Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Et validerbart dråbe digitalt polymerasekædereaktionsassay til påvisning af adeno-associerede virale vektorer i bioshedding undersøgelser af tårer

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65495
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cell and Gene Therapy, KCAS Bioanalytical and Biomarker Services

Summary

Her præsenterer vi en protokol til udvikling og validering af god laboratoriepraksis i overensstemmelse med påvisning af adeno-associerede virale vektorer i humane tårer ved dråbe digital polymerasekædereaktion til støtte for klinisk udvikling af genterapivektorer.

Abstract

Brugen af virale vektorer til behandling af genetiske sygdomme er steget betydeligt i de senere år, med over 2.000 undersøgelser registreret til dato. Adeno-associerede virale (AAV) vektorer har fundet særlig succes i behandlingen af øjenrelaterede sygdomme, som eksemplificeret ved godkendelsen af voretigene neparvovec-rzyl. For at bringe nye terapier på markedet anmoder reguleringsagenturer typisk om kvalificerede eller validerede bioshedding-undersøgelser for at evaluere frigivelsen af vektoren i miljøet. Imidlertid er ingen officielle retningslinjer for udvikling af molekylærbaserede assays til støtte for sådanne kaste undersøgelser blevet frigivet af United States Food and Drug Administration, hvilket efterlader udviklere til at bestemme bedste praksis for sig selv. Formålet med denne protokol er at præsentere en validerelig protokol til påvisning af AAV-vektorer i humane tårer ved dråbedigital polymerasekædereaktion (ddPCR) til støtte for kliniske bioafgivelsesundersøgelser. Dette manuskript diskuterer aktuelle industrimetoder til validering af molekylært assay og demonstrerer, at metoden overstiger de kriterier for accept af målassay, der i øjeblikket foreslås i hvidbøger. Endelig diskuteres trin, der er kritiske i udførelsen af ethvert ddPCR-assay, uanset anvendelse.

Introduction

Genterapidefinitionerne varierer, men inducerer generelt en tilsigtet og ofte forventet permanent veksling af en specifik DNA-sekvens af det cellulære genom for at modificere eller manipulere ekspressionen af et gen eller for at ændre en levende celles biologiske egenskaber til et klinisk formål 1,2. Virale vektorer bruges i stigende grad som køretøjer til genterapi på grund af deres effektivitet ved transduktion, med en rapport, der tyder på, at over 70% af de nuværende kliniske forsøg med genterapi bruger virale vektorer3. Interessen for virale vektorer til genterapi har været stigende. Kvartalsdatarapporten for kvartal 4 2022 om gen-, celle- og RNA-terapilandskabet fra American Society of Gene and Cell Therapy rapporterede, at i 2022 voksede gen-, celle- og RNA-terapipipelinen fra præklinisk til præregistrering med 7%, hvilket bragte det samlede antal terapier under udvikling til 3,726, hvoraf 2,053 (55%) var genterapier4. United States Food and Drug Administration (USA FDA) har i øjeblikket godkendt 27 celle- og genterapier til klinisk brug hos mennesker, hvoraf fem specifikt udnytter virale vektorer5.

Adeno-associerede vira (AAV'er) har fået særlig interesse som køretøjer til genterapi. En nylig metaanalyse afslørede, at der har været ca. 136 kliniske forsøg, der undersøger brugen af AAV'er i de sidste to årtier6. Derudover er tre af de fem FDA-godkendte genterapier i USA AAV-baserede. Dette skyldes deres meget redigerbare natur, brede værtsområde, der kan indstilles baseret på brugen af specifikke naturligt forekommende eller kunstigt konstruerede vektorer, lav patogenicitet og toksicitet hos mennesker og generelt lav immunogenicitet 7,8. AAV'er er også blevet anvendt med succes til behandling af okulære sygdomme i en godkendt klinisk indstilling. Voretigene neparvovec-rzyl er en AAV2-baseret terapi, der blev godkendt af USA FDA i 2017 og af Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) i 2018 til behandling af biallelic RPE65 mutationsassocieret retinal dystrofi9.

Med stigende interesse for udviklingen af AAV-baserede terapier kommer behovet for lovgivningsmæssig vejledning om assays. Nøjagtig påvisning og kvantificering af enhver viral vektor er en integreret del af opdagelses-, fremstillings- og prækliniske/kliniske testfaser af produktudvikling. USA FDA er begyndt at udstede nogle retningslinjer for genterapier, herunder om kemi, fremstilling og kontrol til human genterapi forsøgsmæssige nye lægemiddelapplikationer 10, langsigtet opfølgning efter administration af genterapi 11, replikationskompetent retrovirustest12 og anbefalinger til mikrobielle vektorer, der anvendes i genterapier 13. EMA har også udgivet en række retningslinjer vedrørende udvikling af genterapiprodukter, der generelt er i overensstemmelse med FDA's anbefalinger, selv om der er visse forskelle14. Det er vigtigt at bemærke, at selv om disse retningslinjer ikke fastlægger juridisk bindende ansvar, undtagen hvor der henvises til specifikke regler, giver de klarhed om reguleringsagenturernes aktuelle tænkning om emnet og deres forventninger til analyser, der kræves til lægemiddelarkivering og myndighedsgodkendelse.

FDA anbefaler specifikt, at der udføres undersøgelser for at vurdere fordelingen, persistensen og clearance af en vektor fra administrationsstedet for at målrette okulært og ikke-okulært væv, intraokulære væsker og blod15. Disse tager form af biodistributions- og kasteundersøgelser. Biodistributionsundersøgelser evaluerer eksponering ved at undersøge, hvordan et produkt spredes gennem en patients krop fra administrationsstedet. Shedding evaluerer specifikt frigivelsen af produktet fra patienten til miljøet og øger muligheden for overførsel af vektoren til ubehandlede individer16. FDA fremsætter anbefalinger til design af biodistributions- og kasteundersøgelser med hensyn til hyppigheden af prøveindsamling, varigheden af prøveindsamlingen, typer af indsamlede prøver og opbevaringsbetingelser.

Derudover anbefaler FDA brugen af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR eller PCR i realtid) til kvantitativ påvisning af vektorgenomer på grund af dets lette ydeevne, format med høj kapacitet, hurtige omdrejningstider og analysefølsomhed. Der er dog en relativ mangel på anbefalinger til design og ydeevnevurdering af molekylære metoder sammenlignet med dem, der findes for små og store molekyler. Mange af retningslinjerne for sådanne undersøgelser er vanskelige at anvende på molekylære metoder på grund af det unikke og komplekse design af både produkterne og selve analyserne, hvilket rejser spørgsmål om hensigtsmæssigheden af de tilgængelige platforme til de anbefalede vurderinger og passende metoder til validering af assay. Til dato har FDA ikke krævet formel validering af PCR-baserede assays, selvom EMA har pålagt dette krav17. I lyset af dette tomrum har forskellige grupper og workshops udstedt hvidbøger og anbefalinger, som producenter og kontraktforskningsorganisationer har forsøgt at følge 18,19,20,21,22,23,24,25. De fleste af disse anbefalinger er skrevet specifikt med qPCR-assays i tankerne, med forslag eller ændringer til nye platforme, såsom dråbe digital PCR (ddPCR), kun inkluderet som det anses for relevant. Nyere anbefalinger har fokuseret på overvejelser om ddPCR-assays, men har stort set fokuseret på deres anvendelser til vektorgenomkvantificering i en fremstillingsindstilling snarere end i de komplekse biologiske matricer, der er stødt på i bioshedding-undersøgelser.

