Summary
यह प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफ़िश में कई पुच्छल मायोमर्स के गहन नुकसान को प्रेरित करने के लिए एक क्रायोइंजरी मॉडल का वर्णन करता है। यह विधि गैर-स्तनधारी कशेरुकियों में ऊतक के गंभीर नुकसान के बाद कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है।
Abstract
उपग्रह जैसी स्टेम कोशिकाओं के सक्रियण के माध्यम से मामूली चोट के बाद कंकाल की मांसपेशी नवीकरण और बहाली से गुजरती है। मांसपेशियों की गंभीर चोटें अक्सर मनुष्यों में फाइब्रोसिस का कारण बनती हैं। स्तनधारियों की तुलना में, ज़ेबराफ़िश में अंग पुनर्जनन के लिए एक उच्च जन्मजात क्षमता होती है, जो अंग को व्यापक नुकसान के बाद ऊतक बहाली का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करती है। यहां, एक क्रायोइंजरी मॉडल को वयस्क ज़ेबराफिश में पुच्छल पेडुनकल के चार मायोमर्स को गहरा नुकसान पहुंचाने के लिए वर्णित किया गया है। एक कस्टम-निर्मित क्रायोप्रोब को शरीर के आकार को फिट करने और त्वचा से मध्य रेखा तक पार्श्व मांसपेशियों को चोट पहुंचाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, शरीर की अखंडता बरकरार रही, और मछली ने अपनी तैराकी गतिविधि जारी रखी। कंकाल की मांसपेशियों में परिवर्तन का मूल्यांकन ऊतक वर्गों पर सार्कोमेरिक प्रोटीन के हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन और प्रतिदीप्ति धुंधलापन द्वारा किया गया था। यह विधि यह समझने के उद्देश्य से अनुसंधान के नए रास्ते खोलेगी कि कंकाल की मांसपेशियों का अध: पतन कैसे उपचारात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है और इस प्रकार, वयस्क ज़ेब्राफिश में मायोजेनिक कार्यक्रम का पुनर्सक्रियन।
Introduction
कशेरुक में, विभिन्न ऊतकों के क्षतिग्रस्त हिस्से जीवनकाल के दौरान होमियोस्टैटिक नवीकरण और बहाली से गुजरते हैं। नवीकरण और बहाली की यह क्षमता आमतौर पर सक्षम स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति या परिपक्व कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव क्षमता 1,2 पर निर्भर करती है। कंकाल की मांसपेशियों में पोस्ट-माइटोटिक मायोफाइबर शामिल होते हैं, जो स्थानीय स्टेम कोशिकाओं से जुड़े होते हैं, जिन्हें उपग्रह कोशिकाएं 3,4,5,6 कहा जाता है। इस प्रकार, इस ऊतक में बाधित निरंतरता के क्षेत्रों की कुशल सीलिंग के लिए या मामूली घावों की मरम्मत के लिए सेलुलर स्रोत होते हैं। हालांकि, स्तनधारी कंकाल की मांसपेशियों में बड़े वॉल्यूमेट्रिक नुकसान अक्सर गैर-पुनर्योजी मरम्मत के बाद होते हैं, जैसे फाइब्रोसिस7। पशु मॉडल जैविक तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो बड़े पैमाने पर क्षतिग्रस्त अंगों के उत्थान को बढ़ावा देते हैं।
ज़ेबराफ़िश एक उच्च पुनर्योजी क्षमता के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है। वयस्क जेब्राफिश अपने पुच्छल पंख के एक कटे हुए हिस्से या कार्डियकवेंट्रिकल 8,9,10,11 के कटे हुए शीर्ष को पुनर्जीवित कर सकती है। इसके अलावा, जेब्राफिश12,13,14,15 में फिन और हृदय पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए पहले एक क्रायोइंजरी विधि लागू की गई है। आंतरिक अंगों के मामले में, क्रायोइंजरी विधि में अंग अखंडता को बाधित किए बिना कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने का लाभ होता है, इस प्रकार शारीरिक स्थितियोंकी नकल 16,17। घाव भरने के दौरान ऊतक मलबे को प्राकृतिक निकासी द्वारा विघटित किया जाता है, इसके बाद उपचारात्मक प्रक्रियाएं होती हैं। हालांकि, क्या इस विधि को कंकाल की मांसपेशियों पर लागू किया जा सकता है, यह स्थापित किया जाना बाकी है।
