Perumal, A. -K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
- Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
- Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).
