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Biology

आंसुओं के बायोशेडिंग अध्ययन में एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मान्य ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन परख

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65495
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cell and Gene Therapy, KCAS Bioanalytical and Biomarker Services

Summary

यहां, हम जीन थेरेपी वैक्टर के नैदानिक विकास के समर्थन में ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा मानव आँसू में एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर के अनुपालन का पता लगाने में अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के विकास और सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

आनुवंशिक रोगों के इलाज के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग हाल के वर्षों में काफी बढ़ गया है, आज तक 2,000 से अधिक अध्ययन पंजीकृत हैं। एडेनो से जुड़े वायरल (एएवी) वैक्टर को आंखों से संबंधित बीमारियों के उपचार में विशेष सफलता मिली है, जैसा कि वोरेटिजीन नेपरवोवेक-आरजाइल के अनुमोदन से उदाहरण मिलता है। बाजार में नए उपचार लाने के लिए, नियामक एजेंसियां आमतौर पर पर्यावरण में वेक्टर की रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए योग्य या मान्य बायोशेडिंग अध्ययनों का अनुरोध करती हैं। हालांकि, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा इस तरह के शेडिंग अध्ययनों का समर्थन करने के लिए आणविक आधारित परख के विकास के लिए कोई आधिकारिक दिशानिर्देश जारी नहीं किए गए हैं, जिससे डेवलपर्स को अपने लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को निर्धारित करने के लिए छोड़ दिया गया है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैदानिक बायोशेडिंग अध्ययनों के समर्थन में ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीडीपीसीआर) द्वारा मानव आंसुओं में एएवी वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना है। यह पांडुलिपि आणविक परख सत्यापन के लिए वर्तमान उद्योग दृष्टिकोण पर चर्चा करती है और दर्शाती है कि विधि वर्तमान में श्वेत पत्रों में प्रस्तावित लक्ष्य परख स्वीकृति मानदंडों से अधिक है। अंत में, किसी भी डीडीपीसीआर परख के प्रदर्शन में महत्वपूर्ण कदम, आवेदन की परवाह किए बिना, चर्चा की जाती है।

Introduction

जीन थेरेपी की परिभाषाएं अलग-अलग होती हैं, लेकिन आम तौर पर एक जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने या हेरफेर करने यानैदानिक उद्देश्य के लिए जीवित कोशिका के जैविक गुणों को बदलने के लिए सेलुलर जीनोम के एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम के जानबूझकर और अक्सर अपेक्षित स्थायी परिवर्तन को प्रेरित करती हैं। वायरल वैक्टर को ट्रांसडक्शन की दक्षता के कारण जीन थेरेपी के लिए वाहनों के रूप में तेजी से उपयोग किया जा रहा है, एक रिपोर्ट में सुझाव दिया गया है कि वर्तमान जीन थेरेपी नैदानिक परीक्षणों में से 70% से अधिक वायरल वैक्टर3 का उपयोग करते हैं। जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर में रुचि लगातार बढ़ रही है। अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी से जीन, सेल और आरएनए थेरेपी परिदृश्य पर तिमाही 4 2022 त्रैमासिक डेटा रिपोर्ट ने बताया कि 2022 में, प्रीक्लिनिकल से प्री-रजिस्ट्रेशन तक जीन, सेल और आरएनए थेरेपी पाइपलाइन में 7% की वृद्धि हुई, जिससे विकास में उपचारों की कुल संख्या 3,726 हो गई, जिनमें से 2,053 (55%) जीन थेरेपीथे।. यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (यूएसए एफडीए) ने वर्तमान में मनुष्यों में नैदानिक उपयोग के लिए 27 सेल और जीन थेरेपी को मंजूरी दी है, जिनमें से पांच विशेष रूप से वायरल वैक्टर5 का उपयोग करते हैं।

एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) ने जीन थेरेपी के लिए वाहनों के रूप में विशिष्ट रुचि प्राप्त की है। हाल ही में एक मेटा-विश्लेषण से पता चला है कि पिछले दो दशकों में एएवी के उपयोग की जांच करने वाले लगभग 136 नैदानिक परीक्षण हुएहैं। इसके अतिरिक्त, पांच यूएसए एफडीए अनुमोदित जीन उपचारों में से तीन एएवी आधारित हैं। यह उनकी अत्यधिक संपादन योग्य प्रकृति, व्यापक मेजबान रेंज के कारण है जिसे विशिष्ट प्राकृतिक रूप से होने वाले या कृत्रिम रूप से इंजीनियर किए गए वैक्टर, मनुष्यों में कम रोगजनकता और विषाक्तता और आम तौर पर कम इम्युनोजेनेसिटी 7,8 के उपयोग के आधार पर ट्यून किया जा सकता है। एएवी का उपयोग एक अनुमोदित नैदानिक सेटिंग में नेत्र रोगों के इलाज के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। वोरेटिजीन नेपरवोवेक-आरज़िल एक एएवी 2-आधारित थेरेपी है जिसे 2017 में यूएसए एफडीए द्वारा और 2018 में यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी (ईएमए) द्वारा बायलेल आरपीई 65 उत्परिवर्तन से जुड़े रेटिना डिस्ट्रॉफी9 के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया था।

एएवी-आधारित उपचारों के विकास में बढ़ती रुचि के साथ परख पर नियामक मार्गदर्शन की आवश्यकता आती है। किसी भी वायरल वेक्टर का सटीक पता लगाना और परिमाणीकरण उत्पाद विकास की खोज, विनिर्माण और प्रीक्लिनिकल / नैदानिक परीक्षण चरणों का एक अभिन्न अंग है। यूएसए एफडीए ने जीन थेरेपी के लिए कुछ मार्गदर्शन जारी करना शुरू कर दिया है, जिसमें रसायन विज्ञान, विनिर्माण और मानव जीन थेरेपी के लिए नियंत्रण पर नई दवा अनुप्रयोगोंकी जांच 10, जीन थेरेपी 11 के प्रशासन के बाद दीर्घकालिक अनुवर्ती, प्रतिकृति-सक्षम रेट्रोवायरस परीक्षण12, और जीन थेरेपी13 में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोबियल वैक्टर के लिए सिफारिशें शामिल हैं।. ईएमए ने जीन थेरेपी उत्पादों के विकास से संबंधित दिशानिर्देशों की एक श्रृंखला भी जारी की है जो आम तौर पर एफडीए सिफारिशों के साथ संरेखित होते हैं, हालांकि कुछअंतर मौजूद हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हालांकि ये मार्गदर्शन कानूनी रूप से लागू करने योग्य जिम्मेदारियों को स्थापित नहीं करते हैं, सिवाय इसके कि जहां विशिष्ट नियमों को संदर्भित किया जाता है, वे इस विषय पर नियामक एजेंसियों से वर्तमान सोच और दवा फाइलिंग और नियामक अनुमोदन के लिए आवश्यक परख के लिए उनकी अपेक्षाओं पर स्पष्टता प्रदान करते हैं।

एफडीए विशेष रूप से सिफारिश करता है कि ओकुलर और गैर-ओकुलर ऊतकों, इंट्राओकुलर तरल पदार्थ और रक्त15 को लक्षित करने के लिए प्रशासन की साइट से वेक्टर के वितरण, दृढ़ता और निकासी का आकलन करने के लिए अध्ययन किया जाना चाहिए। ये जैव वितरण और शेडिंग अध्ययन का रूप लेते हैं। जैव वितरण अध्ययन यह जांचकर जोखिम का मूल्यांकन करते हैं कि प्रशासन की साइट से रोगी के शरीर में एक उत्पाद कैसे फैलता है। शेडिंग विशेष रूप से रोगी से पर्यावरण में उत्पाद की रिहाई का मूल्यांकन करता है और अनुपचारितव्यक्तियों में वेक्टर के संचरण की संभावना बढ़ाता है। एफडीए नमूना संग्रह की आवृत्ति, नमूना संग्रह की अवधि, एकत्र किए गए नमूनों के प्रकार और भंडारण की स्थिति के संबंध में जैव वितरण और शेडिंग अध्ययन के डिजाइन के लिए सिफारिशें करता है।

इसके अतिरिक्त, एफडीए प्रदर्शन में आसानी, उच्च-थ्रूपुट प्रारूप, तेजी से बदलाव के समय और परख संवेदनशीलता के कारण वेक्टर जीनोम की मात्रात्मक पहचान के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर, या रीयल-टाइम पीसीआर) के उपयोग की सिफारिश करता है। हालांकि, छोटे और बड़े अणुओं के लिए मौजूद लोगों की तुलना में आणविक विधियों के डिजाइन और प्रदर्शन मूल्यांकन के लिए सिफारिशों की सापेक्ष कमी है। इस तरह के अध्ययनों के लिए कई दिशानिर्देश दोनों उत्पादों और परख ों के अद्वितीय और जटिल डिजाइन के कारण आणविक विधियों पर लागू करना मुश्किल है, जो अनुशंसित आकलन के लिए उपलब्ध प्लेटफार्मों की उपयुक्तता और परख सत्यापन के लिए उपयुक्त तरीकों के बारे में सवाल उठाते हैं। आज तक, एफडीए को पीसीआर-आधारित परखों के औपचारिक सत्यापन की आवश्यकता नहीं है, हालांकि ईएमए ने इस आवश्यकताको लागू किया है। इस शून्य के प्रकाश में, विभिन्न समूहों और कार्यशालाओं ने श्वेत पत्र और सिफारिशें जारी की हैं जिन्हें निर्माताओं और अनुबंध अनुसंधान संगठनों ने 18,19,20,21,22,23,24,25 का पालन करने की मांग की है। इनमें से अधिकांश सिफारिशें विशेष रूप से क्यूपीसीआर परखों को ध्यान में रखते हुए लिखी गई हैं, जिसमें उभरते प्लेटफार्मों के लिए सुझाव या परिवर्तन हैं, जैसे कि ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर), केवल प्रासंगिक माना जाता है। हाल की सिफारिशों ने डीडीपीसीआर परख ों के लिए विचारों पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन बायोशेडिंग अध्ययनों में सामना किए गए जटिल जैविक मैट्रिक्स के बजाय विनिर्माण सेटिंग में वेक्टर जीनोम परिमाणीकरण के लिए उनके अनुप्रयोगों पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित किया है।

