Summary
Denne protokollen beskriver en kryoskademodell for å indusere dyp skade på flere kaudale myomerer hos voksne sebrafisker. Denne metoden gir en ny tilnærming for å studere skjelettmuskulaturregenerering etter alvorlig tap av vev hos virveldyr som ikke er pattedyr.
Abstract
Skjelettmuskulatur gjennomgår fornyelse og restaurering etter mindre skade gjennom aktivering av satellittlignende stamceller. Alvorlige skader i muskulaturen fører ofte til fibrose hos mennesker. Sammenlignet med pattedyr har sebrafisk en høyere medfødt kapasitet for organregenerering, noe som gir en kraftig modell for å studere vevsrestaurering etter omfattende skade på organet. Her beskrives en kryoskademodell for å indusere dyp skade på fire myomerer av kaudal peduncle hos voksne sebrafisker. En skreddersydd kryoprobe ble designet for å passe til kroppsformen og reproduserbart skade den laterale muskulaturen fra huden til midtlinjen. Det er viktig at kroppsintegriteten forblir intakt, og fisken fortsatte sin svømmeaktivitet. Forandringer i skjelettmuskulaturen ble vurdert ved histologisk farging og fluorescensfarging av sarkomerproteiner på vevssnitt. Denne metoden vil åpne nye veier for forskning som tar sikte på å forstå hvordan degenerasjonen av skjelettmuskulaturen induserer reparative responser og dermed reaktivering av det myogene programmet hos voksne sebrafisker.
Introduction
Hos vertebrater gjennomgår skadede deler av forskjellige vev homeostatisk fornyelse og restaurering i løpet av levetiden. Denne kapasiteten til fornyelse og restaurering avhenger vanligvis av tilstedeværelsen av kompetente stamceller eller den proliferative kapasiteten til de modne cellene 1,2. Skjelettmuskulatur består av postmitotiske myofibre, som er assosiert med lokale stamceller, kalt satellittceller 3,4,5,6. Dermed inneholder dette vevet cellulære kilder for effektiv forsegling av områder med avbrutt kontinuitet eller for reparasjon av mindre sår. Imidlertid blir større volumetriske tap i pattedyrs skjelettmuskulatur ofte fulgt av ikke-regenerativ reparasjon, som fibrose7. Dyremodeller kan gi ny innsikt i de biologiske mekanismene som fremmer regenerering av omfattende skadede organer.
Sebrafisken er en veletablert modellorganisme med høy regenerativ kapasitet. Voksen sebrafisk kan regenerere en amputert del av halefinnen eller resektert apex av hjerteventrikkelen 8,9,10,11. I tillegg har en kryoskademetode tidligere blitt brukt for å studere finne- og hjerteregenerering hos sebrafisk12,13,14,15. Når det gjelder indre organer, har kryoskademetoden fordelen av å indusere celledød uten å forstyrre organets integritet, og dermed etterligne fysiologiske forhold16,17. Vevsavfall oppløses ved naturlig clearance under sårheling, etterfulgt av reparative prosesser. Men om denne metoden kan brukes på skjelettmuskulatur gjenstår å bli etablert.
Hos fisk gjør sidemuskulaturen det mulig å bøye stammen fra side til side under svømming18. Skjelettmuskulaturen er organisert i metamere enheter, kalt myomerer, som er adskilt av bindevev 5,19. Sebrafisk kan regenerere muskelen etter mindre vevsforstyrrelser, for eksempel de som er forårsaket av laserablasjon eller et stikksår 20,21,22,23,24, men om hele myomerer kan regenerere etter omfattende skade er fortsatt ukjent. Dette kunnskapshullet skyldes trolig mangel på en egnet skademodell. Denne protokollen etablerer en ny tilnærming for å indusere omfattende skade på skjelettmuskulaturen, som spenner over flere myomerer. Den beskrevne kryoskademetoden er basert på rask frysing og tining av myofibrene med et forkjølt rustfritt stålinstrument. Til tross for de omfattende skadene ble ikke fiskens trivsel alvorlig svekket. Hele myomerer kan gjenopprettes, og dermed gir dette arbeidet et nytt modellsystem for å studere mekanismene for muskulaturregenerering hos voksne sebrafisker.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i samsvar med alle relevante etiske forskrifter. Sebrafisken ble oppdrettet, oppdrettet og vedlikeholdt i samsvar med Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) retningslinjer25. Dyrehuset og alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av kantonveterinærkontoret i Fribourg, Sveits.