मछली में, पार्श्व मांसलता तैराकी के दौरान ट्रंकके साइड-टू-साइड झुकने में सक्षम बनाती है। कंकाल की मांसपेशियों को मेटामेरिक इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है, जिसे मायोमेरेस कहा जाता है, जो संयोजी ऊतक 5,19 द्वारा अलग किए जाते हैं। जेब्राफिश मामूली ऊतक व्यवधानों के बाद अपनी मांसपेशियों को पुनर्जीवित कर सकती है, जैसे कि लेजर एब्लेशन या चाकू के घाव20,21,22,23,24 के कारण, लेकिन क्या व्यापक चोट के बाद पूरे मायोमेरेस पुनर्जीवित हो सकते हैं, यह अज्ञात है। ज्ञान में यह अंतर शायद एक उपयुक्त चोट मॉडल की कमी के कारण है। यह प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों की व्यापक चोट को प्रेरित करने के लिए एक नया दृष्टिकोण स्थापित करता है, जो कई मायोमेरेस तक फैला हुआ है। वर्णित क्रायोइंजरी विधि प्रीकूल्ड स्टेनलेस-स्टील उपकरण के साथ मायोफाइबर के तेजी से ठंड और पिघलने पर आधारित है। व्यापक क्षति के बावजूद, मछली की भलाई गंभीर रूप से खराब नहीं हुई थी। संपूर्ण मायोमेरेस को बहाल किया जा सकता है, और, इस प्रकार, यह काम वयस्क ज़ेब्राफिश में मांसलता पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक नई मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।
Protocol
यह अध्ययन सभी प्रासंगिक नैतिक नियमों के साथ समझौते में आयोजित किया गया था। जेब्राफिश को फेडरेशन ऑफ यूरोपियन लेबोरेटरी एनिमल साइंस एसोसिएशन (फेलासा) के दिशानिर्देशों25 के अनुसार प्रजनन, पाला और बनाए रखा गया था। पशु आवास और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फ्रीबर्ग, स्विट्जरलैंड के कैंटोनल पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. उपकरण और सेटअप
- एक तकनीकी कार्यशाला में एक स्टेनलेस स्टील क्रायोप्रोब के उत्पादन की व्यवस्था करें जो अनुसंधान के लिए उपकरणों का निर्माण कर सकता है।
नोट: विशिष्ट आयामों (चित्रा 1 ए) के साथ उपकरण का एक डिजाइन प्रदान करें। - प्रक्रिया के दौरान जांच को संभालने के दौरान शीतदंश से बचने के लिए, हैंडल को पिपेट टिप में डालें, और इसे टेप के साथ लपेटें।
- एनेस्थीसिया वर्किंग सॉल्यूशन के लिए एक बीकर, मछली को संभालने के लिए एक चम्मच, एक नम स्पंज, और सिस्टम पानी के साथ एक टैंक तैयार करें ताकि प्रक्रिया के बाद मछली ठीक हो सके।
- हर प्रयोग से पहले काम करने वाले समाधान को ताजा तैयार करें। काम करने वाले समाधान को तैयार करने के लिए, एक बीकर में 100 एमएल सिस्टम पानी में 4 एमएल ट्राइकेन स्टॉक समाधान जोड़ें।
नोट: संज्ञाहरण स्टॉक समाधान में 980 एमएल आसुत जल में घुलने वाले 4 ग्राम ट्राइकेन होते हैं। पीएच को 1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 9 के साथ 7 में समायोजित करने के बाद, आसुत जल के साथ घोल को 1 एल में भरें। स्टॉक समाधान प्रकाश-संवेदनशील है और इसे एम्बर बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
2. मांसपेशी क्रायोइंजरी प्रक्रिया
- कम से कम 3 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में जांच को डुबोकर प्रक्रिया शुरू करें। सिस्टम के पानी में स्पंज को गीला करें, और इसे एक सपाट सतह पर रखें।
- एक वयस्क ज़ेब्राफिश को ट्राइकेन वर्किंग सॉल्यूशन में स्थानांतरित करें, और 1 मिनट या 2 मिनट के बाद चम्मच से मछली को धीरे से छूकर इसकी अनुक्रियाशीलता की पुष्टि करें। यदि मछली अभी भी प्रतिक्रियाशील है, तो थोड़ा लंबा इंतजार करें।
- गीले स्पंज पर एनेस्थेटाइज्ड मछली रखें। गुदा पंख के पीछे और पुच्छल पंख के पूर्व में पुच्छल पेडुकल का पता लगाएं।