नैदानिक अनुप्रयोग और लक्ष्यों के आधार पर, डीडीपीसीआर की तुलना में डीडीपीसीआर की बढ़ती संवेदनशीलता और मैट्रिक्स हस्तक्षेप को संभालने की क्षमता के कारण जैव वितरण और शेडिंग अध्ययनों के समर्थन में क्यूपीसीआर पर डीडीपीसीआर को प्राथमिकता दी जा सकती है। इसके अलावा, लगभग 20,000 बूंदों में नमूनों के विभाजन के कारण, पॉइसन आंकड़ों का उपयोग करके मानक वक्र के उपयोग के बिना कॉपी संख्या का सटीक परिमाणीकरण प्राप्त किया जा सकता है, विधि विकास और सत्यापन को सरल बनाता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नैदानिक बायोशेडिंग अध्ययनों के समर्थन में ओकुलर सतह से एकत्र किए गए आंसुओं में एएवी वैक्टर का पता लगाने के लिए डीडीपीसीआर-आधारित विधि के विकास और सत्यापन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण का वर्णन करना है।

Protocol

1. सिंथेटिक डीएनए टुकड़े की तैयारी

  1. गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए लक्ष्य प्रवर्धन क्षेत्र युक्त सिंथेटिक डीएनए टुकड़े को डिजाइन और ऑर्डर करें।
    1. सुनिश्चित करें कि अनुक्रम में फॉरवर्ड प्राइमर से लेकर ब्याज के लक्ष्य जीन के रिवर्स प्राइमर तक पूरे एम्पलीकॉन अनुक्रम शामिल हैं, जिसमें प्रत्येक प्राइमर बाइंडिंग अनुक्रम के 5 'सिरों पर अनुक्रम के चार से छह आधार जोड़े का विस्तार है।
    2. 12 बेस जोड़े या आठ बेस जोड़े से अधिक गुआनिन और साइटोसिन बेस जोड़े के होमोपॉलिमर से बचें, क्योंकि लंबे होमोपॉलिमर जीन टुकड़े के संश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
      नोट: यदि एम्प्लिकॉन में ऐसे अनुक्रम होते हैं, तो बेस प्रतिस्थापन तब तक किया जा सकता है जब तक प्राइमर और जांच के लिए एनीलिंग साइट बनाए रखी जाती है।
    3. वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट क्लोनिंग रणनीतियों का उपयोग करके एम्पलीकॉन युक्त एक रैखिक प्लास्मिड तैयार करें।
  2. सिंथेटिक डीएनए टुकड़े वाली ट्यूब को ~ 10 सेकंड के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सामग्री ट्यूब के तल पर एकत्र की गई है।
  3. ट्राइस-ईडीटीए (टीई) बफर का उपयोग करके सिंथेटिक डीएनए टुकड़े को 1.0 × 1010 प्रतियों / μL की एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें, या लक्ष्य परख सीमा के आधार पर उपयुक्त हों।
  4. भंवर संक्षेप में, फिर 20 ± 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बर्फ पर ठंडा करें।
  5. कई, आदर्श रूप से एकल-उपयोग एलिकोट तैयार करें और उपयोग तक -70 से -90 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इस तरीके से तैयार सिंथेटिक डीएनए टुकड़े आमतौर पर पुन: निलंबन की तारीख से कम से कम 24 महीने तक स्थिर होते हैं।
  6. यदि वांछित हो, तो गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग करने से पहले तैयार सिंथेटिक डीएनए स्टॉक की सटीक एकाग्रता निर्धारित करें, या उपयोग किए गए रीसस्पेंशन के आधार पर नाममात्र एकाग्रता का अनुमान लगाएं।

2. प्राइमर और जांच की तैयारी

  1. विशिष्ट डिजाइन रणनीतियों26,27 का उपयोग करके वांछित प्रवर्धन क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिजाइन और ऑर्डर प्राइमर और एक हाइड्रोलिसिस जांच।
    1. डीडीपीसीआर सिस्टम के साथ संगत 5 'फ्लोरोसेंट रिपोर्टर डाई (जैसे, एफएएम) और 3 ' बुझाने वाले (जैसे, आयोवा ब्लैक डार्क बुझानेवाला) का उपयोग करें।
      नोट: कई पीसीआर परख डिजाइन सॉफ्टवेयर पैकेज मौजूद हैं, और किसी का भी उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन28 द्वारा प्राइमर-ब्लास्ट का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि परख डिजाइन के लिए मजबूत विकल्प हैं और जिस आसानी से विशिष्टता को संभावित ऑफटारगेट प्रभावों की पहचान करने के लिए जैव सूचना त्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्राइमरों और जांच की तैयारी यहां सूचीबद्ध चरणों से भिन्न हो सकती है, जो उस प्रारूप के आधार पर होती है जिसमें उन्हें आपूर्ति की जाती है।
  2. फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर युक्त ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब के नीचे पेलेट सामग्री को पेलेट सामग्री के लिए ~ 10 सेकंड के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में जांच करें।
  3. टीई बफर का उपयोग करके प्राइमरों को 20 μM तक पुन: निलंबित करें। भंवर संक्षेप में।
  4. टीई बफर का उपयोग करके जांच को 10 μM तक पुन: निलंबित करें। भंवर संक्षेप में।
  5. कई, आदर्श रूप से एकल-उपयोग एलिकोट तैयार करें और उपयोग तक न्यूनतम -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इस तरीके से तैयार प्राइमर और जांच आमतौर पर पुन: निलंबन की तारीख से कम से कम 24 महीने तक स्थिर होते हैं।

3. नमूना कमजोर पड़ने बफर की तैयारी

  1. कमरे के तापमान पर पीसीआर बफर और कतरनी सैल्मन शुक्राणु डीएनए को पिघलाएं। भंवर को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  2. तालिका 1 के अनुसार, एक नमूना कमजोर पड़ने वाला बफर तैयार करें।
  3. भंवर पूरी तरह से। तैयारी के बाद 1 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

तालिका 1: नमूना कमजोर पड़ने बफर की तैयारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

4. मास्टर मिश्रण की तैयारी

  1. कमरे के तापमान पर जांच, फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर और जांच के लिए डीडीपीसीआर मास्टर मिश्रण को पिघलाएं और उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए गर्म होने दें। उपयोग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: कुशल बूंद गठन सुनिश्चित करने के लिए इन अभिकर्मकों को पूरी तरह से कमरे के तापमान पर लाया जाना चाहिए। तैयारी के दौरान बर्फ पर अभिकर्मकों को न रखें।
    1. उपयोग से पहले एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में भंवर को अच्छी तरह से और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: प्रतिबंध एंजाइम आमतौर पर ग्लिसरॉल में आपूर्ति की जाती है और उपयोग से तुरंत पहले भंडारण से हटा दिया जाना चाहिए। धीरे से मिलाएं। भंवर मत करो।
  2. प्रत्येक प्रवर्धन लक्ष्य के लिए एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। सुझाए गए पीसीआर मास्टर मिश्रण संरचना के लिए तालिका 2 देखें और आवश्यकतानुसार प्राइमरों और जांच की सांद्रता को संशोधित करें।
    1. प्रतिबंध एंजाइम को जोड़ने से पहले पूरी तरह से भंवर और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। मिश्रण करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम और इनवर्ट जोड़ें।
      नोट: इस चरण में, बूंद निर्माण के बाद पीसीआर प्रतिक्रिया के 40 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के 22 μL की आवश्यकता होती है (पीसीआर मास्टर मिश्रण के 15 μL, टेम्पलेट के 5.0 μL, और बूंद पीढ़ी तेल के 20 μL से मिलकर)।
  3. प्लेट मानचित्र के अनुसार प्रत्येक कुएं में 16.5 μL मास्टर मिश्रण जोड़ें। सत्यापन सटीकता और सटीक रन के लिए एक उदाहरण प्लेट मानचित्र के लिए चित्रा 1 देखें।
    1. सुनिश्चित करें कि एक प्लेट में गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) श्रृंखला की तीन स्वतंत्र तैयारी शामिल हैं, तीन स्वतंत्र रूप से परीक्षण किए गए अंतर्जात आंसू एलिकोट का परीक्षण किया गया है, उच्च और निम्न स्तर तक बढ़ाया गया है, और तीन स्वतंत्र नो टेम्प्लेट नियंत्रण (एनटीसी)।
    2. प्लेट में इन कुओं के लेआउट को बदलें, जहां सेट 1 को एकाग्रता कम करने के क्रम में लोड किया जाता है, सेट 2 को एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में लोड किया जाता है, और सेट 3 को यह मूल्यांकन करने के लिए यादृच्छिक क्रम में लोड किया जाता है कि क्या कोई प्लेट स्थान-विशिष्ट प्रभाव हैं।
    3. जितना संभव हो उतना कॉलम भरने के लिए नमूने सरणी करें और नियंत्रण बफर के साथ कॉलम के भीतर अप्रयुक्त कुओं को भरें। यदि वांछित हो, तो शेष कुओं में कई अंतर्जात नियंत्रण लॉट (जैसे, व्यक्तियों से एकत्र किए गए आँसू या आँसू के अधिक पूल) शामिल करें।
    4. प्लेट को स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ सील करें। टेम्पलेट तैयारी के दौरान कमरे के तापमान पर प्लेट पकड़ो। वैकल्पिक रूप से, प्लेट को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे तक रखें, लेकिन टेम्पलेट जोड़ने से पहले इसे कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वापस लाएं।

