Summary
Detta protokoll beskriver en kryoskademodell för att inducera djup skada på flera kaudala myomerer hos vuxna zebrafiskar. Denna metod ger ett nytt tillvägagångssätt för att studera skelettmuskelregenerering efter allvarlig vävnadsförlust hos ryggradsdjur som inte är däggdjur.
Abstract
Skelettmuskulaturen genomgår förnyelse och restaurering efter mindre skada genom aktivering av satellitliknande stamceller. Svåra skador på muskulaturen leder ofta till fibros hos människor. I jämförelse med däggdjur har zebrafisk en högre medfödd kapacitet för organregenerering, vilket ger en kraftfull modell för att studera vävnadsåterställning efter omfattande skador på organet. Här beskrivs en kryoskademodell för att inducera djup skada på fyra myomerer av den kaudala peduncle hos vuxna zebrafiskar. En skräddarsydd kryosond utformades för att passa kroppsformen och reproducerbart skada sidomuskulaturen från huden till mittlinjen. Viktigt var att kroppsintegriteten förblev intakt och fisken fortsatte sin simaktivitet. Förändringar i skelettmuskulaturen bedömdes genom histologisk färgning och fluorescensfärgning av sarkomeriska proteiner på vävnadssnitt. Denna metod kommer att öppna nya forskningsvägar som syftar till att förstå hur degenerationen av skelettmuskeln inducerar reparativa svar och därmed reaktiveringen av det myogena programmet hos vuxna zebrafiskar.
Introduction
Hos ryggradsdjur genomgår skadade delar av olika vävnader homeostatisk förnyelse och restaurering under livslängden. Denna förmåga till förnyelse och återställande beror vanligtvis på närvaron av kompetenta stamceller eller de mogna cellernas proliferativa kapacitet 1,2. Skelettmuskulaturen består av postmitotiska myofibrer, som är associerade med lokala stamceller, kallade satellitceller 3,4,5,6. Således innehåller denna vävnad cellulära källor för effektiv tätning av områden med avbruten kontinuitet eller för reparation av mindre sår. Större volymetriska förluster i skelettmuskulaturen hos däggdjur följs emellertid ofta av icke-regenerativ reparation, såsom fibros7. Djurmodeller kan ge nya insikter om de biologiska mekanismer som främjar regenerering av kraftigt skadade organ.
Zebrafisken är en väletablerad modellorganism med hög regenerativ kapacitet. Vuxna zebrafiskar kan regenerera en amputerad del av deras stjärtfena eller den resekterade toppen av hjärtkammaren 8,9,10,11. Dessutom har en kryoskademetod tidigare tillämpats för att studera fen- och hjärtregenerering hos zebrafisk12,13,14,15. När det gäller inre organ har kryoskademetoden fördelen att inducera celldöd utan att störa organintegriteten, vilket efterliknar fysiologiska tillstånd16,17. Vävnadsskräp sönderdelas genom naturlig clearance under sårläkning, följt av de reparerande processerna. Huruvida denna metod kan tillämpas på skelettmuskulaturen återstår dock att fastställa.
Hos fisk möjliggör sidomuskulaturen böjning av bålen från sida till sida under simning18. Skelettmusklerna är organiserade i metamera enheter, kallade myomerer, som separeras av bindväv 5,19. Zebrafisk kan regenerera sin muskel efter mindre vävnadsstörningar, såsom de som orsakas av laserablation eller ett sticksår 20,21,22,23,24, men om hela myomerer kan regenerera efter omfattande skada är fortfarande okänt. Denna kunskapslucka beror troligen på att det saknas en lämplig skademodell. Detta protokoll etablerar ett nytt tillvägagångssätt för att inducera omfattande skador på skelettmuskeln, som spänner över flera myomerer. Den beskrivna kryoskademetoden är baserad på snabb frysning och upptining av myofibrerna med ett förkylt instrument av rostfritt stål. Trots de omfattande skadorna försämrades inte fiskens välbefinnande allvarligt. Hela myomerer kan återställas, och därmed ger detta arbete ett nytt modellsystem för att studera mekanismerna för muskulaturregenerering hos vuxna zebrafiskar.