- तरल नाइट्रोजन से क्रायोप्रोब को हटा दें। जांच को धीरे से हिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नोक पर कोई अवशिष्ट तरल नाइट्रोजन न रहे।
- स्पैटुला के किनारे को पुच्छल पेडुनकल (चित्रा 1 सी) पर शरीर के लंबवत रखें। दबाव लागू किए बिना 6 सेकंड के लिए जांच को इस स्थिति में रखें (चित्रा 1 डी)।
नोट: क्रायोप्रोब का वजन उपकरण और ऊतक के बीच संपर्क सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है। - ऊतक से क्रायोप्रोब जारी करें, और मछली को सिस्टम पानी के साथ टैंक में स्थानांतरित करें।
- संज्ञाहरण से जागने के बाद सांस लेने और तैरने के दौरान मछली की निगरानी करें। यदि 30 सेकंड के बाद ऑपरकुलर आंदोलन नहीं होते हैं, तो सिस्टम के पानी को गलफड़ों में पाइप करके मछली को उत्तेजित करें जब तक कि जानवर स्वयं श्वसन शुरू न कर दे।
नोट: मछली को रिकवरी टैंक में कुछ मिनटों के भीतर तैरना फिर से शुरू करना चाहिए।
नोट: निम्नलिखित दिनों में, मछली को उनकी तैराकी गतिविधि (वीडियो 1 और वीडियो 2) की निगरानी के लिए फिल्माया जा सकता है। वीडियो रिकॉर्डिंग से पहले, नियंत्रण और घायल मछली को पारभासी संभोग टैंक में स्थानांतरित करें, और उन्हें कम से कम 1 मिनट के लिए आदत डालें।
3. पुच्छल पेडुनकल संग्रह और निर्धारण।
- 4% फॉर्मेलिन या अन्य फिक्सेटिव के 2 एमएल तैयार करें जो बाद के परख, एक पेट्री डिश, फोर्सप्स और सर्जिकल कैंची के लिए उपयुक्त है।
- क्षेत्रीय पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा दी गई कानूनी अनुमति के अनुसार क्रायोइंजरी के बाद एक चयनित समय बिंदु पर मछली को इच्छामृत्यु दें।
नोट: इच्छामृत्यु लगभग 10 मिनट के लिए ट्राइकेन समाधान (300 मिलीग्राम / एल) के ओवरडोज से की जाती है। गिल आंदोलन का नुकसान और पूंछ पंख पिंच रिफ्लेक्स मृत्यु की पुष्टि करता है। इच्छामृत्यु के समय बिंदुओं को पुनर्जन्म के चरण के अनुसार चुना जाना चाहिए: उदाहरण के लिए, घाव की सफाई के लिए 1 दिन पोस्ट-क्रायोइंजरी (डीपीसीआई) से 3 डीपीसीआई तक; मांसपेशियों के पुनर्जनन की शुरुआत के लिए 3 डीपीसीआई से 10 डीपीसीआई तक; पुनरूत्थान की प्रगति के लिए 10 डीपीसीआई से 30 डीपीसीआई तक; और ऊतक बहाली के पूरा होने के लिए 30 डीपीसीआई के बाद। इस प्रकार, मांसपेशियों के अध: पतन और पुनर्जनन के विभिन्न चरणों और जैविक प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए, मछली के समूहों को क्रायोइंजरी के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है। - इच्छामृत्यु मछली को विआयनीकृत पानी युक्त पेट्री डिश में रखें। कैंची का उपयोग शरीर के पूर्ववर्ती और पुच्छल पेडुनकल के पीछे के माध्यम से एक कट करने के लिए करें (चित्रा 1 ई)। ऊतक को पेट्री डिश के विआयनीकृत पानी में खून बहने दें।
- पुच्छल पेडुनकल को इकट्ठा करें, और इसे एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार फिक्सेटिव समाधान में बल के साथ स्थानांतरित करें।
नोट: ट्यूबों को कई बार ध्यान से उलटा करें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
4. पुच्छल पेडुनेल को ऊपर उठाना
- एक रॉकर पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में निश्चित ऊतक धोएं। फिर, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर विआयनीकृत पानी में प्री-कूल्ड 30% सुक्रोज के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और धीरे से ट्यूब को कई बार उलटा करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए एक सीधी स्थिति में छोड़ दें।