Afhængigt af klinisk anvendelse og mål kan ddPCR foretrækkes frem for qPCR til støtte for biodistributions- og afgivelsesundersøgelser på grund af ddPCR's øgede følsomhed og evne til at håndtere matrixinterferens sammenlignet med qPCR. På grund af opdelingen af prøver i ca. 20.000 dråber kan der desuden opnås nøjagtig kvantificering af kopinummeret uden brug af en standardkurve ved hjælp af Poisson-statistik, hvilket forenkler metodeudvikling og validering. Målet med denne protokol er at beskrive en standardiseret tilgang til udvikling og validering af en ddPCR-baseret metode til påvisning af AAV-vektorer i tårer indsamlet fra den okulære overflade til støtte for kliniske bioshedding-undersøgelser.

Protocol

1. Fremstilling af et syntetisk DNA-fragment

  1. Design og bestil et syntetisk DNA-fragment indeholdende målamplifikationsområdet til brug som kvalitetskontrol.
    1. Sørg for, at sekvensen indeholder hele amplion sekvensen fra den forreste primer til den omvendte primer af målgenet af interesse, med en forlængelse af fire til seks basepar sekvens i de 5' ender af hver primerbindingssekvens.
    2. Undgå homopolymerer af adenin og thymin større end 12 basepar eller guanin- og cytosinbasepar større end otte basepar, da lange homopolymerer kan forstyrre syntesen af genfragmentet.
      BEMÆRK: Hvis amplicons indeholder sådanne sekvenser, kan baseudskiftninger foretages, så længe udglødningsstederne for primere og sonder opretholdes.
    3. Alternativt fremstilles et lineært plasmid indeholdende amplicon ved hjælp af typiske kloningsstrategier.
  2. Centrifuger røret indeholdende det syntetiske DNA-fragment i en mikrocentrifuge i ~ 10 s for at sikre, at materialet opsamles i bunden af røret.
  3. Det syntetiske DNA-fragment resuspenderes ved hjælp af tris-EDTA-buffer (TE) til en koncentration på 1,0 × 1010 kopier/μL eller, alt efter hvad der er relevant, baseret på målanalyseområdet.
  4. Vortex kort, inkuber derefter ved 50 °C i 20 ± 5 minutter. Cool på is.
  5. Der fremstilles flere, ideelt set alikvoter til engangsbrug, og opbevares ved -70 til -90 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Syntetiske DNA-fragmenter fremstillet på denne måde er typisk stabile i mindst 24 måneder fra datoen for resuspension.
  6. Hvis det ønskes, bestemmes den nøjagtige koncentration af den fremstillede syntetiske DNA-stamme inden brug som kvalitetskontrol, eller den nominelle koncentration estimeres baseret på den anvendte resuspension.

2. Forberedelse af primere og sonde

  1. Design og bestil primere og en hydrolysesonde til at målrette mod det ønskede forstærkningsområde ved hjælp af typiske designstrategier26,27.
    1. Brug et 5' fluorescerende reporterfarvestof (f.eks. FAM) og en 3' quencher (f.eks. Iowa Black dark quencher), der er kompatibel med ddPCR-systemet.
      BEMÆRK: Der findes adskillige softwarepakker til PCR-analysedesign, og alle kan bruges. For eksempel anvendes Primer-BLAST af National Center for Biotechnology Information28 i vid udstrækning på grund af de robuste muligheder for analysedesign og den lethed, hvormed specificitet kan vurderes bioinformatisk for at identificere mulige effekter uden for målet. Det skal bemærkes, at forberedelsen af primere og sonder kan variere fra de trin, der er anført her, afhængigt af det format, de leveres i.
  2. Centrifuger rørene indeholdende den forreste primer, omvendt primer og sonde i en mikrocentrifuge i ~ 10 s for at pelletere materiale til bunden af røret.
  3. Resuspender primerne til 20 μM ved hjælp af TE-buffer. Vortex kort.
  4. Sonden resuspenderes til 10 μM ved hjælp af TE-buffer. Vortex kort.
  5. Der fremstilles flere, ideelt set engangsprøver, og opbevares ved mindst -20 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Primere og sonder fremstillet på denne måde er typisk stabile i mindst 24 måneder fra datoen for resuspension.

3. Forberedelse af prøvefortyndingsbuffer

  1. Optø PCR-buffer og klippet laksesæd-DNA ved stuetemperatur. Vortex grundigt at blande.
  2. Der udarbejdes en prøvefortyndingsbuffer i henhold til tabel 1.
  3. Vortex grundigt. Opbevares ved 2-8 °C i op til 1 måned efter tilberedning.

Tabel 1: Forberedelse af prøvefortyndingsbuffer. Klik her for at downloade denne tabel.

4. Forberedelse af mastermix

  1. Optø ddPCR-masterblandingen til sonder, fremadgående primer, omvendt primer og sonde ved stuetemperatur, og lad den varme i mindst 10 minutter efter optøning inden brug. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
    BEMÆRK: Disse reagenser skal bringes helt til stuetemperatur for at sikre effektiv dråbedannelse. Hold ikke reagenser på is under tilberedningen.
    1. Vortex centrifugeres grundigt og kort i en minicentrifuge inden brug.
      BEMÆRK: Restriktionsenzymer leveres typisk i glycerol og skal fjernes fra opbevaring umiddelbart før brug. Bland forsigtigt. Må ikke hvirvel.
  2. Forbered en PCR-masterblanding for hvert forstærkningsmål. Se tabel 2 for en foreslået PCR-masterblandingssammensætning, og rediger koncentrationerne af primere og sonder efter behov.
    1. Hvirvelstrømmen grundigt og centrifugeres kortvarigt før tilsætning af restriktionsenzym. Tilsæt restriktionsenzymet og inverter for at blande.
      BEMÆRK: I dette trin kræves 22 μL PCR-reaktion for at opnå et slutvolumen på 40 μL PCR-reaktion efter dråbedannelse (bestående af 15 μL PCR-masterblanding, 5,0 μL skabelon og 20 μL dråbegenereringsolie).
  3. Tilsæt 16,5 μL masterblanding til hvert hul i henhold til pladekortet. Se figur 1 for et eksempel på et pladekort for en valideringsnøjagtighed og præcisionskørsel.
    1. Sørg for, at en plade indeholder tre uafhængige præparater af kvalitetskontrolserien (QC), tre uafhængigt testede endogene tårealikvoter, der er testet, spiket til et højt og lavt niveau og unspiked, og tre uafhængige ingen skabelonkontroller (NTC'er).
    2. Varier layoutet af disse brønde på tværs af pladen, hvor sæt 1 er fyldt i rækkefølge efter faldende koncentration, sæt 2 er fyldt i rækkefølge efter stigende koncentration, og sæt 3 er indlæst i tilfældig rækkefølge for at vurdere, om der er nogen pladeplaceringsspecifikke effekter.
    3. Matrix prøverne for at fylde så meget af en kolonne som muligt og fylde ubrugte brønde i en kolonne med kontrolbuffer. Medtag flere endogene kontrolpartier (f.eks. Flere puljer af tårer eller tårer indsamlet fra enkeltpersoner) i de resterende brønde, hvis det ønskes.
    4. Forsegl pladen med klar klæbende film. Hold pladen ved stuetemperatur under forberedelsen af skabelonen. Alternativt kan du holde pladen i op til 4 timer ved 2-8 °C, men bringe den tilbage til stuetemperatur i mindst 10 minutter før skabelontilføjelse.