Protocol
Denna studie genomfördes i överensstämmelse med alla relevanta etiska regler. Zebrafisken har fötts upp, fötts upp och underhållits i enlighet med riktlinjerna från Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA)25. Djurstallet och alla försöksförfaranden godkändes av kantonens veterinärkontor i Fribourg, Schweiz.
1. Utrustning och installation
- Ordna produktionen av en kryosond i rostfritt stål i en teknisk verkstad som kan tillverka instrument för forskning.
Tillhandahåll en utformning av instrumentet med de specifika måtten (figur 1A). - För att undvika frostskador när du hanterar sonden under proceduren, sätt in handtaget i en pipettspets och linda den med tejp.
- Förbered en bägare för anestesiarbetslösningen, en sked för hantering av fisken, en fuktig svamp och en tank med systemvatten för att låta fisken återhämta sig efter proceduren.
- Förbered arbetslösningen färskt före varje experiment. För att förbereda arbetslösningen, tillsätt 4 ml Tricaine-stamlösning till 100 ml systemvatten i en bägare.
OBS: Anestesistamlösningen består av 4 g trikain upplöst i 980 ml destillerat vatten. Efter justering av pH till 7 med 1 M Tris-HCl, pH 9, fyll lösningen till 1 liter med destillerat vatten. Stamlösningen är ljuskänslig och ska förvaras vid 4 °C i en bärnstensfärgad flaska.
2. Förfarande för kryoskada i muskler
- Börja proceduren genom att nedsänka sonden i flytande kväve i minst 3 minuter. Våt svampen i systemvatten och placera den på en plan yta.
- Överför en enda vuxen zebrafisk till Tricaine-arbetslösningen och bekräfta att den inte svarar genom att röra fisken försiktigt med skeden efter 1 min eller 2 min. Om fisken fortfarande är reaktiv, vänta lite längre.
- Lägg den bedövade fisken på den våta svampen. Leta reda på den kaudala peduncle bakom analfena och främre till caudal fena.
- Ta bort kryosonden från det flytande kvävet. Skaka sonden försiktigt för att säkerställa att inget kvarvarande flytande kväve finns kvar på spetsen.
- Placera spateln vinkelrätt mot kroppen på den kaudala peduncle (figur 1C). Håll sonden i detta läge i 6 s utan att trycka på (figur 1D).
OBS: Kryosondens vikt är tillräcklig för att säkerställa kontakt mellan instrumentet och vävnaden. - Släpp kryosonden från vävnaden och överför fisken till tanken med systemvatten.
- Övervaka fisken medan den återupptar andning och simning efter att ha vaknat upp från anestesin. Om operkulära rörelser inte inträffar efter 30 s, stimulera fisken genom att pipettera systemvatten i gälarna tills djuret initierar andning av sig själv.
OBS: Fisken bör återuppta simningen inom några minuter i återhämtningstanken.
OBS: Under de följande dagarna kan fisken filmas för att övervaka deras simaktivitet (Video 1 och Video 2). Innan videoinspelningen, överför kontrollen och skadade fiskar till en genomskinlig parningstank och låt dem vänja sig i minst 1 min.
3. Caudal peduncle samling och fixering
- Förbered 2 ml 4% formalin eller annat fixeringsmedel som är lämpligt för efterföljande analyser, en petriskål, pincett och kirurgisk sax.
- Avliva fisken vid en vald tidpunkt efter kryoskadan enligt det lagliga tillståndet från det regionala veterinärkontoret.
OBS: Eutanasi utförs genom en överdos av trikainlösning (300 mg / L) i cirka 10 minuter. Förlusten av gillrörelse och svansfena nypa reflex bekräftar döden. Tidpunkterna för eutanasi bör väljas enligt regenereringsfasen: till exempel från 1 dag efter kryoskada (dpci) till 3 dpci för sårrensning; från 3 dpci till 10 dpci för initiering av muskelregenerering; från 10 dpci till 30 dpci för progressiv regenerering; och efter 30 dpci för slutförandet av vävnadsåterställning. Således, för att bedöma de olika stegen och biologiska processerna för muskeldegenerering och regenerering, måste grupper av fisk avlivas vid olika tidpunkter efter kryoskada. - Lägg den avlivade fisken i en petriskål som innehåller avjoniserat vatten. Använd sax för att utföra ett snitt genom kroppen främre och bakre till den kaudala peduncle (figur 1E). Låt vävnaden blöda ut i petriskålens avjoniserade vatten.