नोट: पुच्छल पेडुनकल सुक्रोज समाधान के शीर्ष पर तैरजाएगा और ऊतक निर्जलित होने के साथ डूबना शुरू हो जाएगा। - ओ.सी.टी. माउंटिंग माध्यम की 5 मिमी परत के साथ एक एम्बेडिंग मोल्ड भरें। माध्यम में पुच्छल पेडुनकल को समायोजित करने के लिए बल का उपयोग करें। इसे मोल्ड के निचले भाग में रखें, और ट्रांसवर्सल या कोरोनल वर्गों (चित्रा 1 एफ) के लिए इसके अभिविन्यास को समायोजित करें।
- मध्यम को सूखी बर्फ के एक बॉक्स में जमने दें। जैसे ही ऊतक को वांछित स्थिति में स्थिर किया जाता है, ओसीटी पूरी तरह से जमने से पहले बाकी मोल्ड को भरें। मोल्ड को -80 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 1 घंटे के लिए स्टोर करें।
नोट: इन स्थितियों के तहत, ऊतकों को कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
5. क्रायोस्टैट के साथ वर्गों को काटना
- 25 μm की काटने की मोटाई के साथ एक क्रायोस्टैट स्थापित करें। कक्ष के तापमान को -26 डिग्री सेल्सियस, नमूना तापमान -24 डिग्री सेल्सियस और काटने के कोण को 12 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।
- क्रायोस्टैट में नमूने के साथ जमे हुए ब्लॉक को रखें, और ब्लॉक के नीचे के समानांतर काटने के लिए इसके अभिविन्यास को ठीक करें। नमूना तक पहुंचने तक काटें, और फिर नमूना संग्रह को आसान बनाने के लिए ब्लॉक को ट्रिम करें।
- छह आसंजन स्लाइड तैयार करें। नमूने की प्रतिकृति तैयार करने के लिए स्लाइड्स को लगातार संख्याओं के साथ लेबल करें।
- काटना शुरू करें, और लेबल आसंजन स्लाइड पर ऊतक अनुभाग एकत्र करें। आगे की प्रयोगात्मक मांगों के अनुसार स्लाइड पर अनुभागों को व्यवस्थित करें।
- स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर 1 घंटे तक सूखने दें। उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर बंद बक्से में स्टोर करें।
नोट: स्लाइड्स को 1 वर्ष तक इस स्थिति में सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।
Representative Results
क्रायोइंजरी के बाद मछली की निगरानी
जानवरों पर मायोमेरे क्रायोइंजरी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, 1 दिनों के पोस्ट-क्रायोइंजरी (डीपीसीआई) और 5 डीपीसीआई पर नियंत्रण और क्रायोइंजरी मछली की एक वीडियो रिकॉर्डिंग की गई थी। प्रत्येक समूह में पांच मछलियां थीं। 1 डीपीसीआई पर, क्रायोघायल मछली कम सक्रिय रूप से तैर रही थी, लेकिन उन्होंने किसी भी असामान्य आंदोलनों को प्रदर्शित नहीं किया, जैसे कि घूमना, संक्रामक या कम संतुलन (वीडियो 1)। पशुपालन प्रणाली में, टैंक में उनकी स्थिति और भोजन का सेवन अघायल मछली के समान था। सामान्य व्यवहार अगले दिनों में जारी रहा, जैसा कि 5 dpci (वीडियो 2) पर वीडियो द्वारा उदाहरण दिया गया है। अंत में, पुच्छल पेडुनकल की क्रायोइंजरी प्रक्रिया ने जानवरों की भलाई को गंभीर रूप से प्रभावित नहीं किया।
पुच्छल पेडुनकल वर्गों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
चोट की सीमा का आकलन करने के लिए, 4 डीपीसीआई के समय बिंदु का चयन किया गया था, क्योंकि यह तब होता है जब घाव में मायोफिबर मलबे को पूरी तरह से पुनर्जीवित किया गया है। शरीर के डोर्सो-वेंट्रल और पूर्वकाल-पीछे के अक्षों के साथ क्रायोइंजरी के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए, मछली के दो समूहों का उपयोग किया गया था (यानी, क्रमशः पुच्छल पेडुनकल के कोरोनल और ट्रांसवर्सल सेक्शन) (चित्रा 1 एफ)।