1. Utstyr og oppsett
- Ordne produksjon av en rustfritt stål kryoprobe i et teknisk verksted som kan produsere instrumenter for forskning.
MERK: Gi en utforming av instrumentet med de spesifikke dimensjonene (figur 1A). - For å unngå frostskader mens du håndterer sonden under prosedyren, sett håndtaket inn i en pipettespiss og pakk den inn med tape.
- Forbered et beger for anestesiløsningen, en skje for håndtering av fisken, en fuktig svamp og en tank med systemvann for å la fisken komme seg etter prosedyren.
- Forbered arbeidsløsningen på nytt før hvert eksperiment. For å forberede arbeidsløsningen, tilsett 4 ml Tricaine stamløsning til 100 ml systemvann i et begerglass.
MERK: Anestesiløsningen består av 4 g trikain oppløst i 980 ml destillert vann. Etter justering av pH til 7 med 1 M Tris-HCl, pH 9, fyll oppløsningen til 1 L med destillert vann. Stamoppløsningen er lysfølsom og bør oppbevares ved 4 °C i en gulbrun flaske.
2. Prosedyre for muskelkryoskade
- Begynn prosedyren ved å senke sonden i flytende nitrogen i minst 3 minutter. Fukt svampen i systemvann, og legg den på en flat overflate.
- Overfør en enkelt voksen sebrafisk til Tricaine-arbeidsløsningen, og bekreft dens manglende respons ved å berøre fisken forsiktig med skjeen etter 1 min eller 2 min. Hvis fisken fortsatt er reaktiv, vent litt lenger.
- Legg den bedøvede fisken på den våte svampen. Finn den kaudale peduncle bakre til analfinen og fremre for kaudalfinen.
- Fjern kryoproben fra flytende nitrogen. Rist sonden forsiktig for å sikre at det ikke er gjenværende flytende nitrogen igjen på spissen.
- Plasser kanten av slikkepotten vinkelrett på kroppen på den kaudale peduncle (figur 1C). Hold sonden i denne posisjonen i 6 s uten å påføre trykk (figur 1D).
MERK: Vekten av kryoproben er tilstrekkelig til å sikre kontakt mellom instrumentet og vevet. - Frigjør kryoproben fra vevet, og overfør fisken inn i tanken med systemvann.
- Overvåk fisken mens den gjenopptar pust og svømming etter å ha våknet opp fra anestesien. Hvis operasjonelle bevegelser ikke oppstår etter 30 s, stimuleres fisken ved å pipettere vann inn i gjellene til dyret starter respirasjonen av seg selv.
NOTAT: Fisken skal fortsette å svømme innen få minutter i oppvåkningstanken.
MERK: I de følgende dagene kan fisken filmes for å overvåke svømmeaktiviteten (Video 1 og Video 2). Før videoopptaket, overfør kontrollen og skadet fisk til en gjennomsiktig parringstank, og la dem habituate i minst 1 min.
3. Caudal peduncle samling og fiksering
- Forbered 2 ml 4% formalin eller annet fikseringsmiddel som er egnet for de påfølgende analysene, en petriskål, tang og kirurgisk saks.
- Avlive fisken på et valgt tidspunkt etter kryoskaden i henhold til lovlig tillatelse gitt av det regionale veterinærkontoret.