तालिका 2: उदाहरण पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 1
चित्रा 1: सत्यापन सटीकता और सटीक रन के लिए उदाहरण प्लेट मानचित्र। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. क्यूसी तैयार करना

  1. कमरे के तापमान पर सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या रैखिक प्लास्मिड को पिघलाएं और उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट तक गर्म होने की अनुमति दें। कुशल बूंद गठन सुनिश्चित करने के लिए टेम्प्लेट को कमरे के तापमान पर लाएं।
    1. उपयोग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें। उपयोग से पहले एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में भंवर को अच्छी तरह से और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. नमूना तनुकरण बफर का उपयोग करके क्यूसी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। सत्यापन सटीकता और सटीक रन के लिए तैयार करने के लिए अनुशंसित सांद्रता का एक उदाहरण तालिका 3 में प्रस्तुत किया गया है।
    नोट: सटीकता और परिशुद्धता रन के सफल समापन के बाद, प्रत्येक प्लेट पर केवल उच्च गुणवत्ता नियंत्रण (एचक्यूसी), मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण (एमक्यूसी), और कम गुणवत्ता नियंत्रण (एलक्यूसी) चलाने की आवश्यकता है। सटीकता और सटीक रन के लिए, इंट्रा-परख सटीकता और परिशुद्धता के आकलन के लिए क्यूसी के कम से कम तीन स्वतंत्र कमजोर पड़ने को शामिल किया गया है। सटीकता और सटीक रन के बाद, केवल एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को शामिल करने की आवश्यकता है।
  3. तैयारी के बाद, प्लेट में जोड़े जाने तक कमरे के तापमान पर कमजोर पड़ने को स्टोर करें।
  4. यदि आवश्यक हो तो बर्फ पर या 2-8 डिग्री सेल्सियस पर कमजोर पड़ने को स्टोर करें। बाद के उपयोग से पहले, उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए कमजोर पड़ने को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें। दिन के अंत में QCs को छोड़ दें।

तालिका 3: सिंथेटिक डबल-फंसे डीएनए टुकड़ों का उपयोग करके उदाहरण गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) तैयारी। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

6. नमूने तैयार करना

  1. कमरे के तापमान पर नैदानिक परीक्षण से एकत्र किए गए आंसू के नमूनों को पिघलाने तक पिघलाया जाता है और उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट तक गर्म करने की अनुमति दी जाती है।
    1. उपयोग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें। उपयोग से पहले एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज में भंवर अच्छी तरह से और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब या 8-वेल पीसीआर स्ट्रिप्स में डिल्यूनेट के रूप में नमूना कमजोर पड़ने वाले बफर का उपयोग करके आंसू के नमूने 1: 10 (या अधिक) को पतला करें। ट्यूबों को सील करें।
    नोट: आँसू में लक्ष्य की अपेक्षित एकाग्रता के आधार पर, नमूनों को और पतला करना या प्रत्येक नमूने के कई कमजोर पड़ने का परीक्षण करना आवश्यक हो सकता है।
  3. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकलर में नमूने गर्म करें, इसके बाद ठंडा होने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 3 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की रैंप दर का उपयोग करें।
    नोट: नमूने थर्मल साइकलर में 4 डिग्री सेल्सियस पर उसी दिन उपयोग तक रह सकते हैं या लंबे समय तक भंडारण के लिए -70 से -90 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हो सकते हैं। यह कदम वेक्टर कैप्सिड को विकृत करने का कार्य करता है, जीनोम को जारी करता है। चूंकि क्यूसी सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या रैखिक प्लास्मिड डबल फंसे हुए हैं, इसलिए उन्हें इस हीटिंग चरण से नहीं गुजरना चाहिए।
  4. कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद नमूने वापस करें (या यदि जमे हुए, कमरे के तापमान पर पिघलें) और कम से कम 10 मिनट के लिए गर्म होने दें।
    नोट: कुशल बूंद गठन सुनिश्चित करने के लिए नमूने पूरी तरह से कमरे के तापमान पर लाया जाना चाहिए।

7. टेम्पलेट जोड़ना

  1. मास्टर मिश्रण युक्त डीडीपीसीआर प्लेट पुनर्प्राप्त करें। सामग्री को याद करने के लिए प्रत्येक नमूना या क्यूसी तनुकरण ट्यूब को अच्छी तरह से और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. चिपकने वाली फिल्म को हटा दें और प्लेट मानचित्र के अनुसार, 96-वेल प्लेट के उपयुक्त कुओं में 5.5 μL QC या नमूने जोड़ें।
    नोट: आवश्यक वॉल्यूम के स्पष्टीकरण के लिए चरण 4.2.1 देखें।
  3. एनटीसी कुओं में नमूना कमजोर पड़ने बफर के 5.5 μL जोड़ें।
  4. ड्रॉपलेट जनरेशन के लिए आवश्यक है कि स्तंभ के सभी कुओं में प्रतिक्रिया या बफर नियंत्रण हो। यदि किसी स्तंभ के किसी भी कुएं में नमूना प्रतिक्रियाएं नहीं हैं, तो न्यूक्लियस मुक्त पानी का उपयोग करके 2x डीडीपीसीआर बफर नियंत्रण 1: 2 को पतला करें। स्तंभ के किसी भी खाली कुएं में 1x ddPCR बफर नियंत्रण के 22 μL जोड़ें।
    नोट: यदि एक पूरे कॉलम का उपयोग नहीं किया जाता है, तो इन कुओं में बफर नियंत्रण जोड़ना आवश्यक नहीं है।
  5. प्लेट में एक छेदने योग्य पन्नी सील जोड़ें। प्लेट को प्लेट सीलर में रखें और 180 डिग्री सेल्सियस पर 5 सेकंड के लिए सील करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, डीडीपीसीआर सिस्टम निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्लेट को सील करें।
  6. प्लेट को कम से कम 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर भंवर करें (निरंतर भंवर सेटिंग का उपयोग करके; टच वोर्टेक्सिंग का उपयोग न करें) और प्लेट स्पिनर में संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इस चरण में प्लेट का पूरी तरह से और पूर्ण मिश्रण बूंदों में पीसीआर प्रतिक्रिया के उचित विभाजन के लिए महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि कुओं में कोई बुलबुले दिखाई नहीं दे रहे हैं। यदि आवश्यक हो, तो प्लेट को अधिकतम 4 घंटे के लिए बूंद उत्पादन से पहले 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। यदि आयोजित किया जाता है, तो प्लेट को बूंद उत्पादन से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आने की अनुमति दें।

8. स्वचालित बूंद उत्पादन, थर्मल साइक्लिंग और ड्रॉपलेट रीडिंग

  1. स्वचालित बूंद जनरेटर में निम्नानुसार बूंदें उत्पन्न करें।
    1. टच स्क्रीन पर, नमूने वाले प्लेट मानचित्र पर स्तंभों का चयन करें। उपकरण का डेक यह इंगित करने के लिए प्रकाश देगा कि कौन से उपभोग्य सामग्रियों (डीजी 32 कारतूस, टिप्स, अपशिष्ट कंटेनर, बूंद पीढ़ी तेल) की आवश्यकता है। पीली रोशनी इंगित करती है कि एक उपभोग्य जोड़ना आवश्यक है, जबकि हरी रोशनी इंगित करती है कि पर्याप्त उपभोग्य वस्तुएं उपलब्ध हैं।
    2. ड्रॉपलेट जनरेटर को पीछे से सामने की ओर लोड करें।
    3. हाइड्रोलिसिस जांच के लिए, सुनिश्चित करें कि जांच के लिए बूंद पीढ़ी तेल स्थापित किया गया है और कुओं की संख्या के लिए पर्याप्त तेल बना हुआ है। यदि वैकल्पिक पीसीआर केमिस्टरी का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि एक संगत बूंद पीढ़ी तेल स्थापित किया गया है।
    4. ड्रॉपलेट प्लेट होल्डर में एक ठंडा ब्लॉक रखें। सुनिश्चित करें कि ब्लॉक पूरी तरह से नीले रंग का है और कोई गुलाबी दिखाई नहीं दे रहा है। कोल्ड ब्लॉक में एक नई 96-वेल डीडीपीसीआर प्लेट रखें।
    5. तैयार पीसीआर प्लेट को सैंपल प्लेट होल्डर में रखें। मशीन का ढक्कन बंद करें। बूंद उत्पादन के लिए प्रारंभ दबाएँ.
  2. बूंद के गठन के बाद, प्रति प्रतिक्रिया कुल 40 μL स्वचालित रूप से नई पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित हो जाती है।
  3. बूंद उत्पादन के पूरा होने के बाद 30 मिनट के भीतर, ठंडे ब्लॉक से बूंदों वाली प्लेट को हटा दें। धीरे-धीरे काम करें क्योंकि इस स्तर पर बूंदें सबसे नाजुक होती हैं।
  4. प्लेट में एक छेदने योग्य पन्नी सील जोड़ें। प्लेट को प्लेट सीलर में रखें और 180 डिग्री सेल्सियस पर 5 सेकंड के लिए सील करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, डीडीपीसीआर सिस्टम निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्लेट को सील करें।
  5. प्लेट को एक संगत थर्मल साइकलर में रखें। साइकिल चलाने की स्थिति दर्ज करें ( तालिका 4 देखें)।
  6. थर्मल साइक्लिंग के अंत के बाद, प्लेट को थर्मल साइकलर में पकड़ें, 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें, या इसे तुरंत पढ़ें।
    नोट: 4-12 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए प्लेट को पकड़ने से ड्रॉपलेट काउंट में सुधार हो सकता है, लेकिन इसकी आवश्यकता नहीं है। पकड़ के बिना पर्याप्त बूंदें प्राप्त की जानी चाहिए।
  7. प्लेट को ड्रॉपलेट रीडर में लोड करें, यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त रीडर तेल बना रहे और अपशिष्ट कंटेनर में पर्याप्त जगह हो। बूंदों को पढ़ें। थर्मल साइक्लिंग दीक्षा के 24 घंटे के भीतर ड्रॉपलेट रीडिंग करें।