अनुभागों का विश्लेषण एनिलिन ब्लू, एसिड फ्यूचिन और ऑरेंज जी (एएफओजी) से बना ट्राइक्रोम स्टेनिंग द्वारा किया गया था। अभिकर्मकों के इस संयोजन का उपयोग करते हुए, बरकरार मांसपेशियों को नारंगी रंग में, रीढ़ की हड्डी को गहरे लाल रंग में और कोलेजनस मैट्रिक्स को नीले रंग में दिखाया गया था। क्षतिग्रस्त मायोमेरेस की संख्या निर्धारित करने के लिए, जो मछली की मांसपेशियों की मेटामेरिक इकाइयाँ हैं, वर्गों की एक श्रृंखला का विश्लेषण किया गया (चित्रा 2)। मायोमेरे सीमाएं, जिन्हें मायोकोमाटा कहा जाता है, को कोलेजन जमाव द्वारा पहचाना गया था, जैसा कि नीले रंग द्वारा पता लगाया गया था। क्षतिग्रस्त क्षेत्रों को नारंगी धुंधलापन की अनुपस्थिति से निर्धारित किया गया था। स्पष्ट मायोकोमाटा के साथ नमूनों की बारीकी से जांच से पता चला कि लगभग चार लगातार मायोमेरेस क्षतिग्रस्त हो गए थे, जैसा कि नारंगी धुंधलापन की कमी से अनुमान लगाया गया था (एन, मछली की संख्या = 4; चित्रा 3 ए, ए')। एक ही मछली के घायल पक्ष ने आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य किया।
शरीर की धुरी के लंबवत घाव की गहराई की जांच करने के लिए, 4 डीपीसीआई और 7 डीपीसीआई पर जेब्राफिश का उपयोग करके ट्रांसवर्सल सेक्शन तैयार किए गए थे। बाद का समय बिंदु मायोजेनिक कार्यक्रम के सक्रियण से मेल खाता है और इस प्रकार, मांसपेशियों के पुनर्जनन की शुरुआत होती है। इन नमूनों के एएफओजी धुंधला होने से शरीर के क्रायोइंजर्ड फ्लैंक में नारंगी धुंधलापन की व्यापक कमी दिखाई दी, जिससे विघटित कंकाल की मांसपेशी (चित्रा 3 बी, सी) के क्षेत्र का निर्धारण हुआ। 4 dpci और 7 dpci पर, घाव क्षेत्र त्वचा से ऊर्ध्वाधर सेप्टम की ओर ऊतकों को फैलाता है। यह दर्शाता है कि क्रायोइंजरी विधि ने पुच्छल पेडुनकल के एक पार्श्व आधे हिस्से को गहराई से लक्षित किया, जो प्रक्रिया के बाद 7 दिनों तक कार्यात्मक मांसपेशियों से रहित रहा। एक साथ लिया गया, पुच्छल पेडुनकल के एक तरफ चार मायोमेरेस गहराई से क्षतिग्रस्त हो गए थे।
ट्रांसवर्सल वर्गों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण।
मांसपेशियों के पुनर्जनन की गतिशीलता का आकलन करने के लिए, मछली के प्रयोगात्मक समूहों को 4 डीपीसीआई, 7 डीपीसीआई, 10 डीपीसीआई और 30 डीपीसीआई पर इच्छामृत्यु दी गई थी। पुच्छल पेडुनकल के ट्रांसवर्सल वर्गों को फैलोइडिन (जो फिलामेंटस एक्टिन [एफ-एक्टिन] को बांधता है), ट्रोपोमायोसिन -1 एंटीबॉडी, जो एक सरकोमेरे प्रोटीन का पता लगाता है, और डीएपीआई, जो नाभिक को लेबल करता है, का उपयोग करके मल्टीकलर फ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा लेबल किया गया था। सभी समय बिंदुओं पर, शरीर के घायल आधे हिस्से ने एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान किया; एफ-एक्टिन और ट्रोपोमायोसिन 1 दोनों को अप्रभावित नियंत्रण भागों में दृढ़ता से पाया गया था, जो क्षतिग्रस्त ऊतक (चित्रा 4) का संकेत देता है।
4 डीपीसीआई पर, पुच्छल पेडुनकल के घायल पक्ष में प्रचुर मात्रा में डीएपीआई-पॉजिटिव कोशिकाएं थीं, लेकिन कोई एफ-एक्टिन और ट्रोपोमायोसिन 1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस नहीं देखा गया था, जो विघटित मांसपेशियों के साथ घाव क्षेत्र का संकेत देता है (चित्रा 4 ए-बी')। 7 डीपीसीआई पर, ट्रोपोमायोसिन 1 और एफ-एक्टिन को ऊर्ध्वाधर शरीर की मध्य रेखा (चित्रा 4 सी-डी') के करीब घाव के एक हिस्से में पाया जा सकता है। यह अभिव्यक्ति पैटर्न उस स्थिति को सीमांकित करता है जहां पुच्छल पेडुनकल में नए मायोफाइबर का गठन शुरू होता है। 10 डीपीसीआई पर, दोनों मांसपेशी मार्कर शरीर की सतह की ओर विस्तारित हुए, जो कंकाल की मांसपेशी के उत्थान की प्रगति का सुझाव देते हैं (चित्रा 4 ई-एफ')। 30 dpci पर, शरीर के दोनों किनारों ने F-actin धुंधला (चित्रा 4G-H') का एक समान वितरण प्रदर्शित किया। यह खोज इंगित करती है कि पुच्छल पेडुनकल के क्रायोइंजरी के बाद कंकाल की मांसपेशी को कुशलतापूर्वक बहाल किया गया था।