Tabel 2: Eksempel på forberedelse af PCR-mastermix. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på pladekort til valideringsnøjagtighed og præcisionskørsel. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Forberedelse af QC'er

  1. Optø syntetiske DNA-fragmenter eller lineære plasmider ved stuetemperatur og lad dem varme op i mindst 10 minutter efter optøning før brug. Bring skabelonerne til stuetemperatur for at sikre effektiv dråbedannelse.
    1. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug. Vortex centrifugeres grundigt og kort i en minicentrifuge inden brug.
  2. Der fremstilles QC-fortyndinger ved hjælp af prøvefortyndingsbufferen som fortyndingsmiddel. Et eksempel på de anbefalede koncentrationer som forberedelse til en valideringsnøjagtighed og præcisionskørsel er vist i tabel 3.
    BEMÆRK: Efter en vellykket gennemførelse af nøjagtighed og præcisionskørsler behøver kun den høje kvalitetskontrol (HQC), medium kvalitetskontrol (MQC) og lav kvalitetskontrol (LQC) køres på hver plade. For nøjagtighed og præcisionskørsler er mindst tre uafhængige fortyndinger af QC'erne inkluderet til vurdering af intra-assay-nøjagtighed og præcision. Efter nøjagtighed og præcisionskørsler er det kun nødvendigt at medtage én fortyndingsserie.
  3. Efter tilberedning opbevares fortyndingerne ved stuetemperatur, indtil de tilsættes pladen.
  4. Opbevar fortyndingerne på is eller ved 2-8 °C, hvis det er nødvendigt. Før efterfølgende brug skal fortyndingerne opvarmes til stuetemperatur i mindst 10 minutter før brug. Kassér QC'erne i slutningen af dagen.

Tabel 3: Eksempel på kvalitetskontrol (QC) forberedelse ved anvendelse af syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

6. Forberedelse af prøver

  1. Optø tåreprøver indsamlet fra et klinisk forsøg ved stuetemperatur, indtil de er optøet, og lad dem varme op i mindst 10 minutter efter optøning før brug.
    1. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug. Vortex centrifugeres grundigt og kortvarigt i en mikrocentrifuge inden brug.
  2. Fortynd tåreprøver 1:10 (eller mere) ved hjælp af prøvefortyndingsbuffer som fortyndingsmiddel i 0,2 ml PCR-rør eller 8-brønds PCR-strimler. Forsegl rørene.
    BEMÆRK: Afhængigt af den forventede koncentration af målet i tårer kan det være nødvendigt at fortynde prøverne yderligere eller at teste flere fortyndinger af hver prøve.
  3. Prøverne opvarmes i en termisk cyklist ved 95 °C i 10 minutter, hvorefter de opbevares ved 4 °C i mindst 5 minutter for at afkøle. Brug en rampehastighed på 3 °C/s.
    BEMÆRK: Prøver kan forblive i den termiske cyklist ved 4 °C indtil brug samme dag eller kan fryses ved -70 til -90 °C for længere opbevaring. Dette trin tjener til at denaturere vektorkapsidet og frigive genomet. Da QC-syntetiske DNA-fragmenter eller lineariserede plasmider er dobbeltstrengede, bør de ikke gennemgå dette opvarmningstrin.
  4. Prøverne efter afkøling sættes tilbage til stuetemperatur (eller, hvis de er frosne, tø op ved stuetemperatur), og de opvarmes i mindst 10 minutter.
    BEMÆRK: Prøverne skal bringes helt til stuetemperatur for at sikre effektiv dråbedannelse.

7. Tilføjelse af skabelon

  1. Hent ddPCR-pladen, der indeholder masterblandingen. Hver prøve eller QC-fortyndingsrør centrifugeres grundigt og kortvarigt for at opsamle materialet.
  2. Fjern klæbende film, og tilsæt 5,5 μL QC'er eller prøver til passende brønde på 96-brøndpladen i henhold til pladekortet.
    BEMÆRK: Se trin 4.2.1 for forklaring af de krævede mængder
  3. Der tilsættes 5,5 μL prøvefortyndingsbuffer til NTC-hullerne.
  4. Dråbegenerering kræver, at alle brønde i en søjle har en reaktions- eller bufferkontrol. Hvis nogen huller i en søjle ikke indeholder prøvereaktioner, fortyndes 2x ddPCR-bufferkontrol 1:2 med nukleasefrit vand. Tilføj 22 μL 1x ddPCR-bufferkontrol til alle tomme huller i en kolonne.
    BEMÆRK: Hvis en hel kolonne ikke bruges, er det ikke nødvendigt at tilføje bufferkontrol til disse huller.
  5. Tilsæt en gennemborbar folieforsegling til pladen. Pladen anbringes i pladelukkeren og forsegles i 5 s ved 180 °C.
    1. Alternativt kan du forsegle pladen i overensstemmelse med ddPCR-systemproducentens anbefalinger.
  6. Hvirvelpladen roterer ved maksimal hastighed i mindst 30 s (ved hjælp af den kontinuerlige hvirvelindstilling; brug ikke berøringshvirvel) og centrifuger kortvarigt i en pladespinner.
    BEMÆRK: Grundig og fuldstændig blanding af pladen på dette trin er afgørende for korrekt opdeling af PCR-reaktionen i dråber. Sørg for, at der ikke er synlige bobler i brøndene. Om nødvendigt kan pladen holdes ved 2-8 °C før dråbedannelse i højst 4 timer. Hvis den holdes, skal du lade pladen komme til stuetemperatur i mindst 10 minutter før dråbedannelse.