तालिका 4: विशिष्ट थर्मल साइक्लिंग स्थितियां। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

9. डेटा विश्लेषण

नोट: पॉइसन आंकड़ों का उपयोग करके एकाग्रता की उचित गणना के लिए प्रति कुएं न्यूनतम 10,000 बूंदें आवश्यक हैं। 10,000 से कम बूंदों वाले किसी भी कुएं पर विश्लेषण का प्रयास न करें।

  1. बूंदों को सकारात्मक या नकारात्मक के रूप में परिभाषित करने के लिए एक सीमा की आवश्यकता होती है। डीडीपीसीआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक सीमा लागू करता है जो कुओं में भिन्न हो सकता है। हालांकि, मैन्युअल रूप से अधिक सुसंगत, सटीक और सटीक परिणामों के लिए एनटीसी कुओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता से थोड़ा ऊपर प्लेट के सभी कुओं के लिए एक सीमा निर्धारित करें।
    नोट: दहलीज के उचित प्लेसमेंट के लिए सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के पृथक्करण के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है और कितनी बूंद बारिश मौजूद है ( चित्रा 2 देखें)। इस उदाहरण में, बूंद आयाम ग्राफ प्रत्येक क्यूसी स्तर और एनटीसी पर उदाहरण कुएं दिखाता है। बैंगनी रेखा 1,000 की सीमा को इंगित करती है, जो नकारात्मक बूंद आबादी से थोड़ा ऊपर निर्धारित है।
  2. पॉइसन सांख्यिकीय मॉडलिंग को 95% आत्मविश्वास के साथ एकाग्रता की गणना करने के लिए कम से कम तीन सकारात्मक बूंदों की आवश्यकता होती है। शून्य, एक या दो सकारात्मक बूंदों वाले सभी कुओं को नकारात्मक मानें और शून्य27 की एकाग्रता पर सेट करें।
  3. प्रत्येक आंसू नमूने में कॉपी संख्या की वापस गणना करें।
    1. प्रतियों/μL में सांद्रता, डेटा रिपोर्ट में प्रदान की जाती है। मूल नमूने की प्रतियों / μL में एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस मान का उपयोग करें (यानी, आंसू नमूने में)।
    2. डीडीपीसीआर प्रतिक्रिया कमजोर पड़ने की गणना करने के लिए, बूंद गठन से पहले प्रारंभिक पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा को जोड़े गए टेम्पलेट की मात्रा से विभाजित करें। जब इस विधि में प्रस्तुत वॉल्यूम का उपयोग किया जाता है, तो यह 4 का मूल्य देता है।
      Equation 1
    3. मूल नमूने (चरण 6.2) से सीरियल कमजोर पड़ने कारक निर्धारित करें।
    4. नमूने में प्रतियों /μL को निर्धारित करने के लिए, प्रतियों / μL को DDPCR प्रतिक्रिया कमजोर पड़ने से गुणा करें, फिर सीरियल कमजोर पड़ने वाले कारक से। उदाहरण के लिए, डेटा रिपोर्ट में उत्पन्न प्रतियों / μL में एकाग्रता 966 थी; 5.5 μL टेम्पलेट प्रति 22 μL प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था। नमूने के 1: 50,000 सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग किया गया था।
      Equation 2
      Equation 3
    5. यदि एक ही नमूने के कई कमजोर पड़ने का परीक्षण किया गया था, तो सभी वैध, इन-रेंज कमजोर पड़ने का विश्लेषण करें और माध्य की गणना करें।
  4. प्रत्येक क्यूसी के लिए, दिए गए क्यूसी तनुकरण (प्रतियों/μL में) की सांद्रता को डीडीपीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा (20 μL) से विभाजित करके अपेक्षित प्रतियों /μL PCR प्रतिक्रिया की गणना करें। यह आगे की गणना के बिना डेटा रिपोर्ट में प्रदान किए गए प्रतियों / μL मान के लिए इस नाममात्र मूल्य की सीधी तुलना करने की अनुमति देता है।
    नोट: इस दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिनिधि परिणामों में उपयोग किए गए स्पाइक आंसू नमूनों के विश्लेषण के लिए भी किया गया था।
  5. प्रतिकृति कुओं का उपयोग करके नमूने या QC मान के नाममात्र एकाग्रता (%RE) के लिए औसत मान, मानक विचलन, भिन्नता गुणांक (%CV), और प्रतिशत सापेक्ष त्रुटि निर्धारित करें (यदि लागू हो तो कई कमजोर पड़ना शामिल हैं)।
    1. इंटर-वेल परिशुद्धता के आकलन के लिए, यदि शामिल किया गया है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से डुप्लिकेट के लिए यह निर्धारित करें।
    2. इंट्रा-परख सटीकता और परिशुद्धता के आकलन के लिए, एक बैच के भीतर उपयोग की जाने वाली प्रत्येक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला या एलिकोट के लिए यह निर्धारित करें।
    3. अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता के आकलन के लिए, शामिल बैचों में से प्रत्येक के इंट्रा-परख साधनों का उपयोग करके इसे निर्धारित करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीमा निर्धारित करने का उदाहरण। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

10. परख स्वीकृति मानदंड

  1. प्रत्येक बैच के लिए परिकलित डेटा के लिए निम्नलिखित विनिर्देशों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए करें कि बैच स्वीकार्य है या नहीं। यदि ये शर्तें पूरी नहीं होती हैं, तो बैच को अमान्य और दोहराएं।
    नोट: इन मानदंडों को पीसीआर-आधारित परख सत्यापन 18,19,20,21,22,23,24,25 पर प्रकाशित श्वेत पत्रों से आम सहमति के रूप में निर्धारित किया गया था। नैदानिक अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त लक्ष्य मानदंड को संशोधित करना आवश्यक हो सकता है।
  2. कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) नहीं
    1. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक एनटीसी कुएं में कम से कम 10,000 बूंदें हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक एनटीसी कुएं में 3 से कम सकारात्मक बूंदें हैं।
  3. क्यूसी और परख रेंज
    1. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक क्यूसी कुएं में कम से कम 10,000 बूंदें हों।
    2. सुनिश्चित करें कि क्यूसी एकाग्रता के प्रतिकृति कुओं की सटीकता ≤25.0% सीवी है, परिमाणीकरण की ऊपरी और निचली सीमाओं को छोड़कर, जहां ≤30.0% स्वीकार्य है। प्रत्येक क्यूसी सेट और एकाग्रता स्तर के लिए स्वतंत्र रूप से इसका आकलन करें।
    3. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माध्य क्यूसी स्तर पर बैक-कैलकुलेट एकाग्रता की सापेक्ष त्रुटि नाममात्र एकाग्रता (प्रतियां / पीसीआर प्रतिक्रिया) के ±25.0% आरई के भीतर है, परिमाणीकरण की ऊपरी और निचली सीमाओं को छोड़कर, जहां ±30.0% आरई स्वीकार्य है। प्रत्येक क्यूसी सेट और एकाग्रता स्तर के लिए स्वतंत्र रूप से इसका आकलन करें।
    4. सुनिश्चित करें कि क्यूसी नमूनों में से कम से कम 2/3 (जैसे, छह परिणामों में से चार) और प्रत्येक स्तर (निम्न, मध्यम, उच्च) पर क्यूसी नमूने के 50% इन दिशानिर्देशों को पूरा करते हैं।
  4. नमूने
    1. सुनिश्चित करें कि विश्लेषण किए जाने वाले नमूना कुओं में कम से कम 10,000 बूंदें हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के कमजोर पड़ने के प्रतिकृति कुओं की सटीकता ≤25.0% सीवी है।
    3. सुनिश्चित करें कि दिए गए नमूने का कम से कम एक शामिल कमजोर पड़ना परख की परिभाषित मात्रा सीमा के भीतर है, जैसा कि ऊपरी और निचली सीमा क्यूसी के आधार पर ऊपर परिभाषित किया गया है।
    4. यदि सभी कमजोर पड़ने में परिमाणीकरण की परिभाषित ऊपरी सीमा से अधिक उपज परिणाम शामिल हैं, और यदि पर्याप्त नमूना मात्रा बनी रहती है, तो नमूने के उच्च कमजोर पड़ने का उपयोग करके परख को दोहराएं।
    5. यदि सभी कमजोर पड़ने से परिमाणीकरण की निचली सीमा से कम परिणाम मिलता है, और यदि पर्याप्त नमूना मात्रा बनी रहती है, तो नमूने के कम कमजोर पड़ने का उपयोग करके परख को दोहराएं।
      नोट: तीन से अधिक सकारात्मक बूंदों वाले नमूने, लेकिन जिनकी मात्रा की निचली सीमा से नीचे एकाग्रता है, को पता लगाने योग्य के रूप में वर्णित किया जा सकता है, लेकिन मात्रात्मक नहीं।