चित्रा 1: मायोमेरे क्रायोइंजरी के लिए प्रयोगात्मक सेटअप । (ए) स्टेनलेस स्टील से बने कस्टम-निर्मित क्रायोप्रोब के आयाम। उपकरण के बाहर के हिस्से में ज़ेबराफ़िश शरीर की वक्रता के लिए 1 मिमी की गहराई पर अवतल किनारे के साथ एक स्पैटुला होता है। उपकरण के मध्य भाग में एक सिलेंडर शामिल होता है जो प्रक्रिया के दौरान स्पैटुला के कम तापमान को बनाए रखने के लिए वजन और जलाशय के रूप में कार्य करता है। उपकरण का समीपस्थ छोर एक पतली धातु के हैंडल के रूप में है। (बी, सी) पुच्छल पेडुनकल पर क्रायोप्रोब के साथ एक नम स्पंज पर एनेस्थेटाइज्ड वयस्क मछली। जांच कमरे के तापमान पर थी। (बी) जांच के मार्जिन को मछली और उपकरण के बीच सापेक्ष आकार को प्रदर्शित करने के लिए पुच्छल पेडुकल के आसपास के क्षेत्र में क्षैतिज रूप से रखा जाता है। (सी) क्रायोइंजरी के लिए, उपकरण की नोक मछली के लंबवत स्थित है। (डी) व्यापक तरीके से जोड़तोड़ दिखाने के लिए मछली के उदर पक्ष से क्रायोइंजरी प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। क्रायोप्रोब को तरल नाइट्रोजन में प्रीकूल्ड किया गया था और तुरंत 6 सेकंड के लिए मछली के एक तरफ रखा गया था। (ई) क्रायोइंजरी के बाद एक विशिष्ट समय बिंदु पर, मछली को इच्छामृत्यु दी गई थी, और उनके पुच्छल पेडुनल्स को निर्धारण के लिए एकत्र किया गया था। (एफ) निश्चित सामग्री को हिस्टोलॉजिकल रूप से संसाधित किया गया था और कोरोनल या ट्रांसवर्सल विमानों के साथ विभाजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: शरीर के पृष्ठीय से उदर स्थिति तक पुच्छल पेडुनकल में क्षतिग्रस्त मायोमेरेस का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। क्रायोइंजरी (डीपीसीआई) के बाद 4 दिनों में कोरोनल वर्गों की एक श्रृंखला का एएफओजी धुंधला होना। अनुभाग पृष्ठीय से उदर पक्ष की ओर होते हैं, जैसा कि पहले और अंतिम पैनल के शीर्ष पर दर्शाया गया है। अनुभाग गैर-आसन्न हैं, उनके बीच लगभग 150 μm का अंतराल है। मांसपेशियों के नारंगी धुंधलापन से अघायल मांसपेशियों का पता लगाया जाता है, जबकि घायल ऊतक में इस धुंधलापन का अभाव होता है और भूरे रंग का दिखाई देता है (एक धराशायी रेखा से घिरा हुआ क्षेत्र)। कोलेजन युक्त ऊतक, जैसे कि त्वचा, नीले रंग में दागदार होते हैं। रीढ़ की हड्डी एक रॉड जैसी संरचना के रूप में दिखाई देती है और लाल रंग में सनी होती है। मछलियों की संख्या, n = 4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एएफओजी धुंधला का उपयोग करके पुच्छल पेडुनकल में चोट की गहराई का आकलन। (ए, ए') कोरोनल खंड रीढ़ की हड्डी (एक लाल दाग वाली क्षैतिज रॉड) के स्तर पर है। नीचे की छवि ऊपरी छवि में एक फ्रेम के साथ शामिल एक आवर्धित क्षेत्र दिखाती है। अनुक्रमिक मायोमेरे सीमाएं रीढ़ की हड्डी (आवर्धित छवि ए' में लाल तीर) पर तिरछी रूप से स्थित कोलेजनस धारियों (नीले) के रूप में दिखाई देती हैं। (बी, सी) क्रॉस-सेक्शन नारंगी दाग वाली मांसपेशियों के साथ अघायल फ्लैंक और भूरे रंग के धुंधलापन के साथ क्रायोइंजरी फ्लैंक प्रदर्शित करते हैं। क्षतिग्रस्त क्षेत्र को एक काली डैश्ड लाइन से घेर लिया गया है। ऊर्ध्वाधर सेप्टम (एक लाल डैश्ड लाइन के साथ चित्रित) शरीर को नियंत्रण और क्रायोइंजर्ड पक्षों में विभाजित करता है। मछली की संख्या, n = 4 प्रति समय बिंदु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: क्रायोइंजरी के बाद मांसपेशियों के प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट पता लगाना। 