MERK: Eutanasi utføres ved en overdose trikainoppløsning (300 mg/l) i ca. 10 minutter. Tapet av gillbevegelse og halefinneklemmerefleksen bekrefter døden. Tidspunktene for eutanasi bør velges i henhold til fasen av regenerering: for eksempel fra 1 dag etter kryoskade (dpci) til 3 dpci for sårclearance; fra 3 DPCI til 10 DPCI for initiering av muskelregenerering; fra 10 DPCI til 30 DPCI for progressiv regenerering; og etter 30 DPCI for fullføring av vevsrestaurering. For å vurdere de forskjellige trinnene og biologiske prosessene for muskeldegenerasjon og regenerering, må grupper av fisk avlives på ulike tidspunkter etter kryoskade. - Legg den avlivede fisken i en petriskål som inneholder avionisert vann. Bruk saks til å utføre et kutt gjennom kroppen fremre og bakre til den kaudale peduncle (figur 1E). La vevet blø ut i det avioniserte vannet i petriskålen.
- Samle kaudal peduncle, og overfør den med tang til den tilberedte fikseringsløsningen i et mikrosentrifugerør.
MERK: Snu tubene forsiktig flere ganger, og hold dem over natten ved 4 °C.
4. Montering av caudal peduncle
- Vask det faste vevet i 1x PBS i 10 minutter på en vippe. Overfør den deretter til et 2 ml mikrosentrifugerør med forkjølt 30 % sukrose i avionisert vann ved 4 °C, og snu tuben forsiktig flere ganger. La mikrosentrifugerørene stå i minst 24 timer ved 4 °C i oppreist stilling.
MERK: Den kaudale peduncle vil flyte på toppen av sukroseoppløsningen og begynne å synke når vevet dehydrerer. - Fyll en innebyggingsform med et 5 mm lag med O.C.T.-monteringsmedium. Bruk tang for å justere caudal peduncle i mediet. Plasser den i bunnen av formen, og juster retningen for enten tverrgående eller koronale seksjoner (figur 1F).
- La mediet fryse i en boks med tørris. Så snart vevet er stabilisert i ønsket posisjon, fyll opp resten av formen før O.C.T. fryser helt til. Oppbevar formen i minst 1 time ved -80 °C.
MERK: Under disse forholdene kan vevet lagres i mange måneder.
5. Skjære seksjonene med en kryostat
- Sett opp en kryostat med en skjæretykkelse på 25 μm. Juster kammertemperaturen til -26 ° C, prøvetemperaturen til -24 ° C og skjærevinkelen til 12 °
- Plasser den frosne blokken med prøven i kryostaten, og fest retningen for å kutte parallelt med bunnen av blokken. Klipp til du kommer til prøven, og trim deretter blokken for å lette prøvesamlingen.
- Forbered seks adhesjonslysbilder. Merk lysbildene med fortløpende tall for å klargjøre replikater av prøven.
- Begynn å kutte, og samle vevsseksjonene på de merkede vedheftslysbildene. Ordne seksjonene på lysbildene i henhold til de videre eksperimentelle kravene.
- La lysbildene tørke i 1 time ved romtemperatur. Oppbevares i lukkede esker ved -20 °C.
MERK: Lysbildene kan trygt lagres i denne tilstanden i opptil 1 år.
Representative Results
Overvåking av fisken etter kryoskade
For å bestemme effekten av myomerkryoskade på dyr ble det utført et videoopptak av kontroll- og kryoskadet fisk 1 dag etter kryoskade (dpci) og 5 dpci. Hver gruppe inneholdt fem fisk. Ved 1 dpci svømte de kryoskadde fiskene mindre aktivt, men de viste ingen unormale bevegelser, som virvling, konvolusjon eller redusert likevekt (video 1). I oppdrettssystemet var deres posisjon i tanken og matinntaket lik den uskadde fiskens. Normal oppførsel vedvarte gjennom de følgende dagene, som eksemplifisert av videoen ved 5 dpci (Video 2). Avslutningsvis påvirket kryoskadeprosedyren til kaudale peduncle ikke dyrets velvære alvorlig.
Histologisk analyse av de kaudale peduncle-seksjonene
For å vurdere skadeomfanget ble tidspunktet 4 dpci valgt, da dette er når myofiberrestene er fullstendig resorbert i såret. For å analysere effekten av kryoskade langs kroppens dorso-ventrale og fremre-bakre akser ble det brukt to grupper fisk (dvs. henholdsvis koronale og transversale seksjoner av kaudale peduncle) (figur 1F).