Representative Results

प्रदर्शनकारी उद्देश्यों के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, संवर्धित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) -व्यक्त एएवी 2 वेक्टर का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई एक परख, जिसमें गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में ईजीएफपी युक्त सिंथेटिक डबल-फंसे डीएनए टुकड़े का पता लगाया गया था। वर्तमान में, इस बात पर बहस चल रही है कि क्या वेक्टर स्वयं या सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा या रैखिक प्लास्मिड क्यूसी के रूप में उपयोग के लिए सबसे उपयुक्त है। आम तौर पर, एक सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा या रैखिक प्लास्मिड का उपयोग किया जा सकता है यदि विधि विकास (डेटा नहीं दिखाया गया) में वेक्टर के लिए समानता का प्रदर्शन किया जाता है। ईजीएफपी ट्रांसजीन का पता लगाने के लिए प्राइमर और प्रोब्स को डिजाइन और अनुकूलित किया गया था। इस कार्य में प्रयुक्त अनुक्रमों के लिए अनुपूरक तालिका S1 देखें। क्यूसी टुकड़ा स्टॉक की एकाग्रता को डीडीपीसीआर का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया था। प्रोटोकॉल अनुभाग में उदाहरण के रूप में दिए गए सांद्रता और पीसीआर स्थितियों का उपयोग करके सभी परीक्षण किए गए थे।

क्यूपीसीआर परख के लिए, मानक वक्र की रैखिकता, संवेदनशीलता, गतिशील सीमा, सटीकता और परिशुद्धता का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। चूंकि डीडीपीसीआर लक्ष्य परिमाणीकरण के लिए एक मानक वक्र पर भरोसा नहीं करता है, इसलिए इन सिफारिशों को संशोधित किया जाना चाहिए। इसके बजाय, पॉइसन सांख्यिकीय मॉडलिंग के आधार पर डीडीपीसीआर प्रतिक्रिया की अपेक्षित मात्रात्मक सीमा का विस्तार करने के लिए विभिन्न सांद्रता में पतला सिंथेटिक डबल-फंसे डीएनए टुकड़ों से युक्त क्यूसी का उपयोग गतिशील सीमा और संवेदनशीलता को परिभाषित करने और सटीकता और सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए 29,30,31,32 किया गया था। क्यूसी सांद्रता का विकल्प मुख्य रूप से किसी दिए गए एकाग्रता पर एक कुएं के भीतर सकारात्मक और कुल बूंदों के अपेक्षित अनुपात पर आधारित था। गणितीय रूप से, डीडीपीसीआर सैद्धांतिक रूप से सबसे सटीक है जब लगभग 80% विभाजन सकारात्मक रूप से बढ़ते हैं। चूंकि सकारात्मक से कुल बूंद अनुपात 0.8 से ऊपर बढ़ जाता है, विभाजन की संतृप्ति के कारण सटीकता कम हो जाती है, 100% बूंदों के सकारात्मक होने के बाद परिमाणीकरण संभव नहीं होता है। कम अंत में, सैद्धांतिक रूप से, एक सकारात्मक बूंद का पता लगाया जा सकता है और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, हालांकि सटीकता खराब है और परख निम्न-स्तरीय झूठी सकारात्मकता के अधीन है। आमतौर पर, 95% आत्मविश्वास के साथ परिणाम की गणना करने के लिए कम से कम तीन बूंदें सकारात्मक होनी चाहिए, जो हमारे द्वारा यहां उपयोग की जाने वाली एकाग्रता की गणना करने की सीमा है।

पांच अलग-अलग क्यूसी सांद्रता की एक श्रृंखला तैयार की गई थी, जिसमें लक्ष्य प्रतिलिपि संख्या / μL पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा की गणना की गई थी, जिससे डीडीपीसीआर की मात्रात्मक सीमा में फैले कुल बूंद अनुपात के लिए सकारात्मक परिणाम मिलने की उम्मीद थी, जैसा कि तालिका 5 में दिखाया गया है। इनका उपयोग परख की सटीकता और परिशुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। यहां मूल्यांकन में, परिमाणीकरण की ऊपरी और निचली सीमाओं को डीडीपीसीआर में सैद्धांतिक अधिकतम संभव तक नहीं धकेला गया था। यहां प्रदर्शित की तुलना में उच्च और निम्न स्तर पर सटीक परिमाणीकरण संभव हो सकता है। रेंज को इस विधि के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संरेखण में विकसित किया जाना चाहिए।

इंट्रा-परख सटीकता और परिशुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक बैच के लिए नमूना कमजोर पड़ने वाले बफर में इन क्यूसी की कुल तीन स्वतंत्र रूप से तैयार कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार की गई थी। प्रत्येक क्यूसी कमजोर पड़ने के डुप्लिकेट कुएं शामिल किए गए थे। एक वास्तविक सत्यापन प्रोटोकॉल का अनुकरण करने के लिए, कई दिनों में कई विश्लेषकों द्वारा कुल छह सटीकता और सटीक बैच किए गए थे। इन छह बैचों के परिणामों का विश्लेषण इंट्रा-परख और अंतर-परख सटीकता और विधि की सटीकता और परिशुद्धता को परिभाषित करने और परख की गतिशील सीमा को परिभाषित करने के लिए किया गया था।

प्रत्येक क्यूसी स्तर पर प्रत्येक बैच के लिए इंट्रा-परख प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था। हमें उम्मीद थी कि सभी क्यूसी और एनटीसी कुओं में कम से कम 10,000 बूंदें होंगी। यह सभी छह बैचों में परीक्षण किए गए 216 कुओं में से 216 में पूरा किया गया था, जिसमें औसत बूंद ों की संख्या 19,748 बूंदों / कुएं (तालिका 6) थी। इसके बाद, प्रत्येक क्यूसी के डुप्लिकेट कुओं के प्रत्येक सेट का इंटर-वेल %CV ≤25.0% होने की उम्मीद थी, ऊपरी और निचली सीमा QC को छोड़कर, जहां ≤30.0% की उम्मीद थी। यह क्यूसी के लिए सभी छह बैचों में परीक्षण किए गए 90 कुओं में से 90 के सेट में पूरा किया गया था, जिसमें सभी क्यूसी स्तरों पर 3.9% का औसत अंतर-वेल % सीवी था (तालिका 7)। सभी क्यूसी ने ऊपर उल्लिखित अपेक्षित सीमाओं के भीतर कुल बूंद अनुपात के लिए सकारात्मक औसत प्राप्त किया (तालिका 6)।

प्रत्येक बैच के भीतर, इंट्रा-परख माध्य और मानक विचलन की गणना स्वतंत्र रूप से तैयार कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए की गई थी, और इनका उपयोग प्रत्येक परख में प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक इंट्रा-परख माध्य की गणना करने के लिए किया गया था। इसका उपयोग परख की सटीकता और परिशुद्धता का आकलन करने के लिए किया गया था (तालिका 8)। परिशुद्धता सामान्य परख स्थितियों के तहत एक ही समरूप नमूने की प्रतिकृति से डेटा में परिवर्तनशीलता को संदर्भित करती है और इसका मूल्यांकन कई शामिल एलिकोट के % सीवी की गणना करके किया जाता है। हमें उम्मीद थी कि प्रत्येक बैच के भीतर परीक्षण किए गए तीन एलिकोट एक इंट्रा-परख % सीवी ≤25.0% प्राप्त करेंगे, ऊपरी और निचली सीमा क्यूसी को छोड़कर जहां ≤30.0% की उम्मीद थी। यह 60 बैचों (30 कुल प्रदर्शनों में से 30) में से प्रत्येक में सभी पांच क्यूसी स्तरों के लिए पूरा किया गया था। आम तौर पर, लक्ष्य मानदंडों की तुलना में अधिक इंट्रा-परख परिशुद्धता प्राप्त की जा सकती है, जिसमें सभी क्यूसी स्तरों पर 7.7% का औसत इंट्रा-परख % सीवी होता है। सटीकता प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित मूल्य और नाममात्र मूल्य के बीच समझौते की निकटता को संदर्भित करती है। इसका मूल्यांकन प्रत्येक क्यूसी की गणना की गई सांद्रता और उनके सैद्धांतिक रूप से अपेक्षित नाममात्र सांद्रता के बीच प्रतिशत सापेक्ष त्रुटि (% आरई, या % पूर्वाग्रह) की गणना करके किया जाता है। यह उम्मीद की गई थी कि तीन एलिकोट का इंट्रा-परख औसत नाममात्र एकाग्रता का ±25.0% आरई होगा, ऊपरी और निचली सीमा क्यूसी को छोड़कर जहां ±30.0% की उम्मीद थी। यह 60 बैचों (30 कुल प्रदर्शनों में से 30) में से प्रत्येक में सभी पांच क्यूसी स्तरों के लिए पूरा किया गया था। आम तौर पर, हमारे लक्ष्य की तुलना में अधिक इंट्रा-परख सटीकता प्राप्त की जा सकती है, जिसमें सभी क्यूसी स्तरों पर 4.2% का औसत पूर्ण इंट्रा-परख % आरई होता है। एनटीसी (कुल 30) के सभी प्रदर्शनों में, कोई सकारात्मक बूंदें पता लगाने योग्य नहीं थीं।