- Samla upp den kaudala peduncle och överför den med pincett till den beredda fixeringslösningen i ett mikrocentrifugrör.
OBS: Vänd försiktigt rören upp och ner flera gånger och förvara dem över natten vid 4 °C.
4. Montering av den kaudala peduncle
- Tvätta den fasta vävnaden i 1x PBS i 10 minuter på en vippa. Överför den sedan till ett 2 ml mikrocentrifugrör med förkyld 30% sackaros i avjoniserat vatten vid 4 °C och vänd försiktigt röret flera gånger. Låt mikrocentrifugrören stå i upprätt läge i minst 24 timmar vid 4 °C.
OBS: Den kaudala peduncle kommer att flyta ovanpå sackaroslösningen och börja sjunka när vävnaden dehydrerar. - Fyll en inbäddningsform med ett 5 mm lager av O.C.T. monteringsmedium. Använd pincett för att justera den kaudala peduncle i mediet. Placera den längst ner på formen och justera dess orientering för antingen tvärgående eller koronala sektioner (figur 1F).
- Låt mediet frysa i en låda med torris. Så snart vävnaden stabiliserats i önskad position, fyll upp resten av formen innan OCT fryser helt. Förvara formen i minst 1 h vid −80 °C.
OBS: Under dessa förhållanden kan vävnaderna lagras i många månader.
5. Skär sektionerna med en kryostat
- Ställ in en kryostat med en skärtjocklek på 25 μm. Justera kammartemperaturen till −26 °C, provtemperaturen till −24 °C och skärvinkeln till 12°.
- Placera det frusna blocket med provet i kryostaten och fixera dess orientering för att skära parallellt med blockets botten. Klipp tills du når provet och trimma sedan blocket för att underlätta provsamlingen.
- Förbered sex vidhäftningsglas. Märk objektglasen med på varandra följande nummer för att förbereda replikat av provet.
- Börja klippa och samla vävnadssektionerna på de märkta vidhäftningsglasen. Ordna sektionerna på bilderna enligt de ytterligare experimentella kraven.
- Låt glasen torka i 1 h vid rumstemperatur. Förvara dem i slutna lådor vid -20 °C.
OBS: Objektglasen kan förvaras säkert i detta skick i upp till 1 år.
Representative Results
Övervakning av fisken efter kryoskada
För att bestämma effekten av myomere kryoskada på djur utfördes en videoinspelning av kontroll och kryoskadad fisk vid 1 dagar efter kryoskada (dpci) och 5 dpci. Varje grupp innehöll fem fiskar. Vid 1 dpci simmade den kryoskadade fisken mindre aktivt, men de visade inga onormala rörelser, såsom virvlande, faltning eller minskad jämvikt (Video 1). I djurhållningssystemet liknade deras position i tanken och matintaget den hos den oskadade fisken. Normalt beteende kvarstod under de följande dagarna, vilket exemplifieras av videon vid 5 dpci (Video 2). Sammanfattningsvis påverkade kryoskadeproceduren hos den kaudala peduncle inte allvarligt djurens välbefinnande.
Histologisk analys av de kaudala pedunkelsektionerna
För att bedöma skadans omfattning valdes tidpunkten 4 dpci, eftersom det är då myofiberskräpet har resorbrerats fullständigt i såret. För att analysera effekterna av kryoskada längs kroppens dorso-ventrala och främre-bakre axlar användes två grupper av fisk (dvs koronala respektive tvärgående sektioner av den kaudala peduncle) (figur 1F).