Seksjonene ble analysert ved trikrom farging sammensatt av anilinblå, syre Fuchsin og oransje G (AFOG). Ved hjelp av denne kombinasjonen av reagenser ble intakte muskler vist i oransje, ryggmargen i mørk rød og den kollagenøse matriksen i blått. For å bestemme antall skadede myomerer, som er de metamere enhetene i fiskemuskulaturen, ble en serie seksjoner analysert (figur 2). Myomere grenser, kalt myocommata, ble identifisert ved kollagenavsetning, som oppdaget ved blå farge. De skadede områdene ble bestemt av fravær av oransje farging. Nærmere undersøkelse av prøver med tydelig myokommata viste at ca. fire påfølgende myomerer var skadet, utledet av manglende appelsinfarging (n, antall fisk = 4; Figur 3A,A'). Den uskadde siden av den samme fisken fungerte som den interne referansen.
For å undersøke sårdybden vinkelrett på kroppsaksen ble tverrsnitt fremstilt med sebrafisk ved 4 dpci og 7 dpci. Sistnevnte tidspunkt tilsvarer aktiveringen av det myogene programmet og dermed utbruddet av muskelregenerering. AFOG-farging av disse prøvene viste en omfattende mangel på oransje farging i kroppens kryoskadde flanke, som avgrenset sonen av degenerert skjelettmuskulatur (figur 3B,C). Ved 4 dpci og 7 dpci spente sårområdet vev fra huden mot vertikal septum. Dette viser at kryoskademetoden dypt målrettet mot en lateral halvdel av kaudale peduncle, som forble blottet for funksjonell muskel i 7 dager etter prosedyren. Til sammen ble fire myomerer dypt skadet på den ene siden av den kaudale peduncle.
Immunfluorescensanalyse av transversale seksjoner
For å vurdere dynamikken i muskelregenerering ble eksperimentelle grupper av fisk avlivet ved 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci og 30 dpci. De tverrgående delene av caudal peduncle ble merket ved flerfarget fluorescensfarging ved bruk av Phalloidin (som binder seg til filamentøs aktin [F-aktin]), Tropomyosin-1 antistoff, som oppdager et sarkomerprotein, og DAPI, som merker kjerner. På alle tidspunktene ga den uskadde halvdelen av kroppen en internkontroll; både F-aktin og Tropomyosin 1 ble sterkt påvist i de uskadde kontrolldelene, noe som indikerer uskadet vev (figur 4).
Ved 4 dpci inneholdt den skadde siden av caudal peduncle rikelig med DAPI-positive celler, men lite eller ingen F-aktin og Tropomyosin 1 immunfluorescens ble observert, noe som indikerer sårsonen med degenerert muskulatur (figur 4A-B'). Ved 7 dpci kunne Tropomyosin 1 og F-aktin påvises i en del av såret nær den vertikale kroppens midtlinje (figur 4C-D'). Dette uttrykksmønsteret avgrenser posisjonen der dannelsen av nye myofibre begynner i kaudal peduncle. Ved 10 dpci utvidet begge muskelmarkørene seg mot overflaten av kroppen, noe som tyder på progressiv regenerering av skjelettmuskulaturen (figur 4E-F'). Ved 30 dpci viste begge sider av kroppen en lignende fordeling av F-aktinfarging (figur 4G-H'). Dette funnet indikerer at skjelettmuskulaturen ble effektivt gjenopprettet etter kryoskaden til den kaudale peduncle.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for myomerkryoskade. (A) Dimensjoner på den spesialproduserte kryosonden laget av rustfritt stål. Den distale delen av instrumentet består av en slikkepott med en konkav kant på dybden på 1 mm for å ta hensyn til krumningen av sebrafiskkroppen. Den midtre delen av verktøyet består av en sylinder som fungerer som en vekt og et reservoar for å opprettholde den lave temperaturen på slikkepotten under prosedyren. Den proksimale enden av instrumentet er i form av et tynt metallhåndtak. (B,C) Bedøvet voksenfisk på en fuktig svamp med kryoproben på kaudalsokkelen. Sonden var i romtemperatur. (B) Sondens margin er plassert horisontalt i nærheten av den kaudale peduncle for å vise den relative størrelsen mellom fisken og verktøyet. (C) For kryoskade er spissen av verktøyet plassert vinkelrett på fisken. (D) Skjematisk illustrasjon av kryoskadeprosedyren fra ventralsiden av fisken for å vise manipulasjonene på en omfattende