प्रत्येक बैच के भीतर प्रत्येक क्यूसी स्तर के इंट्रा-परख माध्य का उपयोग करके अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता की गणना भी की गई थी। अंतर-परख परिशुद्धता ≤25.0% सीवी होने की उम्मीद थी, ऊपरी और निचली सीमा क्यूसी को छोड़कर जहां ≤30.0% की उम्मीद थी। इसी तरह, अंतर-परख सटीकता के लिए, ऊपरी और निचली सीमा क्यूसी को छोड़कर ±25.0% आरई की उम्मीद थी, जहां ±30.0% की उम्मीद थी। इन लक्ष्यों की तुलना में काफी अधिक अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता देखी गई (तालिका 9), जिसमें अंतर-परख परिशुद्धता 4.0% से 8.5% तक और अंतर-परख पूर्ण सटीकता 1.0% से 3.2% तक थी। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि यह विधि वर्तमान उद्योग लक्ष्यों के भीतर पर्याप्त अंतर-और अंतर-परख सटीकता और सटीकता प्राप्त कर सकती है। पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रति μL 2,500-2.5 प्रतियों की इस परख की एक गतिशील सीमा को इन परिणामों के आधार पर परिभाषित किया जा सकता है, जिसमें पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रति μL 2.5 प्रतियों की समग्र परख संवेदनशीलता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, व्यापक गतिशील श्रेणियों को मान्य करना संभव हो सकता है।

इसके बाद, लक्ष्य मैट्रिक्स के भीतर परख सटीकता और परिशुद्धता का मूल्यांकन करना आवश्यक था - इस मामले में, आँसू। आमतौर पर, नैदानिक अध्ययनों की शुरुआत से पहले परख को मान्य किया जाता है, जिसका अर्थ है कि वेक्टर-उपचारित रोगियों से एकत्र किए गए आँसू सत्यापन उद्देश्यों के लिए उपलब्ध होने की संभावना नहीं है। यह कृत्रिम रूप से लक्ष्य एएवी वेक्टर को स्वयंसेवक दाताओं से एकत्र किए गए आंसुओं में बढ़ाकर बनाया जा सकता है ताकि मैट्रिक्स-स्पाइक्ड क्यूसी बनाया जा सके। सिद्धांत के प्रमाण के लिए, एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त एक ईजीएफपी-व्यक्त एएवी 2 वेक्टर का उपयोग किया गया था। एएवी 2 वेक्टर स्टॉक की एकाग्रता को डीएनए अलगाव चरण के उपयोग के बिना, डीडीपीसीआर का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया था, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। प्रत्येक रन में, एएवी 2 को स्वतंत्र रूप से उच्च (अपेक्षित 1.41 x 103 प्रतियां / μL पीसीआर प्रतिक्रिया) और निम्न (28.2 प्रतियां / μL पीसीआर प्रतिक्रिया) स्तर पर तीन आंसू एलिकोट में स्पाइक किया गया था। विधि की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में अनस्पाइक्ड एलिकोट को शामिल किया गया था।

प्रत्येक स्पाइक स्तर पर प्रत्येक बैच के लिए इंट्रा-परख प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था। यह उम्मीद की गई थी कि सभी आंसू के नमूनों में कम से कम 10,000 बूंदें होंगी। यह सभी छह बैचों में परीक्षण किए गए 108 कुओं में से 108 में पूरा किया गया था, जिसमें औसत कुल बूंद संख्या 20,208 बूंदों / कुएं (तालिका 10) थी। इसके बाद, उच्च और निम्न स्पाइक स्तरों के लिए प्रत्येक क्यूसी के डुप्लिकेट कुओं के प्रत्येक सेट का इंटर-वेल % सीवी ≤25.0% होने की उम्मीद थी। क्यूसी के लिए सभी छह बैचों में परीक्षण किए गए कुओं के 36 सेटों में से 36 सेटों में इसे पूरा किया गया था, जिसमें 3.2% का औसत अंतर-वेल % सीवी था (तालिका 11)।

प्रत्येक बैच के भीतर, इंट्रा-परख माध्य और मानक विचलन की गणना स्वतंत्र रूप से तैयार आंसू स्पाइक्स में से प्रत्येक के लिए की गई थी, और इनका उपयोग प्रत्येक परख में प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक इंट्रा-परख माध्य की गणना करने के लिए किया गया था। इसका उपयोग मैट्रिक्स (तालिका 12) में परख की सटीकता और परिशुद्धता का आकलन करने के लिए किया गया था। हमें उम्मीद थी कि इंट्रा-परख % सीवी ≤25.0% और उच्च और निम्न स्पाइक स्तर होगा। यह प्रत्येक स्तर के लिए छह बैचों में से छह में पूरा किया गया था। आम तौर पर, लक्ष्य की तुलना में मैट्रिक्स में अधिक इंट्रा-परख परिशुद्धता प्राप्त की जा सकती है, जिसमें उच्च स्तर पर 3.7% का औसत इंट्रा-परख % सीवी और निम्न स्तर पर 12.2% (कुल मिलाकर 8.0%) होता है। यह भी उम्मीद की गई थी कि इंट्रा-परख % आरई दोनों स्पाइक स्तरों पर ±25.0% होगा। यह प्रत्येक स्तर के लिए छह बैचों में से छह में पूरा किया गया था। इसी तरह, यह आम तौर पर पाया गया कि लक्ष्य की तुलना में मैट्रिक्स में अधिक इंट्रा-परख सटीकता प्राप्त की जा सकती है, जिसमें निम्न स्तर पर 8.1% का औसत इंट्रा-परख पूर्ण % आरई और उच्च स्तर पर 11.3% (कुल मिलाकर 9.7%) है। अनस्पाइक्ड नियंत्रण के लिए, किसी भी एलिकोट (तालिका 12) में कोई ईजीएफपी सिग्नल का पता लगाने योग्य नहीं था, जो मानव आंसू मैट्रिक्स में विधि की विशिष्टता का प्रदर्शन करता है।

आंसू मैट्रिक्स में अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता की गणना प्रत्येक बैच के भीतर प्रत्येक स्पाइक स्तर के इंट्रा-परख माध्य का उपयोग करके भी की गई थी। यह उम्मीद की गई थी कि अंतर-परख परिशुद्धता ≤25.0% सीवी होगी, और अंतर-परख सटीकता के लिए, हमें ±25.0% आरई की उम्मीद थी। इन लक्ष्यों की तुलना में काफी अधिक अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता देखी गई (तालिका 13), उच्च स्तर पर 5.5% और निम्न स्तर पर 7.1% की अंतर-परख सटीकता के साथ, और उच्च स्तर पर 11.3% और निम्न स्तर पर 8.1% की पूर्ण अंतर-परख सटीकता के साथ। सामूहिक रूप से, ये परिणाम आंसू मैट्रिक्स में विधि की सटीकता, परिशुद्धता और विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं।

तालिका 5: परख की गतिशील सीमा को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले गुणवत्ता नियंत्रण। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 6: सिंथेटिक डबल-फंसे डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण और एनटीसी के कुल बूंद अनुपात में कुल बूंद ों की संख्या और सकारात्मक। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 7: क्यूसी इंटर-वेल आंकड़े (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 8: इंट्रा-परख सटीकता और क्यूसी की सटीकता (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 9: क्यूसी की अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। संक्षेप: यूएलक्यूसी = ऊपरी सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; एचक्यूसी = उच्च गुणवत्ता नियंत्रण; एमक्यूसी = मध्यम गुणवत्ता नियंत्रण; एलक्यूसी = कम गुणवत्ता नियंत्रण; एलएलक्यूसी = कम सीमा गुणवत्ता नियंत्रण; NTC = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 10: आंसू के नमूनों की कुल बूंद गिनती। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 11: आंसू नमूना अंतर-अच्छी तरह से आंकड़े (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 12: आंसू नमूनों की इंट्रा-परख सटीकता और परिशुद्धता (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 13: आंसू नमूनों की अंतर-परख सटीकता और परिशुद्धता (कॉपी लक्ष्य / μL पीसीआर प्रतिक्रिया)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका एस 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर, जांच और सिंथेटिक डबल-फंसे डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण के अनुक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