4 डीपीसीआई, 7 डीपीसीआई, 10 डीपीसीआई, और 30 डीपीसीआई पर क्रॉस-सेक्शन का फ्लोरेसेंस धुंधलापन, जैसा कि बाईं ओर और पैनलों के शीर्ष (ए-बी') पर लेबल किया गया है। 4 डीपीसीआई पर, घायल ऊतक (डैश्ड लाइन से घिरा हुआ) डीएपीआई-पॉजिटिव (नीला) होता है, लेकिन फैलोइडिन स्टेनिंग (हरा) या ट्रोपोमायोसिन -1 विकृति (लाल) से रहित होता है, जो क्रायोइंजरी के बाद मांसपेशी फाइबर के अध: पतन का सुझाव देता है। (C-D') 7 डीपीसीआई पर, दोनों मांसपेशी मार्कर घायल क्षेत्र में उत्तरोत्तर उभरते हैं, जो पुनर्योजी प्रक्रिया का संकेत देते हैं। ट्रोपोमायोसिन -1 नवगठित तंतुओं में एफ-एक्टिन की तुलना में अधिक तीव्र दिखाई देता है। (E-F') 10 डीपीसीआई पर, चोट क्षेत्र नए मायोफाइबर से भरा होता है जो एफ-एक्टिन की तुलना में ट्रोपोमायोसिन -1 विकृति की उच्च तीव्रता प्रदर्शित करता है। (G-H') 30 dpci पर, शरीर के दोनों किनारों में मायोफाइबर का एक समान पैटर्न पाया जाता है। पैनल ए, सी, ई और एच में फ्रेम उन क्षेत्रों को शामिल करते हैं जो दाईं ओर आसन्न छवियों में आवर्धित होते हैं। त्वचीय तराजू, मायोमेरे के बाहर प्रतिदीप्ति से निकलते हुए, एडोब फोटोशॉप का उपयोग करके छवियों से मिटा दिए गए थे। मछली की संख्या, n = 4 प्रति समय बिंदु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
जेब्राफिश मांसपेशियों के पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक एनामियोट कशेरुक मॉडल जीव प्रदान करता है। अधिकांश मौजूदा चोट विधियों, जैसे कि लेजर एब्लेशन या चाकू घाव, के परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत मामूली ऊतक व्यवधान20,21,22,23 होता है। एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशी26 पर प्रमुख शोधन आयोजित किए गए हैं। हालांकि, शरीर की दीवार को काटने के स्वास्थ्य खतरों के कारण यह सर्जिकल दृष्टिकोण शायद पार्श्व मांसपेशियों के लिए कम उपयुक्त होगा। इस तरह की आक्रामक प्रक्रियाओं से बचने के लिए, यह प्रोटोकॉल चोट के एक हल्के रूप का वर्णन करता है, जिसके परिणामस्वरूप, पुच्छल पेडुनकल को गहरा नुकसान होता है। यह दृष्टिकोण एक सतही हेरफेर पर निर्भर करता है जो शरीर के एक तरफ कुछ मायोमेरेस के बहुत सटीक लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है। क्रायोइंजरी मॉडल की ताकत इसकी प्रजनन क्षमता और व्यापक मांसपेशी अध: पतन का उत्पादन करने की क्षमता में निहित है; इन शक्तियों के आधार पर, यह मॉडल अध्ययन करने के लिए एक नया मार्ग प्रदान करता है कि शरीर महत्वपूर्ण मांसपेशियों के नुकसान पर कैसे प्रतिक्रिया करता है।
अत्यधिक ठंड के आवेदन से थर्मल झटका होता है, जो प्रभावित मांसपेशी ऊतक27 में प्लाज्मा झिल्ली और ऑर्गेनेल को नष्ट कर देता है। नतीजतन, घायल मायोफाइबर "आकस्मिक" कोशिका मृत्युसे गुजरते हैं। नतीजतन, क्षतिग्रस्त ऊतक को घाव निकासी के प्राकृतिक तंत्र द्वारा पुनर्जीवित किया जा सकता है। ज़ेबराफ़िश क्रायोइंजरी प्रक्रिया को अच्छी तरह से सहन करती है, क्योंकि इस अध्ययन में जीवित रहने की दर लगभग 100% थी, यह देखते हुए कि प्रीकूल्ड जांच को सटीक अवधि के लिए शरीर पर सही ढंग से तैनात किया गया था। हालांकि, यदि घाव बहुत व्यापक है (उदाहरण के लिए, यदि बहुत अधिक दबाव लागू किया जाता है या क्रायोइंजरी की अवधि बहुत लंबी होती है), तो प्रक्रिया के तुरंत बाद मछली असामान्य तैराकी आंदोलनों को प्रदर्शित कर सकती है, और जानवर को मानवीय समापन बिंदु के रूप में इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। अन्य मछली प्रजातियों के लिए, क्रायोप्रोब के संपर्क समय को शरीर के आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
क्रायोइंजरी के बाद, मछली असामान्य आंदोलन के किसी भी लक्षण के बिना अपनी तैराकी गतिविधि को फिर से शुरू कर सकती है। हालांकि, क्रायोघायल मछली नियंत्रित मछली की तुलना में कम गतिशील रूप से तैरती है, जो कुछ हल्के हानि को इंगित करती है। क्रायोइंजरी के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर मछली के व्यवहार का आगे परिमाणीकरण तैराकी प्रदर्शन में अस्थायी परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक होगा।
पुच्छल पेडुनकल के अन्य गैर-मांसपेशी ऊतकों पर क्रायोइंजरी विधि का प्रभाव स्पष्ट किया जाना बाकी है। जाहिर है, प्रक्रिया से शरीर की सबसे बाहरी परत (यानी, त्वचा) क्षतिग्रस्त हो जाती है। इस संदर्भ में, क्रायोइंजरी विधि घाव भरने, पैमाने पर पुनर्जनन और रंजकता पैटर्न की बहाली का अध्ययन करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, मायोमेरेस के वाहिका और संक्रमण भी क्रायोइंजरी से प्रभावित हो सकते हैं, और इन विषयों को आगे की जांच की आवश्यकता होती है।
क्रायोइंजरी मॉडल का उपयोग पहले जेब्राफिश हृदय पुनर्जनन13,14,15,29 की जांच के लिए किया गया है। इस विधि ने कोलेजन युक्त निशान के क्षणिक जमाव के कारण वेंट्रिकुलर रिसेक्शन विधि10 की तुलना में कुछ फायदे दिखाए,जो मनुष्यों में इन्फ्रैक्ट उपचार प्रतिक्रिया की बेहतर नकल करता है। उल्लेखनीय रूप से, जेब्राफिश कई क्रायोइंजरी31 के बाद अपने दिल को पुनर्जीवित कर सकती है। दिलचस्प बात यह है कि क्रायोइंजरी को ज़ेबराफिश फिन पर भी लागू किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप हिस्टोलाइटिक प्रक्रियाएं12 हैं। शास्त्रीय पंख विच्छेदन के विपरीत, शेष क्रायोइंजर्ड स्टंप में मृत सामग्री और स्वस्थ कोशिकाओं के मिश्रण के साथ एक विकृत मार्जिन होता है। जेब्राफिश अंगों, हृदय और पंख दोनों के साथ अध्ययन ने व्यापक ऊतक क्षति के बाद भी अपने मूल कार्यात्मक घटकों को बहाल करने के लिए ज़ेबराफिश की शक्तिशाली क्षमता का खुलासा किया है। क्रायोघायल कंकाल की मांसपेशी पुनरावर्ती और पुनर्योजी प्रक्रियाओं के बीच एक अंतःक्रिया को सक्रिय करती है या नहीं, भविष्य के अध्ययन की आवश्यकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम मछली की देखभाल के लिए वी ज़िमर्मन, साथ ही डॉ थॉमस बिसे, डॉ कैथरीन फेफरली और ली गिगन को इस परियोजना की शुरुआत और उनके प्रारंभिक परिणामों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन, अनुदान संख्या 310030_208170 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
| Material/ Equipment | |||
| 35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
| Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
| Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
| Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Surgical scissors | Any | / | |
| TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
| Dyes and Antibodies | |||
| Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
| Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
| Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
| Recipies/Solutions | |||
| 1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
| 2.7 mM KCl | Sigma | ||
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
| AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
| 2 g Orange G | Sigma | ||
| 1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
| 200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
References
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