måte. Kryoproben ble forkjølt i flytende nitrogen og umiddelbart plassert på den ene siden av fisken i 6 s. (E) På et bestemt tidspunkt etter kryoskade ble fisken avlivet, og deres kaudale peduncles ble samlet for fiksering. (F) Det fikserte materialet ble histologisk bearbeidet og snittet langs koronale eller tverrgående plan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Histologisk analyse av skadede myomerer i caudal peduncle fra dorsale til ventrale posisjoner i kroppen. AFOG-farging av en serie koronale seksjoner 4 dager etter kryoskade (dpci). Snittene er fra dorsalen mot ventralsiden, som angitt på toppen av første og siste panel. Seksjonene er ikke-tilstøtende, med et intervall på ca. 150 μm mellom dem. Den uskadde muskelen oppdages ved oransje farging av muskelen, mens det skadede vevet mangler denne fargingen og virker gråaktig (område omkranset av en stiplet linje). Kollagenholdig vev, som huden, er farget i blått. Ryggmargen fremstår som en stanglignende struktur og er farget i rødt. Antall fisk, n = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av skadedybde i halestilkel med AFOG-farging. (A,A') Den koronale delen er på ryggmargens nivå (en rødfarget horisontal stang). Det nederste bildet viser et forstørret område som omfattes av en ramme i det øvre bildet. De sekvensielle myomergrensene vises som kollagenøse striper (blå) plassert skrått mot ryggmargen (røde piler i det forstørrede bildet A'). (B,C) Tverrsnittene viser den uskadde flanken med oransjefargede muskler og den kryoskadde flanken med gråaktig farging. Det skadede området er omkranset med en svart stiplet linje. Den vertikale septum (avbildet med en rød stiplet linje) deler kroppen inn i kontroll- og kryoskadede sider. Antall fisk, n = 4 per tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunfluorescerende påvisning av muskelproteiner etter kryoskade. Fluorescensfarging av tverrsnitt ved 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci og 30 dpci, som merket på venstre side og toppen av panelene (AB'). Ved 4 dpci er det skadede vevet (omkranset med den stiplede linjen) DAPI-positivt (blått), men uten Phalloidin-farging (grønn) eller Tropomyosin-1 immunoreaktivitet (rød), noe som tyder på degenerasjon av muskelfibrene etter kryoskade. (VG Nett) Ved 7 dpci dukker begge muskelmarkørene gradvis opp i det sårede området, noe som indikerer den regenerative prosessen. Tropomyosin-1 virker mer intens enn F-aktin i de nydannede fibrene. (E-F') Ved 10 dpci er skadesonen fylt med nye myofibre som viser en høyere intensitet av Tropomyosin-1 immunoreaktivitet sammenlignet med F-aktin. (VG Nett) Ved 30 dpci oppdages et lignende mønster av myofibre på begge sider av kroppen. Rammene i panelene A, C, E og H omfatter områdene som er forstørret i de tilstøtende bildene til høyre. Dermale skalaer, som utstråler fluorescens utenfor myomeren, ble slettet fra bildene ved hjelp av Adobe Photoshop. Antall fisk, n = 4 per tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Sebrafisken gir en anamniote virveldyrmodellorganisme for å studere mekanismene for muskelregenerering. De fleste av de eksisterende skademetodene, som laserablasjon eller stikksår, resulterer i relativt små vevsforstyrrelser20,21,22,23. Det er utført større reseksjoner på ekstraokulær muskel26. Imidlertid vil denne kirurgiske tilnærmingen trolig være mindre hensiktsmessig for lateral muskulatur på grunn av helsefarene ved å kutte kroppsveggen. For å unngå slike invasive prosedyrer, beskriver denne protokollen en mildere form for skade som likevel resulterer i dyp skade på caudal peduncle. Denne tilnærmingen er avhengig av en overfladisk manipulasjon som muliggjør svært presis målretting av noen få myomerer på den ene siden av kroppen. Styrken til kryoskademodellen ligger i dens reproduserbarhet og evne til å produsere omfattende muskeldegenerasjon; Basert på disse styrkene gir denne modellen en ny vei for å studere hvordan kroppen reagerer på betydelig muskeltap.