Sektionerna analyserades med trikromfärgning bestående av anilinblått, surt fuchsin och orange G (AFOG). Med hjälp av denna kombination av reagens visades intakta muskler i orange, ryggmärgen i mörkröd och kollagenmatrisen i blått. För att bestämma antalet skadade myomerer, vilka är de metamera enheterna i fiskmuskulaturen, analyserades en serie sektioner (Figur 2). Myomergränser, kallade myocommata, identifierades genom kollagenavsättning, som detekterades av blå färgning. De skadade områdena bestämdes av frånvaron av orange färgning. En närmare undersökning av prover med uppenbar myocommata avslöjade att ungefär fyra på varandra följande myomerer skadades, vilket framgår av bristen på apelsinfärgning (n, antal fiskar = 4; Figur 3A,A'). Den oskadade sidan av samma fisk fungerade som den interna referensen.
För att undersöka sårets djup vinkelrätt mot kroppsaxeln framställdes tvärsnitt med zebrafisk vid 4 dpci och 7 dpci. Den senare tidpunkten motsvarar aktiveringen av det myogena programmet och därmed uppkomsten av muskelregenerering. AFOG-färgning av dessa prover visade en omfattande brist på orange färgning i kroppens kryoskadade flank, vilket avgränsade zonen för degenererad skelettmuskulatur (figur 3B, C). Vid 4 dpci och 7 dpci sträckte sårområdet vävnader från huden mot vertikal septum. Detta visar att kryoskademetoden djupt riktade sig mot en lateral halva av den kaudala pedunkeln, som förblev utan funktionell muskel i 7 dagar efter proceduren. Sammantaget skadades fyra myomerer djupt på ena sidan av den kaudala peduncle.
Immunofluorescensanalys av de tvärgående sektionerna
För att bedöma dynamiken i muskelregenerering avlivades experimentella grupper av fisk vid 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci och 30 dpci. De tvärgående sektionerna av den kaudala peduncle märktes genom flerfärgad fluorescensfärgning med användning av Phalloidin (som binder till filamentöst aktin [F-aktin]), Tropomyosin-1-antikropp, som detekterar ett sarkomerprotein och DAPI, som märker kärnor. Vid alla tidpunkter gav den oskadade halvan av kroppen en intern kontroll; både F-aktin och Tropomyosin 1 detekterades starkt i de oskadade kontrolldelarna, vilket indikerar oskadad vävnad (figur 4).
Vid 4 dpci innehöll den skadade sidan av den kaudala peduncle rikliga DAPI-positiva celler, men lite eller ingen F-aktin och Tropomyosin 1 immunofluorescens observerades, vilket indikerar sårzonen med degenererade muskler (figur 4A-B '). Vid 7 dpci kunde Tropomyosin 1 och F-aktin detekteras i en del av såret nära den vertikala kroppens mittlinje (figur 4C-D'). Detta uttrycksmönster avgränsar positionen där bildandet av nya myofibrer börjar i den kaudala peduncle. Vid 10 dpci expanderade båda muskelmarkörerna mot kroppens yta, vilket tyder på progressiv regenerering av skelettmuskeln (figur 4E-F'). Vid 30 dpci uppvisade båda sidor av kroppen en liknande fördelning av F-aktinfärgning (figur 4G-H'). Detta fynd indikerar att skelettmuskeln effektivt återställdes efter kryoskadan hos den kaudala pedunkeln.