8. Automatiseret dråbegenerering, termisk cykling og dråbeaflæsning

  1. Generer dråber i den automatiserede dråbegenerator som følger.
    1. På den berøringsfølsomme skærm skal du vælge kolonnerne på pladekortet, der indeholder prøver. Instrumentets dæk lyser for at indikere, hvilke forbrugsstoffer (DG32 patroner, spidser, affaldsbeholder, dråbegenereringsolie) der kræves. Gule lys angiver, at det er nødvendigt at tilføje en forbrugsvare, mens grønne lys angiver, at der er tilstrækkelige forbrugsstoffer til rådighed.
    2. Indlæs dråbegeneratoren bagfra og forfra.
    3. For hydrolyseprober skal du sørge for, at dråbegenereringsolien til sonder er installeret, og at der er tilstrækkelig olie til antallet af brønde tilbage. Hvis der anvendes alternative PCR-kemikalier, skal du sikre dig, at der er installeret en kompatibel dråbegenereringsolie.
    4. Læg en kold blok i dråbepladeholderen. Sørg for, at blokken er helt blå, og at der ikke er nogen lyserød farve. Anbring en ny 96-brønds ddPCR-plade i den kolde blok.
    5. Anbring den forberedte PCR-plade i prøvepladeholderen. Luk maskinens låg. Tryk på start for dråbegenerering.
  2. Efter dråbedannelse overføres i alt 40 μL pr. reaktion automatisk til den nye PCR-plade.
  3. Inden for 30 minutter efter afslutningen af dråbedannelsen fjernes pladen med dråberne fra den kolde blok. Arbejd forsigtigt, da dråberne er mest skrøbelige på dette stadium.
  4. Tilsæt en gennemborbar folieforsegling til pladen. Pladen anbringes i pladelukkeren og forsegles i 5 s ved 180 °C.
    1. Alternativt kan du forsegle pladen i overensstemmelse med ddPCR-systemproducentens anbefalinger.
  5. Anbring pladen i en kompatibel termisk opvaskemaskine. Indtast cykelforholdene (se tabel 4).
  6. Efter afslutningen af termisk cykling skal pladen holdes i termisk cyklist, overføres til 2-8 °C, eller den aflæses med det samme.
    BEMÆRK: Hvis pladen holdes i 12 timer ved 4-12 °C, kan dråbetallet forbedres, men det er ikke nødvendigt. Tilstrækkelige dråber skal opnås uden hold.
  7. Læg pladen i dråbelæseren, og sørg for, at der er tilstrækkelig aflæserolie tilbage, og at affaldsbeholderen har tilstrækkelig plads. Læs dråberne. Udfør dråbeaflæsning inden for 24 timer efter start af termisk cykling.

Tabel 4: Typiske termiske cykelforhold. Klik her for at downloade denne tabel.

9. Analyse af data

BEMÆRK: Mindst 10.000 dråber pr. Brønd er nødvendig for korrekt beregning af koncentration ved hjælp af Poisson-statistik. Forsøg ikke at analysere brønde med færre end 10.000 dråber.

  1. Der kræves en tærskel for at definere dråberne som positive eller negative. ddPCR-analysesoftwaren anvender automatisk en tærskel, der kan variere på tværs af brønde. Indstil dog manuelt en tærskel for alle huller på pladen lidt over NTC-brøndenes fluorescerende intensitet for at opnå mere konsistente, nøjagtige og præcise resultater.
    BEMÆRK: Korrekt placering af tærsklen kan kræve optimering afhængigt af adskillelsen af de positive og negative dråber, og hvor meget dråberegn der findes (se figur 2). I dette eksempel viser dråbeamplitudegrafen eksempelbrønde på hvert QC-niveau og NTC. Den lilla linje angiver en tærskel på 1.000, sat lidt over den negative dråbepopulation.
  2. Poisson statistisk modellering kræver mindst tre positive dråber for at beregne koncentrationen med 95% sikkerhed. Betragt alle brønde, der indeholder nul, en eller to positive dråber, som negative og indstillet til en koncentration på nul27.
  3. Beregn kopinummeret i hver riveprøve igen.
    1. Koncentrationen i kopier/μL fremgår af datarapporten. Brug denne værdi til at bestemme koncentrationen i kopier/μL af den oprindelige prøve (dvs. i tåreprøven).
    2. For at beregne ddPCR-reaktionsfortyndingen divideres det indledende PCR-reaktionsvolumen før dråbedannelse med det tilføjede skabelonvolumen. Når de mængder, der præsenteres i denne metode, udnyttes, giver dette en værdi på 4.
      Equation 1
    3. Den serielle fortyndingsfaktor bestemmes ud fra den oprindelige prøve (trin 6.2).
    4. For at bestemme kopierne/μL i prøven multipliceres kopierne/μL med ddPCR-reaktionsfortyndingen og derefter med den serielle fortyndingsfaktor. F.eks. var koncentrationen i kopier/μL genereret i datarapporten 966; 5,5 μL skabelon blev tilsat pr. 22 μL reaktion. En 1:50.000 seriel fortynding af prøven blev anvendt.
      Equation 2
      Equation 3
    5. Hvis flere fortyndinger af den samme prøve blev testet, skal du analysere alle gyldige fortyndinger inden for området og beregne gennemsnittet.
  4. For hver QC beregnes de forventede kopier/μL PCR-reaktion ved at dividere koncentrationen af den givne QC-fortynding (i kopier/μL) med ddPCR-reaktionsvolumen (20 μL). Dette giver mulighed for direkte sammenligning af denne nominelle værdi med kopierne/μl-værdien i datarapporten uden yderligere beregninger.
    BEMÆRK: Denne fremgangsmåde blev også brugt til analyse af de spikede tåreprøver, der blev brugt i de repræsentative resultater.
  5. Middelværdien, standardafvigelsen, variationskoefficienten (%CV) og den procentvise relative fejl i forhold til prøvens eller QC-værdiens nominelle koncentration (%RE) bestemmes ved hjælp af replikationshullerne (multipel fortynding, hvis det er relevant).
    1. Til vurdering af præcision mellem brønde bestemmes dette for hver af brøndduplikaterne, hvis de medtages.
    2. Til vurdering af intra-assay-nøjagtighed og præcision bestemmes dette for hver fortyndingsserie eller alikvote, der anvendes i en batch.
    3. Til vurdering af interassaynøjagtighed og præcision bestemmes dette ved hjælp af intraassay-midlerne for hver af de inkluderede batcher.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på fastsættelse af tærskelværdi. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