Påføringen av ekstrem kulde fører til et termisk sjokk, som ødelegger plasmamembranen og organeller i det berørte muskelvevet27. Som et resultat gjennomgår de skadede myofibrene "utilsiktet" celledød28. Følgelig kan det skadede vevet resorberes av naturlige mekanismer for sårfjerning. Sebrafisk tolererer kryoskadeprosedyren godt, da overlevelsesraten i denne studien var nesten 100%, gitt at den forkjølte sonden var riktig plassert på kroppen for den nøyaktige varigheten. Men hvis såret er for omfattende (f.eks. hvis det påføres for mye trykk eller varigheten av kryoskaden er for lang), kan fisken vise avvikende svømmebevegelser kort tid etter inngrepet, og dyret bør avlives som et humant endepunkt. For andre fiskearter bør eksponeringstiden for kryoproben justeres i henhold til kroppens størrelse.
Etter kryoskade kan fisken gjenoppta svømmeaktiviteten uten symptomer på unormal bevegelse. Kryoskadet fisk svømmer imidlertid mindre dynamisk enn kontrollfisk, noe som indikerer noen milde svekkelser. Videre kvantifisering av fiskens atferd på ulike tidspunkter etter kryoskade vil være nødvendig for å bestemme tidsmessige endringer i svømmeprestasjonen.
Effekten av kryoskademetoden på andre ikke-muskelvev av kaudal peduncle gjenstår å bli belyst. Det er åpenbart at det ytterste kroppslaget (dvs. huden) er skadet av prosedyren. I denne sammenheng kan kryoskademetoden gi en ny strategi for å studere sårheling, skalaregenerering og restaurering av pigmenteringsmønsteret. Videre kan myomerenes vaskulatur og innervasjon også påvirkes av kryoskade, og disse temaene krever ytterligere undersøkelser.
Kryoskademodellen har tidligere blitt brukt til å undersøke sebrafiskhjerteregenerering13,14,15,29. Denne metoden viste noen fordeler sammenlignet med ventrikulær reseksjonsmetode10 på grunn av forbigående avsetning av et kollagenrikt arr, som bedre etterligner infarkthelingsresponsen hos mennesker30. Bemerkelsesverdig nok kan sebrafisk regenerere hjertet etter flere kryoskader31. Interessant nok har kryoskade også blitt brukt på sebrafiskfinnen, noe som resulterer i histolytiske prosesser12. I motsetning til den klassiske finneamputasjonen inneholder den gjenværende kryoskadede stubben en forvrengt margin med en blanding av dødt materiale og friske celler. Studier med både sebrafiskorganer, hjertet og finnen, har avslørt sebrafiskens kraftige evne til å gjenopprette sine opprinnelige funksjonelle komponenter selv etter omfattende vevskader. Hvorvidt den kryoskadde skjelettmuskulaturen aktiverer et samspill mellom reparative og regenerative prosesser, garanterer fremtidige studier.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker V. Zimmermann for fiskepleie, samt Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli og Lea Gigon for oppstarten av dette prosjektet og deres foreløpige resultater. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation, stipendnummer 310030_208170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
| Material/ Equipment | |||
| 35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
| Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
| Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Surgical scissors | Any | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Dyes and Antibodies | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
| Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
| Recipies/Solutions | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2.7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Orange G | Sigma | ||
| 1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
| 200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
References
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
- Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Tulenko, F. J., Currie, P. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. Cartner, S. C. , Academic Press. Cambridge, MA. 115-121 (2020).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Pfefferli, C., Jaźwińska, A.
- Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
- Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
- Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
- Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
- Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Kaliya-Perumal, A. -K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
- Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
- Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).