Figur 1: Experimentell inställning för myomerkryoskada. (A) Mått på den specialtillverkade kryosonden av rostfritt stål. Den distala delen av instrumentet består av en spatel med en konkav kant på djupet av 1 mm för att ta hänsyn till zebrafiskkroppens krökning. Den mellersta delen av verktyget består av en cylinder som fungerar som en vikt och en behållare för att bibehålla spatelns låga temperatur under proceduren. Den proximala änden av instrumentet är i form av ett tunt metallhandtag. (B,C) Bedövade vuxna fiskar på en fuktig svamp med kryosonden på den kaudala peduncle. Sonden hade rumstemperatur. (B) Sondens marginal placeras horisontellt i närheten av den kaudala peduncle för att visa den relativa storleken mellan fisken och verktyget. (C) För kryoskada är verktygets spets placerad vinkelrätt mot fisken. d) Schematisk illustration av kryoskadeproceduren från fiskens ventrala sida för att visa manipulationerna på ett heltäckande sätt. Kryosonden förkyldes i flytande kväve och placerades omedelbart på ena sidan av fisken i 6 s. (E) Vid en viss tidpunkt efter kryoskada avlivades fisken och deras kaudala peduncles samlades in för fixering. (F) Det fasta materialet bearbetades histologiskt och snittades längs koronal- eller tvärplanen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologisk analys av skadade myomerer i den kaudala peduncle från dorsal till kroppens ventrala position. AFOG-färgning av en serie koronala sektioner vid 4 dagar efter kryoskada (dpci). Sektionerna är från dorsalen mot den ventrala sidan, som anges på toppen av den första och den sista panelen. Sektionerna är inte intilliggande, med ett intervall på cirka 150 μm mellan dem. Den oskadade muskeln detekteras genom orange färgning av muskeln, medan den skadade vävnaden saknar denna färgning och verkar gråaktig (område omgivet av en streckad linje). Kollagenhaltiga vävnader, såsom huden, är färgade i blått. Ryggmärgen framträder som en stavliknande struktur och är färgad i rött. Antal fiskar, n = 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av skadedjup i stjärtskaftet med AFOG-färgning. (A,A') Koronalsektionen ligger på ryggmärgsnivån (en rödfärgad horisontell stång). Den nedre bilden visar ett förstorat område som omges av en ram i den övre bilden. De sekventiella myomergränserna visas som kollagenränder (blå) placerade snett mot ryggmärgen (röda pilar i den förstorade bilden A'). (B,C) Tvärsnitten visar den oskadade flanken med orangefärgade muskler och den kryoskadade flanken med gråaktig färgning. Det skadade området är omgivet av en svart streckad linje. Den vertikala septumet (avbildad med en röd streckad linje) delar upp kroppen i kontroll- och kryoskadade sidor. Antal fiskar, n = 4 per tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofluorescerande detektion av muskelproteiner efter kryoskada. Fluorescensfärgning av tvärsnitt vid 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci och 30 dpci, enligt etiketten på vänster sida och toppen av panelerna (A-B'). Vid 4 dpci är den skadade vävnaden (omgiven av den streckade linjen) DAPI-positiv (blå) men saknar falloidinfärgning (grön) eller Tropomyosin-1-immunreaktivitet (röd), vilket tyder på degenerering av muskelfibrerna efter kryoskada. (C-D') Vid 7 dpci framträder båda muskelmarkörerna gradvis i det sårade området, vilket indikerar den regenerativa processen. Tropomyosin-1 verkar mer intensiv än F-aktin i de nybildade fibrerna. (E-F') Vid 10 dpci fylls skadezonen med nya myofibrer som visar en högre intensitet av Tropomyosin-1-immunreaktivitet jämfört med F-aktin. (G-H') Vid 30 dpci detekteras ett liknande mönster av myofibrer i båda sidor av kroppen. Ramarna i panelerna A, C, E och H omfattar de områden som förstoras i de intilliggande bilderna till höger. Dermala skalor, som utstrålade fluorescens utanför myomeren, raderades från bilderna med Adobe Photoshop. Antal fiskar, n = 4 per tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Zebrafisken tillhandahåller en anamniote ryggradsdjur modellorganism för att studera mekanismerna för muskelregenerering. De flesta av de befintliga skademetoderna, såsom laserablation eller sticksår, resulterar i relativt små vävnadsstörningar20,21,22,23. Större resektioner har utförts på extraokulär muskel26. Detta kirurgiska tillvägagångssätt skulle dock förmodligen vara mindre lämpligt för lateral muskulatur på grund av hälsoriskerna med att skära kroppsväggen. För att undvika sådana invasiva procedurer beskriver detta protokoll en mildare form av skada som ändå resulterar i djup skada på den kaudala peduncle. Detta tillvägagångssätt bygger på en ytlig manipulation som möjliggör en mycket exakt inriktning av några myomerer på ena sidan av kroppen. Kryoskademodellens styrkor ligger i dess reproducerbarhet och förmåga att producera omfattande muskeldegeneration; Baserat på dessa styrkor ger denna modell en ny väg att studera hur kroppen reagerar på betydande muskelförlust.