10. Kriterier for accept af analyser

  1. Brug følgende specifikationer til de beregnede data for hver batch for at afgøre, om batchen er acceptabel. Hvis disse betingelser ikke er opfyldt, ugyldiggøres batchen og gentages.
    BEMÆRK: Disse kriterier blev bestemt som konsensus fra offentliggjorte hvidbøger om PCR-baseret assayvalidering 18,19,20,21,22,23,24,25. Det kan være nødvendigt at ændre målkriterierne, hvis det er relevant for klinisk anvendelse.
  2. Intet skabelonkontrolelement (NTC)
    1. Sørg for, at hver NTC-brønd har mindst 10.000 dråber.
    2. Sørg for, at hver NTC-brønd har mindre end 3 positive dråber.
  3. QC'er og analyseområde
    1. Sørg for, at hver QC-brønd har mindst 10.000 dråber.
    2. Sørg for, at præcisionen af replikate brønde med en QC-koncentration er ≤25,0% CV, undtagen ved de øvre og nedre kvantificeringsgrænser, hvor ≤30,0% er acceptabelt. Vurder dette uafhængigt for hvert QC-sæt og koncentrationsniveau.
    3. Sørg for, at den relative fejl i den tilbageregnede koncentration ved hvert gennemsnitligt QC-niveau ligger inden for ±25,0 % RE af den nominelle koncentration (kopier/PCR-reaktion), undtagen ved de øvre og nedre kvantificeringsgrænser, hvor ±30,0 % RE kan accepteres. Vurder dette uafhængigt for hvert QC-sæt og koncentrationsniveau.
    4. Sørg for, at mindst 2/3 af QC-prøverne (f.eks. fire ud af seks resultater) og 50% af QC-prøverne på hvert niveau (lav, medium, høj) opfylder disse retningslinjer.
  4. Prøver
    1. Sørg for, at prøvebrøndene, der skal analyseres, har mindst 10.000 dråber.
    2. Sørg for, at præcisionen af replikate brønde i en prøvefortynding, der skal analyseres, er ≤25,0% CV.
    3. Sørg for, at mindst én inkluderet fortynding af den givne prøve ligger inden for det definerede kvantificeringsområde for assayet som defineret ovenfor baseret på QC'erne for øvre og nedre grænse.
    4. Hvis alle fortyndinger omfattede giver resultater, der er større end den fastsatte øvre bestemmelsesgrænse, og hvis der stadig er et tilstrækkeligt prøvevolumen, gentages analysen med en højere fortynding af prøven.
    5. Hvis alle medtagne fortyndinger giver et resultat, der er lavere end bestemmelsesgrænsen, og hvis der stadig er et tilstrækkeligt prøvevolumen, gentages analysen med en lavere fortynding af prøven.
      BEMÆRK: Prøver, der indeholder mere end tre positive dråber, men som har en koncentration under den nedre bestemmelsesgrænse, kan beskrives som påviselige, men ikke kvantificerbare.

Representative Results

Til demonstrationsformål blev der udviklet et assay designet til at detektere en kommercielt tilgængelig, forbedret grøn fluorescerende protein (eGFP)-udtrykkende AAV2-vektor med et syntetisk dobbeltstrenget DNA-fragment indeholdende eGFP som kvalitetskontrol. I øjeblikket er der løbende debat om, hvorvidt vektoren selv eller et syntetisk DNA-fragment eller lineært plasmid er mest egnet til brug som QC. Generelt kan et syntetisk DNA-fragment eller lineært plasmid anvendes, hvis ækvivalensen med vektoren påvises ved metodeudvikling (data ikke vist). Primere og sonder blev designet og optimeret til at detektere eGFP-transgenet. Se supplerende tabel S1 for de sekvenser, der anvendes i dette arbejde. Koncentrationen af QC-fragmentstammen blev empirisk bestemt ved hjælp af ddPCR. Alle analyser blev udført ved hjælp af de koncentrationer og PCR-betingelser, der er angivet som eksempler i protokolafsnittet.

For qPCR-assays anbefales det at evaluere linearitet, følsomhed, dynamisk område, nøjagtighed og præcision af standardkurven. Da ddPCR ikke er baseret på en standardkurve til målkvantificering, skal disse anbefalinger ændres. I stedet blev QC'er bestående af syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter fortyndet til forskellige koncentrationer for at spænde over det forventede kvantificerbare område af en ddPCR-reaktion baseret på Poisson-statistisk modellering brugt 29,30,31,32 til at definere det dynamiske område og følsomhed og til at evaluere nøjagtighed og præcision. Valget af QC-koncentrationer var primært baseret på det forventede forhold mellem positive og samlede dråber i en brønd ved en given koncentration. Matematisk set er ddPCR teoretisk mest nøjagtig, når ca. 80% af partitionerne forstærker positivt. Da forholdet mellem positiv og total dråbe stiger over 0,8, falder nøjagtigheden på grund af mætning af partitionerne, idet kvantificering ikke er mulig, når 100% af dråberne er positive. I den lave ende kan teoretisk set så lidt som en positiv dråbe detekteres og kvantificeres, selvom nøjagtigheden er dårligere, og analysen er underlagt falske positive på lavt niveau. Typisk skal mindst tre dråber være positive, for at et resultat kan beregnes med 95% sikkerhed, hvilket er tærsklen for at beregne en koncentration, vi brugte her.

Der blev fremstillet en serie på fem forskellige QC-koncentrationer, hvor målkopiantallet/μL PCR-reaktionsvolumenerne blev beregnet, hvilket forventedes at give positive til samlede dråbeforhold, der spænder over det kvantificerbare interval for ddPCR, som vist i tabel 5. Disse blev brugt til at evaluere nøjagtigheden og præcisionen af analysen. I vurderingen her blev de øvre og nedre grænser for kvantificering ikke skubbet til det teoretiske maksimum, der var muligt i ddPCR. Nøjagtig kvantificering kan være mulig på højere og lavere niveauer end påvist her. Sortimentet bør udvikles i overensstemmelse med downstream-anvendelserne af denne metode.

I alt tre uafhængigt fremstillede fortyndingsserier af disse QC'er blev fremstillet i prøvefortyndingsbuffer for hver batch for at evaluere intraassaynøjagtigheden og præcisionen. Duplikerede brønde af hver QC-fortynding blev inkluderet. For at simulere en faktisk valideringsprotokol blev i alt seks nøjagtigheds- og præcisionsbatcher udført af flere analytikere over flere dage. Resultaterne fra disse seks batcher blev analyseret for at definere metodens intra-assay og inter-assay nøjagtighed og præcision og for at definere assayets dynamiske område.

Intra-assay-ydeevne blev vurderet for hver batch på hvert QC-niveau. Vi forventede, at alle QC- og NTC-brønde ville have mindst 10.000 dråber. Dette blev opfyldt i 216 ud af 216 testede brønde på tværs af alle seks batcher, med et gennemsnitligt dråbetal på 19.748 dråber / brønd (tabel 6). Dernæst forventedes inter-well %CV for hvert sæt duplikatbrønde af hver QC at være ≤25,0%, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Dette blev opfyldt i sæt af 90 ud af 90 brønde, der blev testet på tværs af alle seks batcher for QC'erne, med en gennemsnitlig inter-well %CV på 3,9% på tværs af alle QC-niveauer (tabel 7). Alle QC'er gav gennemsnitlige positive til samlede dråbeforhold inden for de forventede intervaller, der er skitseret ovenfor (tabel 6).

Inden for hver batch blev intraassaymiddelværdien og standardafvigelsen beregnet for hvert af de uafhængigt fremstillede fortyndingsseriepunkter, og disse blev anvendt til at beregne et intraassaygennemsnit for hver koncentration i hvert assay. Dette blev brugt til at vurdere nøjagtigheden og præcisionen af analysen (tabel 8). Præcision henviser til variabiliteten i data fra replikater af den samme homogene prøve under normale analysebetingelser og evalueres ved at beregne %CV for de flere inkluderede delprøver. Vi forventede, at de tre delprøver, der blev testet inden for hver batch, ville give et intraassay %CV ≤25,0%, undtagen for den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Dette blev opfyldt for alle fem QC-niveauer i hver af de 60 batches (30 ud af 30 samlede forestillinger). Generelt kunne der opnås større intra-assay-præcision end målkriterierne med en gennemsnitlig intra-assay-%CV på 7,7% på tværs af alle QC-niveauer. Nøjagtighed refererer til graden af overensstemmelse mellem den eksperimentelt bestemte værdi og den nominelle værdi. Dette evalueres ved at beregne den procentvise relative fejl (%RE eller %Bias) mellem de beregnede koncentrationer af hver QC og deres teoretisk forventede nominelle koncentrationer. Det forventedes, at gennemsnittet inden for analysen af de tre delprøver ville være ±25,0% RE af den nominelle koncentration, undtagen for den øvre og nedre grænse QC, hvor der forventedes ±30,0%. Dette blev opfyldt for alle fem QC-niveauer i hver af de 60 batches (30 ud af 30 samlede forestillinger). Generelt kunne større intra-assay-nøjagtighed end vores mål opnås med en gennemsnitlig absolut intra-assay %RE på 4,2% på tværs af alle QC-niveauer. I alle forestillinger af NTC (30 i alt) kunne der ikke påvises positive dråber.