डीडीपीसीआर प्रोटोकॉल के कई चरण हैं जो परख के उचित प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम प्राइमरों और जांच का डिजाइन और अनुकूलन है। सामान्य तौर पर, प्रीक्लिनिकल या नैदानिक सेटिंग में डाई-आधारित रसायन विज्ञान (जैसे, एसवाईबीआर ग्रीन) पर हाइड्रोलिसिस जांच-आधारित रसायन विज्ञान का उपयोग उनकी बेहतर विशिष्टता के कारण अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, प्रवर्धन लक्ष्य का विकल्प एक महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, वेक्टर के हित के ट्रांसजीन को लक्षित किया जाता है। हालांकि, पहले प्रीक्लिनिकल चरणों में या वैक्टर में जहां वेक्टर ट्रांसजेन बनाम जीनोमिक डीएनए को अलग करना संभव नहीं हो सकता है, मानकीकृत वेक्टर लक्ष्यों का उपयोग करना उचित हो सकता है। उदाहरण के लिए, कोई इन वेक्टर घटकों के बीच उल्टे टर्मिनल रिपीट क्षेत्र, प्रमोटर, पॉली-ए टेल, या अंतर-खंड जंक्शनों को लक्षित कर सकता है। लक्ष्य की पसंद वेक्टर डिजाइन के आधार पर अलग-अलग होगी। पारंपरिक क्यूपीसीआर प्राइमर और जांच डिजाइन रणनीतियों और सॉफ्टवेयर आमतौर पर डीडीपीसीआर के लिए उपयुक्त हैं। डिजाइन पैरामीटर जो एक सुसंगत एनीलिंग तापमान (उदाहरण के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस) उत्पन्न करने की उम्मीद करते हैं, उन्हें आवश्यक अनुकूलन की मात्रा को कम करने के लिए चुना जाना चाहिए। प्रत्येक लक्ष्य के लिए कम से कम तीन अलग-अलग सेटों को डिजाइन, आदेश और मूल्यांकन करने की भी सिफारिश की गई है। फिर किसी को उस सेट का चयन करना चाहिए जो सबसे बड़ी विशिष्टता दिखाता है (नकारात्मक नियंत्रण में या संबंधित लक्ष्य डीएनए के मैट्रिक्स में कोई प्रवर्धन नहीं) और संवेदनशीलता (यानी, पहचान की सीमा)20।

यदि क्यूपीसीआर और डीडीपीसीआर के बीच परख को संक्रमण करने में सक्षम होना फायदेमंद है, तो पहले क्यूपीसीआर का उपयोग करके परख स्थितियों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है, और चयनित सेट के लिए स्थितियों की पहचान करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप आर2 ≥ 0.98 के साथ 90% -110% की प्रवर्धन क्षमता होती है। हालांकि, एक समापन बिंदु विधि के रूप में डीडीपीसीआर आमतौर पर प्रवर्धन क्षमता में भिन्नता के कारण क्यूपीसीआर की तुलना में कम संवेदनशील होता है। कम से कम, अपेक्षित एनीलिंग तापमान से ऊपर और नीचे के तापमान को कवर करने और तापमान के कार्य के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक बूंद समूहों के बीच बारिश और फ्लोरोसेंट आयाम पृथक्करण का मूल्यांकन करने के लिए एनीलिंग / विस्तार चरण में थर्मल तापमान ढाल चलाने की सिफारिश की जाती है। यदि कार्यस्थान अनुमति देता है, तो मास्टर मिक्स तैयारी, टेम्पलेट जोड़ने और प्रवर्धन के लिए अलग-अलग समर्पित वर्कस्टेशन रखने की सिफारिश की जाती है। जहां संभव हो, इन्हें भौतिक रूप से अंतर्निहित इंजीनियरिंग नियंत्रणों के साथ एक यूनिडायरेक्शनल वर्कफ़्लो द्वारा अलग किया जाना चाहिए, जैसे कि नियंत्रित पहुंच और अंतर वायु दबाव, क्रॉस संदूषण और झूठे सकारात्मक के जोखिम को कम करने के लिए। यदि यह संभव नहीं है, तो क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में दो चरण हैं जो उन लोगों के लिए असामान्य दिखाई दे सकते हैं जो क्यूपीसीआर परख विकास के अधिक आदी हैं। पहला पीसीआर मास्टर मिश्रण में एक प्रतिबंध एंजाइम का समावेश है। डीडीपीसीआर प्रवर्धन के दौरान, प्रत्येक बूंद को समापन बिंदु तक थर्मोसाइकिल किया जाता है। एक उचित रूप से अनुकूलित परख में, इसके परिणामस्वरूप बूंदों की दो आबादी होती है, एक सेट फ्लोरोसेंट संकेतों के लगातार उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है- सकारात्मक- और दूसरा लगातार फ्लोरोसेंट सिग्नल के निम्न स्तर को प्रदर्शित करता है- नकारात्मक। यदि पीसीआर हस्तक्षेप होता है, तो यह पीसीआर प्रवर्धन की शुरुआत को डीसिंक्रनाइज़ कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बूंद एक प्रवर्धन पठार तक नहीं पहुंच पाती है, और इस प्रकार असंगत फ्लोरोसेंट एंडपॉइंट होते हैं। इस मामले में, बूंदों को नकारात्मक और सकारात्मक के बीच वितरित किया जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप डीडीपीसीआर बारिश नामक घटना होगी। इसके परिणामस्वरूप लक्ष्य का गलत परिमाणीकरण और असंगत और व्यक्तिपरक रूप से लागू थ्रेसहोल्ड हो सकता है। एनटीसी के सिग्नल से थोड़ा ऊपर सीमा निर्धारित करने की हमारी सिफारिश, जिसे अंतिम परिमाणीकरण में बारिश के प्रभाव को कम करना चाहिए क्योंकि सभी बूंदों को अभी भी सकारात्मक माना जाता है, भले ही समापन बिंदु पर पूरी तरह से चक्रित न किया जाए। एएवी में एक अत्यधिक जटिल माध्यमिक संरचना होती है, जो प्रवर्धन लक्ष्य के आधार पर, प्राइमरों और जांच तक पहुंच को कम कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर हस्तक्षेप होता है और इस प्रकार बारिश होती है। मास्टर मिक्स में प्रतिबंध एंजाइम को शामिल करने से इस द्वितीयक संरचना को प्राइमरों और जांच द्वारा पहुंच बढ़ाने के लिए छोड़ दिया जाता है, जिससे बारिश कम हो जाती है, जिससे परख की सटीकता में सुधार हो सकता है। डीडीपीसीआर प्रतिक्रिया में एक प्रतिबंध एंजाइम को शामिल करने के प्रभावों को पहले25,32 वर्णित किया गया है। किसी भी प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि यह लक्ष्य प्रवर्धन क्षेत्र के भीतर कटौती नहीं करने की पुष्टि की जाती है। कोई प्रीडाइजेशन स्टेप या वैकल्पिक बफर रचनाओं की आवश्यकता नहीं है।

दूसरा असामान्य कदम एएवी युक्त आंसू नमूने की तैयारी है। इस प्रोटोकॉल में, आँसू के 1: 10 (या अधिक) अनुपात का उपयोग किया गया था और बाद में नमूने को गर्म किया गया था। आमतौर पर, जब आँसू एक केशिका ट्यूब के माध्यम से एकत्र किए जाते हैं, जो एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली संग्रह विधि है, तो औसतन लगभग 10.0 μLएकत्र किया जा सकता है। कमजोर पड़ने से सीमित नमूना मात्रा को संबोधित करने और डुप्लिकेट अच्छी तरह से परीक्षण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करने में मदद मिलती है। हालांकि यह पता लगाने की सैद्धांतिक सीमा को कम करता है, डीडीपीसीआर की मजबूत संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप अभी भी वेक्टर कणों की एक बहुत कम संख्या का पता लगाया जाना चाहिए। यह दृष्टिकोण अतिरिक्त रूप से एक "बैकअप" बनाता है यदि कोई अप्रत्याशित रूप से विफल हो जाता है। इस मामले में, या दो कुओं को चलाने के लिए अपर्याप्त नमूना मात्रा के मामलों में, परिशुद्धता का आकलन करने के लिए पॉइसन त्रुटि का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, ऐसे मामलों में जहां एकाग्रता पहचान की सीमा से नीचे है, यह एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से डेटा को विलय करने का अवसर बनाता है। डीडीपीसीआर का पता लगाने के लिए वायरल कैप्सिड ्स से एएवी वैक्टर को मुक्त करना आवश्यक है। एएवी के परिमाणीकरण के लिए कुछ तरीकों में वायरल कैप्सिड34,35,36 को हटाने के लिए एक प्रोटीन के पाचन चरण शामिल है। सभी प्राकृतिक रूप से होने वाले एएवी सीरोटाइप में लगभग 90 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे पिघलने का तापमान होता है, जिसमें से अधिकांश 80 डिग्री सेल्सियस से नीचे गिर जाते हैं; इसलिए, यह एकअनावश्यक समावेश प्रतीत होता है। वेक्टर डीएनए को जारी करने के लिए अकेले हीटिंग पर्याप्त प्रतीत होता है।