Appliceringen av extrem kyla leder till en termisk chock, som förstör plasmamembranet och organellerna i den drabbade muskelvävnaden27. Som ett resultat genomgår de skadade myofibrerna "oavsiktlig" celldöd28. Följaktligen kan den skadade vävnaden resorberas genom naturliga mekanismer för sårclearance. Zebrafiskar tolererar kryoskadeproceduren väl, eftersom överlevnadsgraden i denna studie var nästan 100%, med tanke på att den förkylda sonden var korrekt placerad på kroppen under den exakta varaktigheten. Men om såret är för omfattande (t.ex. om för mycket tryck appliceras eller kryoskadans varaktighet är för lång) kan fisken uppvisa avvikande simrörelser strax efter proceduren, och djuret bör avlivas som en human slutpunkt. För andra fiskarter bör exponeringstiden för kryosonden justeras efter kroppens storlek.
Efter kryoskada kan fisken återuppta sin simaktivitet utan några symtom på onormal rörelse. Kryoskadade fiskar simmar dock mindre dynamiskt än kontrollfisk, vilket indikerar några milda funktionsnedsättningar. Ytterligare kvantifiering av fiskens beteende vid olika tidpunkter efter kryoskada kommer att vara nödvändig för att bestämma tidsmässiga förändringar i simprestandan.
Effekten av kryoskademetoden på andra icke-muskelvävnader i den kaudala pedunkeln återstår att klarlägga. Uppenbarligen skadas det yttre kroppsskiktet (dvs. huden) av proceduren. I detta sammanhang kan kryoskademetoden ge en ny strategi för att studera sårläkning, skalregenerering och återställande av pigmenteringsmönstret. Dessutom kan myomerernas vaskulatur och innervation också påverkas av kryoskada, och dessa ämnen kräver ytterligare undersökning.
Kryoskademodellen har tidigare använts för att undersöka zebrafiskhjärtregenerering13,14,15,29. Denna metod visade vissa fördelar jämfört med ventrikulär resektionsmetod10 på grund av den övergående avsättningen av ett kollagenrikt ärr, vilket bättre efterliknar infarktläkningssvaret hos människor30. Anmärkningsvärt kan zebrafisk regenerera sitt hjärta efter flera kryoskador31. Intressant nog har kryoskada också applicerats på zebrafiskfenan, vilket resulterar i histolytiska processer12. I motsats till den klassiska fenamputationen innehåller den återstående kryoskadade stubben en förvrängd marginal med en blandning av dött material och friska celler. Studier med både zebrafiskorgan, hjärtat och fenan, har avslöjat zebrafiskens kraftfulla förmåga att återställa sina ursprungliga funktionella komponenter även efter omfattande vävnadsskador. Huruvida den kryoskadade skelettmuskeln aktiverar ett samspel mellan reparativa och regenerativa processer motiverar framtida studier.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar V. Zimmermann för fiskvård, liksom Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli och Lea Gigon för initieringen av detta projekt och deras preliminära resultat. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation, bidragsnummer 310030_208170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
| Material/ Equipment | |||
| 35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
| Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
| Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Surgical scissors | Any | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Dyes and Antibodies | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
| Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
| Recipies/Solutions | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2.7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Orange G | Sigma | ||
| 1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
| 200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
References
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).
- Carlson, B. M. Some principles of regeneration in mammalian systems. Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Tulenko, F. J., Currie, P. Zebrafish myology. The Zebrafish in Biomedical Research. Cartner, S. C. , Academic Press. Cambridge, MA. 115-121 (2020).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Pfefferli, C., Jaźwińska, A.
- Sehring, I. M., Weidinger, G. Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish. WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Sanz-Morejón, A., Mercader, N. Recent insights into zebrafish cardiac regeneration. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).
- Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).
- Jaźwińska, A., Sallin, P. Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart. Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).
- Alexander, R. The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).
- Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish. Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Kaliya-Perumal, A. -K., Ingham, P. W. Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective. Biochimie. 196, 171-181 (2022).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).
- Saera-Vila, A., et al. Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
- Chablais, F., Jaźwińska, A. The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling. Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).
- Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration. Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).