Inter-assay nøjagtighed og præcision blev også beregnet ved hjælp af intra-assay gennemsnittet af hvert QC-niveau inden for hver batch. Inter-assay-præcisionen forventedes at være ≤25,0% CV, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Ligeledes forventedes ±25,0% RE for nøjagtighed mellem assay, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ±30,0% forventedes. Der blev observeret en signifikant større inter-assay-nøjagtighed og præcision end disse mål (tabel 9) med en inter-assay-præcision fra 4,0% til 8,5% og en inter-assay absolut nøjagtighed fra 1,0% til 3,2%. Samlet set viser disse resultater, at denne metode kan opnå tilstrækkelig intra- og inter-assay nøjagtighed og præcision godt inden for de nuværende industrimål. Et dynamisk område af dette assay på 2.500-2,5 kopier pr. μL PCR-reaktion kan defineres baseret på disse resultater med en samlet analysefølsomhed på 2,5 kopier pr. μL PCR-reaktion. Som tidligere nævnt kan det være muligt at validere bredere dynamiske områder.

Dernæst var det nødvendigt at evaluere analysenøjagtighed og præcision inden for målmatrixen - i dette tilfælde tårer. Assays valideres typisk forud for påbegyndelsen af kliniske undersøgelser, hvilket betyder, at tårer indsamlet fra vektorbehandlede patienter sandsynligvis ikke er tilgængelige til valideringsformål. Dette kan kunstigt skabes ved at spidse mål-AAV-vektoren i tårer indsamlet fra frivillige donorer for at skabe matrix-spikede QC'er. Samlede menneskelige tårer blev indsamlet af en tredjepart (BioIVT). Som bevis for princippet blev der anvendt en eGFP-udtrykkende AAV2-vektor erhvervet fra en kommerciel kilde. Koncentrationen af AAV2-vektorstammen blev empirisk bestemt ved hjælp af ddPCR uden brug af et DNA-isolationstrin som beskrevet i denne protokol. I hver kørsel blev AAV2 uafhængigt spiket ind i de tre tårealikvoter ved et højt (forventet 1,41 x 103 kopier/μL PCR-reaktion) og lavt (28,2 kopier/μL PCR-reaktion) niveau. Alikvoter uden tilsætning blev medtaget som kontrol for at påvise metodens specificitet.

Intra-assay-ydeevne blev vurderet for hver batch på hvert spike-niveau. Det forventedes, at alle tåreprøver ville have mindst 10.000 dråber. Dette blev opfyldt i 108 ud af 108 testede brønde på tværs af alle seks batcher, med et gennemsnitligt samlet dråbeantal på 20.208 dråber / brønd (tabel 10). Dernæst forventedes inter-well %CV for hvert sæt duplikatbrønde i hver QC at være ≤25,0% for de høje og lave spikeniveauer. Dette blev opfyldt i 36 ud af 36 sæt brønde, der blev testet på tværs af alle seks batcher for QC'erne, med en gennemsnitlig inter-well %CV på 3,2% (tabel 11).

Inden for hver batch blev intra-assay-middelværdien og standardafvigelsen beregnet for hver af de uafhængigt fremstillede tårespidser, og disse blev brugt til at beregne et intra-assay-gennemsnit for hver koncentration i hvert assay. Dette blev anvendt til at vurdere nøjagtigheden og præcisionen af analysen i matrix (tabel 12). Vi forventede, at intra-assay %CV ville være ≤25.0% og høje og lave spike niveauer. Dette blev opfyldt i seks ud af seks batches for hvert niveau. Generelt kunne der opnås større intra-assay-præcision i matrix end målet med et gennemsnitligt intra-assay %CV på 3,7% på det høje niveau og 12,2% på det lave niveau (samlet 8,0%). Det forventedes også, at intra-assayet %RE ville være ±25,0% ved begge spikeniveauer. Dette blev opfyldt i seks ud af seks batches for hvert niveau. Ligeledes blev det generelt konstateret, at større intra-assay-nøjagtighed i matrix end målet kunne opnås med en gennemsnitlig intra-assay absolut %RE på 8,1% på det lave niveau og 11,3% på det høje niveau (samlet 9,7%). For den ikke-spikede kontrol kunne der ikke påvises noget eGFP-signal i nogen af alikvoterne (tabel 12), hvilket demonstrerer metodens specificitet i den menneskelige tårematrix.

Inter-assay nøjagtighed og præcision i rivematrix blev også beregnet ved hjælp af intra-assay gennemsnittet af hvert spike niveau inden for hver batch. Det forventedes, at inter-assay-præcisionen ville være ≤25,0% CV, og for inter-assay-nøjagtighed forventede vi ±25,0% RE. Der blev observeret en signifikant større inter-assay-nøjagtighed og præcision end disse mål (tabel 13) med en inter-assay-præcision på 5,5% på det høje niveau og 7,1% på det lave niveau og med absolut inter-assay-nøjagtighed på 11,3% på det høje niveau og 8,1% på det lave niveau. Samlet set demonstrerer disse resultater nøjagtigheden, præcisionen og specificiteten af metoden i rivematrix.