इसके अलावा, डीडीपीसीआर आमतौर पर पीसीआर अवरोधकों के लिए कम संवेदनशील होता है जो एक नमूने में मौजूद हो सकता है जो क्यूपीसीआर परख को प्रभावित कर सकता है। यदि एक विशिष्ट डीएनए अलगाव चरण शामिल है, तो इसके लिए विशिष्ट सत्यापन की भी आवश्यकता होगी, जिसे इस प्रोटोकॉल में टाला जाता है। एक तरल में वेक्टर जीनोम के प्रसार के कैनेटीक्स के कारण नमूने गर्म होने से पहले पतला हो जाते हैं। हीटिंग और बाद में शीतलन प्रक्रिया के दौरान, एकल-फंसे हुए डीएनए जीनोम के सकारात्मक और नकारात्मक अर्थ किस्में एक डबल-फंसे हुए मध्यवर्ती का उत्पादन करने के लिए एक साथ नष्ट हो सकती हैं यदि सांद्रता पर्याप्त रूप से अधिक है। हीटिंग से पहले कमजोर पड़ने से सांद्रता कम हो जाती है और गणितीय रूप से यह संभावना नहीं होती है कि पर्याप्त डबल-फंसे हुए मध्यवर्ती मात्रा की सटीकता पर प्रतिकूल प्रभाव डालते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या रैखिक प्लास्मिड को इस हीटिंग चरण से नहीं गुजरना चाहिए। चूंकि ये डबल-फंसे हुए हैं, हीटिंग के परिणामस्वरूप एकल-फंसे हुए मध्यवर्ती में रूपांतरण होगा। इन एकल-फंसे हुए क्यूसी को बूंदों में स्वतंत्र रूप से विभाजित करने के बाद, इसके परिणामस्वरूप नाममात्र एकाग्रता के सापेक्ष क्यूसी एकाग्रता में दो गुना वृद्धि होने की उम्मीद होगी। वैकल्पिक रूप से, यदि क्यूसी को विधि को मानकीकृत करने के लिए गर्म किया जाना है, तो इसे नाममात्र एकाग्रता के पुनर्गठन और असाइनमेंट में शामिल किया जाना चाहिए।

अंत में, नमूना तैयार करने के संबंध में, कई प्रोटोकॉल किसी भी अनकैप्सिडेटेड वेक्टर डीएनए को हटाने के लिए डीनेस उपचार चरण को शामिल करने की भी सलाह देते हैं। यह कदम उन मामलों में महत्वपूर्ण है जहां वेक्टर तैयारी से जुड़े मुक्त डीएनए को निर्धारित करना वांछित नहीं है (जैसे कि खुराक उद्देश्यों के लिए परिमाणीकरण के दौरान)। हालांकि, जैव वितरण और बायोशेडिंग अध्ययनों के संदर्भ में, कोई आम तौर पर यह जानना चाहता है कि किसी भी वेक्टर डीएनए ने कहां यात्रा की है, भले ही यह एनकैप्सिटेड हो या नहीं। इसलिए, आमतौर पर ऐसे अध्ययनों के दौरान डीनेस उपचार चरण नहीं करने का सुझाव दिया जाता है। यदि DNase चरण को शामिल करना आवश्यक है, तो यह चरण कमजोर पड़ने और हीटिंग से पहले होना चाहिए।

इस पेपर में, एक फिट-फॉर-उद्देश्य, अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास अनुपालन सत्यापन के संदर्भ में विधि की गतिशील सीमा, संवेदनशीलता, सटीकता और परिशुद्धता के आकलन के दृष्टिकोण के डेटा प्रतिनिधि प्रस्तुत किए जाते हैं। इस विषय पर मार्गदर्शन की वर्तमान कमी प्रयोगशालाओं को वर्तमान उद्योग सोच के अनुरूप अपने लिए लक्ष्य परख मानदंड निर्धारित करने के लिए मान्य करती है। विभिन्न समूहों ने इस अध्ययन में उपयोग किए गए उच्च और निम्न लक्ष्य मानदंडदोनों को प्रस्तुत किया है 19,20,21,22,23,24,25। लक्ष्य परख मानदंड, जब तक कि अधिक कठोर रूप से परिभाषित नहीं किया जाता है, विधि के इच्छित नैदानिक अनुप्रयोगों के आधार पर सत्यापन से पहले चुना जाना चाहिए। डेटा के आधार पर किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम निर्णयों के आधार पर, सटीकता और परिशुद्धता के उच्च स्तर की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, एक साधारण सकारात्मक बनाम नकारात्मक परिणाम पर्याप्त हो सकता है।

दृष्टिकोण ने विशिष्टता और मैट्रिक्स प्रभाव के आकलन के लिए सिफारिशों को भी संबोधित किया। अनुपचारित व्यक्तियों से एकत्र किए गए आंसुओं का एक पूल इस परख में सकारात्मक परिणाम देने में विफल रहा, जबकि लक्ष्य का पता तब लगाया जा सकता था जब वेक्टर को अनुशंसित वसूली दरों के भीतर उच्च और निम्न सांद्रता पर आंसुओं में बढ़ाया गया था। आदर्श रूप से, अंतर्जात वेक्टर युक्त मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, वायरल वेक्टर के साथ उपचार के बाद एकत्र किया गया) को भी इन आकलनों में शामिल किया जाएगा। हालांकि, यह संभावना नहीं है कि ऐसे नमूने सत्यापन में उपयोग के लिए उपलब्ध होंगे। सत्यापन की मजबूती को बढ़ाने के लिए, विभिन्न व्यक्तियों से एकत्र किए गए आँसू या आँसू के कई पूल का मूल्यांकन यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि रोगी-विशिष्ट मैट्रिक्स प्रभाव होता है या नहीं। अंत में, स्थिरता का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। वर्कफ़्लोज़ में जहां डीएनए निष्कर्षण जैविक मैट्रिक्स से बाहर होता है, नमूना और निकाले गए डीएनए दोनों की स्थिरता का मूल्यांकन करना आवश्यक हो सकता है। इस वर्कफ़्लो में, डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकता के बिना नमूने को सीधे परख में परीक्षण किया जाता है। इसलिए, इस विधि के लिए स्थिरता के मूल्यांकन को ध्यान में रखते हुए, आंसू के नमूनों की स्थिरता का मूल्यांकन करना चाहिए। आमतौर पर, बेंचटॉप, रेफ्रिजरेटर, फ्रीज / पिघलना, और दीर्घकालिक स्थिरता आकलन की सिफारिश की जाती है। ये इस अध्ययन के हिस्से के रूप में नहीं किए गए थे, लेकिन इनपुट नमूनों में जोड़तोड़ के बाद, यहां विकसित तरीकों का उपयोग इस मूल्यांकन में किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, इस विधि को आंसू के नमूनों में एएवी-आधारित वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मजबूत, दोहराने योग्य और मान्य परख के रूप में प्रदर्शित किया गया है। यह नैदानिक परीक्षणों का समर्थन करने के लिए विशिष्ट वैक्टर के लिए अनुकूलित होने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुरूप परख के सत्यापन के लिए एक आधार प्रदान करता है।

Disclosures

सभी लेखक केसीएएस बायोएनालिटिकल एंड बायोमार्कर सर्विसेज के कर्मचारी हैं, जो एक अनुबंध अनुसंधान संगठन है जो उत्पाद पंजीकरण के माध्यम से प्रारंभिक खोज समर्थन से व्यापक अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं / अच्छी नैदानिक प्रथाओं के अनुरूप विकास सेवाएं प्रदान करता है, जिसमें एएवी-आधारित परख का समर्थन करना शामिल है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। केसीएएस ने इस परियोजना और इस प्रोटोकॉल के प्रकाशन को वित्त पोषित किया। जबकि इस पेपर में प्रस्तुत प्रयोगों के डिजाइन और सत्यापन के लिए कोई वर्तमान एफडीए दिशानिर्देश नहीं हैं, केसीएएस में इस तरह के अध्ययन विकसित करने वाले विशेषज्ञों और विचारकों ने इस दृष्टिकोण को बेसलाइन दृष्टिकोण के रूप में अपनाया है। अतिरिक्त मानदंडों और मापदंडों पर परियोजना-दर-परियोजना आधार पर चर्चा की जाती है और इच्छित उपयोग के आधार पर शामिल किया जा सकता है।

Acknowledgments

हम इस पद्धति के विकास के दौरान उनकी सहायक चर्चाओं के लिए बायो-रैड के निक रसेल और ब्रैंडन मैककेथन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV-eGFP Vector Charles River Laboratories RS-AAV2-FL Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector
AutoDG Droplet Digital PCR system Bio-Rad QX200 Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
AutoDG Oil for Probes Bio-Rad 1864110 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 1863004 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Piercable Foil Seals Bio-Rad 1814040 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad 12001925 Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023, 1863024, or 1863025 Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.
DG32 AutoDG Cartidges Bio-Rad 1864108 Or use material compatible with ddPCR system.
Droplet Reader Bio-Rad QX200 Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
GeneAmp PCR Buffer Applied Biosystems N8080129 N/A
Nuclease-Free Water Ambion AM9906 N/A
PCR Plate Sealer Bio-Rad PX1 Or use material compatible with ddPCR system.
Pipet Tips for AutoDG Bio-Rad 1864120 Or use material compatible with ddPCR system.
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant Gibco 24040 N/A
Primer and Hydrolysis Probes Various Various Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.
Restriction Enzyme Various Various Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence
Sheared salmon sperm DNA ThermoFisher AM9680 N/A
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid Various Various Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control
TE Buffer Teknova T0224 Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0
Touch Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Or use material compatible with ddPCR system.

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आंसुओं के बायोशेडिंग अध्ययन में एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मान्य ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन परख
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Longacre, B., Souaysene, A.,… More

Longacre, B., Souaysene, A., Vyhlidal, C. A., Pennington, M. R. A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears. J. Vis. Exp. (197), e65495, doi:10.3791/65495 (2023).

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