Tabel 5: Kvalitetskontrol anvendt til at definere assayets dynamiske område. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Samlet dråbetal og positive til samlede dråbeforhold for syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontrol og NTC. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: QC inter-well statistik (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: Intra-assay-nøjagtighed og præcision af QC'er (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9: Nøjagtighed og præcision mellem analyser af QC'er (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 10: Samlet antal dråber af tåreprøver. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 11: Statistik over rivningsprøver mellem brønde (kopimål/μL PCR-reaktion). Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 12: Intra-assay nøjagtighed og præcision af tåreprøver (kopimål/μL PCR-reaktion). Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 13: Nøjagtighed og præcision mellem analyser af riveprøver (kopimål/μL PCR-reaktion). Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S1: Sekvenser af primer, sonder og syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontrol anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Der er flere trin i ddPCR-protokollen, der er afgørende for korrekt udførelse af analysen. Det første kritiske trin er design og optimering af primere og sonde. Generelt anbefales brugen af hydrolysesondebaseret kemi frem for farvestofbaseret kemi (f.eks. SYBR Green) i prækliniske eller kliniske omgivelser på grund af deres overlegne specificitet. Derudover er valget af forstærkningsmål kritisk. Typisk er vektorens transgen af interesse målrettet. I tidligere prækliniske stadier eller i vektorer, hvor det måske ikke er muligt at skelne vektortransgen versus genomisk DNA, kan det imidlertid være hensigtsmæssigt at anvende standardiserede vektormål. For eksempel kan man målrette mod den inverterede terminalgentagelsesregion, promotor, poly-A-hale eller krydsene mellem segmenterne mellem disse vektorkomponenter. Valget af mål varierer afhængigt af vektordesign. Traditionelle qPCR-primer- og sondedesignstrategier og software er typisk passende til ddPCR. Designparametre, der forventes at give en ensartet udglødningstemperatur (f.eks. 60 °C), bør vælges for at reducere den nødvendige optimering. Det er også blevet anbefalet at designe, bestille og evaluere mindst tre forskellige sæt for hvert mål. Man bør derefter vælge det sæt, der viser den største specificitet (ingen forstærkning i den negative kontrolbrønd eller i en matrix af relateret mål-DNA) og følsomhed (dvs. detektionsgrænse)20.

Hvis det er fordelagtigt at kunne overføre analysen mellem qPCR og ddPCR, anbefales det først at optimere analysebetingelserne ved hjælp af qPCR og identificere betingelser for det valgte sæt, der resulterer i forstærkningseffektivitet på 90% -110% med en R2 ≥ 0,98. Imidlertid er ddPCR som en endepunktsmetode typisk mindre følsom end qPCR på grund af varians i forstærkningseffektivitet. Som minimum anbefales det at køre en termisk temperaturgradient i udglødnings-/forlængelsestrinnet for at dække temperaturer over og under de forventede udglødningstemperaturer og for at evaluere regn- og fluorescerende amplitudeadskillelsen mellem de negative og positive dråbeklynger som funktion af temperaturen. Hvis arbejdsområdet tillader det, anbefales det at have individuelle dedikerede arbejdsstationer til forberedelse af mastermix, tilføjelse af skabeloner og forstærkning. Hvor det er muligt, bør disse fysisk adskilles af en ensrettet arbejdsgang med indbyggede tekniske kontroller, såsom kontrolleret adgang og differenslufttryk, for at reducere risikoen for krydskontaminering og falske positiver. Hvis dette ikke er muligt, skal der udvises ekstrem forsigtighed for at undgå krydskontaminering.

Der er to trin i denne protokol, der kan virke usædvanlige for dem, der er mere vant til qPCR-assayudvikling. Den første er inkluderingen af et restriktionsenzym i PCR-masterblandingen. Under ddPCR-amplifikation termocykles hver dråbe til slutpunktet. I et korrekt optimeret assay resulterer dette i to populationer af dråber, et sæt viser et konsekvent højt niveau af fluorescerende signaler - positiverne - og et andet viser konsekvent et lavt niveau af fluorescerende signal - negativerne. Hvis PCR-interferens opstår, kan det desynkronisere initieringen af PCR-amplifikation, hvilket resulterer i, at dråben ikke når et forstærkningsplateau og dermed inkonsekvente fluorescerende endepunkter. I dette tilfælde fordeles dråberne mellem negativerne og positive, hvilket resulterer i et fænomen kaldet ddPCR-regn. Dette kan resultere i unøjagtig kvantificering af målet og inkonsekvent og subjektivt anvendte tærskler. Vores anbefaling om at sætte tærsklen lidt over NTC-signalet, hvilket bør minimere virkningerne af regn i den endelige kvantificering, da alle dråber stadig betragtes som positive, selvom de ikke er fuldt cyklet til slutpunktet. AAV'er har en meget kompleks sekundær struktur, der afhængigt af forstærkningsmålet kan reducere tilgængeligheden til primere og sonder, hvilket resulterer i PCR-interferens og dermed regn. Inkluderingen af restriktionsenzymet i masterblandingen spalter denne sekundære struktur for at øge adgangen for primere og sonder, hvilket reducerer regnen, hvilket derved kan forbedre nøjagtigheden af analysen. Virkningerne af inklusion af et restriktionsenzym i ddPCR-reaktionen er tidligere beskrevet 25,32. Ethvert restriktionsenzym kan anvendes, så længe det bekræftes, at det ikke skæres inden for målamplifikationsområdet. Der kræves ingen forfordøjelsestrin eller alternative buffersammensætninger.

Det andet usædvanlige trin er forberedelsen af tåreprøven indeholdende AAV. I denne protokol blev der anvendt et forhold på 1:10 (eller mere) mellem tårer, og efterfølgende blev prøven opvarmet. Når tårer opsamles via et kapillarrør, som er en meget anvendt indsamlingsmetode, kan der i gennemsnit opsamles ca. 10,0 μL33. Fortyndingen hjælper med at adressere det begrænsede prøvevolumen og give tilstrækkeligt materiale til dobbeltbrøndtestning. Selvom dette reducerer den teoretiske detektionsgrænse, bør ddPCR's robuste følsomhed stadig resultere i påvisning af alle undtagen et ekstremt få antal vektorpartikler. Denne tilgang skaber desuden en "backup" brønd, hvis man uventet skulle mislykkes. I dette tilfælde eller i tilfælde af utilstrækkelig prøvevolumen til at køre to brønde kan Poisson-fejlen bruges til at vurdere præcision. I tilfælde, hvor koncentrationen ligger under detektionsgrænsen, skaber det desuden mulighed for at sammenlægge brønddata for at bestemme en koncentration. Det er nødvendigt at frigøre AAV-vektorerne fra de virale kapsider til ddPCR-detektion. Nogle metoder til kvantificering af AAV har inkluderet et proteinase K fordøjelsestrin for at fjerne det virale kapsid34,35,36. Alle naturligt forekommende AAV-serotyper har smeltetemperaturer på eller under ca. 90 °C, hvoraf de fleste falder til under 80 °C. Dette synes derfor at være en unødvendig medtagelse37. Opvarmning alene synes at være tilstrækkelig til at frigive vektor-DNA.

Desuden er ddPCR generelt mindre modtagelig for PCR-hæmmere, der kan være til stede i en prøve, der kan påvirke et qPCR-assay. Hvis et specifikt DNA-isolationstrin er inkluderet, vil dette også kræve specifik validering, hvilket undgås i denne protokol. Prøver fortyndes før opvarmning på grund af kinetikken for diffusion af vektorgenomerne i en væske. Under opvarmningen og den efterfølgende afkølingsproces kan de positive og negative sansstrenge i det enkeltstrengede DNA-genom annealere sammen for at producere et dobbeltstrenget mellemprodukt, hvis koncentrationerne er tilstrækkeligt høje. Fortynding før opvarmning reducerer koncentrationerne og gør det matematisk usandsynligt, at der dannes tilstrækkeligt dobbeltstrengede mellemprodukter til at have en negativ indvirkning på kvantificeringens nøjagtighed. Det skal bemærkes, at de syntetiske DNA-fragmenter eller lineariserede plasmider, der anvendes som kvalitetskontrol, ikke må gennemgå dette opvarmningstrin. Da disse er dobbeltstrengede, vil opvarmning resultere i konvertering til enkeltstrengede mellemprodukter. Efter uafhængig opdeling af disse enkeltstrengede QC'er i dråber forventes dette at resultere i en dobbelt stigning i QC-koncentrationen i forhold til den nominelle koncentration. Alternativt, hvis QC'er skal opvarmes for at standardisere metoden, skal dette indregnes i rekonstitutionen og tildelingen af en nominel koncentration.

Endelig, med hensyn til prøveforberedelse, anbefaler mange protokoller også inkludering af et DNase-behandlingstrin for at fjerne ethvert uindkapslet vektor-DNA. Dette trin er kritisk i tilfælde, hvor det ikke ønskes at kvantificere frit DNA forbundet med vektorpræparatet (såsom under kvantificering til doseringsformål). Men i forbindelse med biodistributions- og bioshedding-undersøgelser ønsker man typisk at vide, hvor ethvert vektor-DNA har rejst, uanset om det er indkapslet eller ej. Derfor foreslås det typisk ikke at udføre et DNase-behandlingstrin under sådanne undersøgelser. Hvis det fastslås, at det er nødvendigt at inkludere et DNase-trin, skal dette trin være før fortynding og opvarmning.

I dette papir præsenteres data, der er repræsentative for tilgangen til vurdering af metodens dynamiske område, følsomhed, nøjagtighed og præcision inden for rammerne af en formålstjenlig, god laboratoriepraksis-kompatibel validering. Den nuværende mangel på vejledning om dette emne overlader valideringslaboratorierne til selv at fastlægge målanalysekriterier i overensstemmelse med den nuværende branchetænkning. Forskellige grupper har opstillet både højere og lavere målkriterier end anvendt i denne undersøgelse 19,20,21,22,23,24,25. Kriterierne for målassay bør, indtil de er mere strengt defineret, vælges forud for validering baseret på metodens tilsigtede kliniske anvendelser. Afhængigt af de downstream-beslutninger, der skal træffes på grundlag af dataene, kan der være behov for større nøjagtighed og præcision. Omvendt kan et simpelt positivt versus negativt resultat være tilstrækkeligt.

Tilgangen omfattede også anbefalinger til vurdering af specificitet og matrixeffekt. En pulje af tårer indsamlet fra ubehandlede individer kunne ikke give et positivt resultat i dette assay, mens målet kunne detekteres, når vektoren blev spidset ind i tårerne ved en høj og lav koncentration inden for de anbefalede restitutionshastigheder. Ideelt set ville matrix indeholdende endogen vektor (f.eks. indsamlet efter behandling med viral vektor) også indgå i disse vurderinger. Det er imidlertid usandsynligt, at sådanne prøver vil være tilgængelige til brug i en validering. For at øge valideringens robusthed kan flere puljer af tårer eller tårer indsamlet fra en række individer vurderes for at afgøre, om der opstår en patientspecifik matrixeffekt. Endelig anbefales det at evaluere stabiliteten. I arbejdsgange, hvor DNA-ekstraktion sker ud af den biologiske matrix, kan det være nødvendigt at evaluere stabiliteten af både prøven og det ekstraherede DNA. I denne arbejdsgang testes prøven direkte i analysen uden behov for DNA-ekstraktion. Derfor skal man i betragtning af evalueringen af stabiliteten for denne metode evaluere stabiliteten af tåreprøverne. Typisk anbefales bord-, køleskabs-, fryse-/optønings- og langsigtede stabilitetsvurderinger. Disse blev ikke udført som en del af denne undersøgelse, men de metoder, der er udviklet her, kan bruges i denne vurdering efter manipulationer af inputprøverne.

Samlet set har denne metode vist sig at være et robust, repeterbart og validereligt assay til påvisning af AAV-baserede vektorer i tåreprøver. Den kan tjene som en platform, der skal tilpasses specifikke vektorer til støtte for kliniske forsøg, og danner grundlag for validering af et assay, der er i overensstemmelse med god laboratoriepraksis.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte i KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, en kontraktforskningsorganisation, der leverer omfattende udviklingstjenester i overensstemmelse med god laboratoriepraksis / god klinisk praksis fra tidlig opdagelsesstøtte gennem produktregistrering, herunder understøttende AAV-baserede assays, som beskrevet i denne protokol. KCAS finansierede dette projekt og offentliggørelsen af denne protokol. Selvom der ikke er nogen nuværende FDA-retningslinjer for design og validering af de eksperimenter, der præsenteres i dette papir, har eksperterne og tankelederne, der udvikler sådanne undersøgelser på KCAS, vedtaget denne tilgang som basislinjetilgang. Yderligere kriterier og parametre drøftes for hvert enkelt projekt og kan medtages på grundlag af den tilsigtede anvendelse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Nick Russell og Brandon McKethan fra Bio-Rad for deres nyttige diskussioner under udviklingen af denne metode.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV-eGFP Vector Charles River Laboratories RS-AAV2-FL Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector
AutoDG Droplet Digital PCR system Bio-Rad QX200 Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
AutoDG Oil for Probes Bio-Rad 1864110 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 1863004 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Piercable Foil Seals Bio-Rad 1814040 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad 12001925 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023, 1863024, or 1863025 Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.
DG32 AutoDG Cartidges Bio-Rad 1864108 Or use material compatible with ddPCR system.
Droplet Reader Bio-Rad QX200 Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
GeneAmp PCR Buffer Applied Biosystems N8080129 N/A
Nuclease-Free Water Ambion AM9906 N/A
PCR Plate Sealer Bio-Rad PX1 Or use material compatible with ddPCR system.
Pipet Tips for AutoDG Bio-Rad 1864120 Or use material compatible with ddPCR system.
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant Gibco 24040 N/A
Primer and Hydrolysis Probes Various Various Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.
Restriction Enzyme Various Various Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence
Sheared salmon sperm DNA ThermoFisher AM9680 N/A
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid Various Various Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control
TE Buffer Teknova T0224 Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0
Touch Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Or use material compatible with ddPCR system.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it 'gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
  2. Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
  3. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  4. Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022).
  5. Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022).
  6. Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
  7. Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
  9. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  10. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020).
  11. Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020).
  12. Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020).
  13. Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016).
  14. Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023).
  15. Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020).
  16. Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015).
  17. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018).
  18. Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
  19. Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
  20. Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
  21. Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
  22. Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018).
  23. Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
  24. Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
  25. Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
  26. Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023).
  27. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  28. Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  29. Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023).
  30. Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
  31. Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
  32. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  33. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
  34. Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
  35. Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
  36. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
  37. Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).

Tags

Biologi udgave 197 dråbe digital PCR (ddPCR) AAV tårer viral vektor god laboratoriepraksis validering
Et validerbart dråbe digitalt polymerasekædereaktionsassay til påvisning af adeno-associerede virale vektorer i bioshedding undersøgelser af tårer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longacre, B., Souaysene, A.,… More

Longacre, B., Souaysene, A., Vyhlidal, C. A., Pennington, M. R. A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears. J. Vis. Exp. (197), e65495, doi:10.3791/65495 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter