Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Brug af Live Cell STED-billeddannelse til at visualisere mitokondriel indre membran ultrastruktur i neuronale cellemodeller

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65561
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

Summary

Denne protokol præsenterer en arbejdsgang til formering, differentiering og farvning af dyrkede SH-SY5Y-celler og primære rottehippocampale neuroner til mitokondriel ultrastrukturvisualisering og analyse ved hjælp af stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi.

Abstract

Mitokondrier spiller mange vigtige roller i cellen, herunder energiproduktion, regulering af Ca2+ homeostase, lipidbiosyntese og produktion af reaktive iltarter (ROS). Disse mitokondrie-medierede processer påtager sig specialiserede roller i neuroner, koordinerer aerob metabolisme for at imødekomme disse cellers høje energibehov, modulerer Ca2+ signalering, tilvejebringer lipider til axonvækst og regenerering og indstiller ROS-produktion til neuronal udvikling og funktion. Mitokondriel dysfunktion er derfor en central drivkraft i neurodegenerative sygdomme. Mitokondriel struktur og funktion er uløseligt forbundet. Den morfologisk komplekse indre membran med strukturelle indfoldninger kaldet cristae har mange molekylære systemer, der udfører mitokondriernes signaturprocesser. De arkitektoniske træk ved den indre membran er ultrastrukturelle og derfor for små til at blive visualiseret ved traditionel diffraktionsbegrænset opløst mikroskopi. Således er de fleste indsigter i mitokondriel ultrastruktur kommet fra elektronmikroskopi på faste prøver. Imidlertid giver nye teknologier inden for superopløsningsfluorescensmikroskopi nu opløsning ned til snesevis af nanometer, hvilket muliggør visualisering af ultrastrukturelle træk i levende celler. Superopløsningsbilleddannelse giver derfor en hidtil uset evne til direkte at afbilde fine detaljer om mitokondriestruktur, proteinfordelinger i nanoskala og cristae-dynamik, hvilket giver grundlæggende ny indsigt, der forbinder mitokondrier med menneskers sundhed og sygdom. Denne protokol præsenterer brugen af stimuleret emissionsudtømning (STED) superopløsningsmikroskopi til at visualisere mitokondriel ultrastruktur af levende humane neuroblastomceller og primære rotteneuroner. Denne procedure er organiseret i fem sektioner: (1) vækst og differentiering af SH-SY5Y-cellelinjen, (2) isolering, plettering og vækst af primære rottehippocampale neuroner, (3) procedurer til farvning af celler til levende STED-billeddannelse, (4) procedurer for levende celle STED-eksperimenter ved hjælp af et STED-mikroskop til reference og (5) vejledning til segmentering og billedbehandling ved hjælp af eksempler til måling og kvantificering af morfologiske egenskaber ved den indre membran.

Introduction

Mitokondrier er eukaryote organeller af endosymbiotisk oprindelse, der er ansvarlige for at regulere flere vigtige cellulære processer, herunder mellemliggende metabolisme og ATP-produktion, ionhomeostase, lipidbiosyntese og programmeret celledød (apoptose). Disse organeller er topologisk komplekse og indeholder et dobbeltmembransystem, der etablerer flere underrum1 (figur 1A). Den ydre mitokondriemembran (OMM) grænseflader med cytosolen og etablerer direkte interorganelkontakter 2,3. Den indre mitokondriemembran (IMM) er en energibesparende membran, der opretholder iongradienter, der primært er lagret som et elektrisk membranpotentiale (ΔΨm) til at drive ATP-syntese og andre energikrævende processer 4,5. IMM er yderligere opdelt i den indre grænsemembran (IBM), som er tæt presset til OMM, og fremspringende strukturer kaldet cristae, der er bundet af cristaemembranen (CM). Denne membran afgrænser det inderste matrixrum fra det intracritale rum (ICS) og intermembranrummet (IMS).

Mitokondrier har en dynamisk morfologi baseret på kontinuerlige og afbalancerede processer af fission og fusion, der styres af mekanoenzymer af dynamin superfamilien6. Fusion giver mulighed for øget konnektivitet og dannelse af retikulære netværk, mens fission fører til mitokondriel fragmentering og gør det muligt at fjerne beskadigede mitokondrier ved mitofagi7. Mitokondriel morfologi varierer efter vævstype8 og udviklingstrin9 og reguleres for at give cellerne mulighed for at tilpasse sig faktorer, herunder energibehov 10,11 og stressorer12. Standard morfometriske egenskaber ved mitokondrier, såsom omfanget af netværksdannelse (sammenkoblet vs. fragmenteret), omkreds, areal, volumen, længde (billedformat), rundhed og grad af forgrening, kan måles og kvantificeres ved standard optisk mikroskopi, fordi størrelserne af disse funktioner er større end diffraktionsgrænsen for lys (~ 200 nm)13.

Cristae-arkitekturen definerer mitokondriernes indre struktur (figur 1B). Mangfoldigheden af cristae-morfologier kan bredt kategoriseres som flad (lamellær eller discoidal) eller rørformet-vesikulær14. Alle cristae fastgøres på IBM gennem rørformede eller slotlignende strukturer kaldet cristae junctions (CJ'er), der kan tjene til at opdele IMS fra ICS og IBM fra CM15. Cristae-morfologi reguleres af IMM's nøgleproteinkomplekser, herunder (1) mitokondriekontaktstedet og cristae-organisationssystemet (MICOS), der ligger ved CJ'er og stabiliserer IMM-OMM-kontakter 16, (2) den optiske atrofi 1 (OPA1) GTPase, der regulerer cristae-remodellering17,18,19 og (3) F1FO ATP-syntase, der danner stabiliserende oligomere samlinger ved cristae-spidser (CT'er)20, 21. Derudover er IMM beriget med ikke-dobbeltlags fosfolipider phosphatidylethanolamin og cardiolipin, der stabiliserer den stærkt buede IMM22. Cristae er også dynamiske og demonstrerer morfologiske ændringer under forskellige forhold, såsom forskellige metaboliske tilstande 23,24, med forskellige åndedrætssubstrater 25, under sult og oxidativ stress 26,27, med apoptose 28,29 og med aldring 30. For nylig har det vist sig, at cristae kunne gennemgå større ombygningsbegivenheder på en tidsskala på sekunder, hvilket understreger deres dynamiske natur31. Flere træk ved cristae kan kvantificeres, herunder dimensioner af strukturer inden for individuelle cristae (f.eks. CJ-bredde, crista-længde og bredde) og parametre, der relaterer individuel crista til andre strukturer (f.eks. intra-cristae-afstand og cristae-hændelsesvinkel i forhold til OMM)32. Disse kvantificerbare cristae-parametre viser en direkte sammenhæng med funktion. For eksempel er omfanget af mitokondriel ATP-produktion positivt relateret til mængden af cristae, kvantificeret som cristae-densitet eller cristae-tal normaliseret til en anden funktion (f.eks. Cristae pr. OMM-areal)33,34,35. Fordi IMM-morfologi er defineret af nanoskalafunktioner, omfatter den mitokondriel ultrastruktur, som kræver billeddannelsesteknikker, der giver opløsning, der er større end lysdiffraktionsgrænsen. Som beskrevet nedenfor omfatter sådanne teknikker elektronmikroskopi og superopløsningsmikroskopi (nanoskopi).

De neurale og gliale celler i centralnervesystemet (CNS) er særligt afhængige af mitokondriefunktionen. I gennemsnit udgør hjernen kun 2% af den samlede kropsvægt, men bruger 25% af den samlede kropsglukose og tegner sig for 20% af kroppens iltforbrug, hvilket gør den sårbar over for forringelser i energimetabolisme36. Progressive neurodegenerative sygdomme (ND'er), herunder Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sygdom (HD), multipel sklerose (MS) og Parkinsons sygdom (PD), er nogle af de mest omfattende undersøgte patologier til dato, med forskningsindsats, der spænder fra at forstå de molekylære grundlag for disse sygdomme til at søge potentiel terapeutisk forebyggelse og interventioner. ND'er er forbundet med øget oxidativt stress, der delvis stammer fra reaktive iltarter (ROS) genereret af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC)37, samt ændret mitokondriel calciumhåndtering38 og mitokondriel lipidmetabolisme39. Disse fysiologiske ændringer ledsages af bemærkede defekter i mitokondriel morfologi, der er forbundet med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 og PD 51,52,53. Disse strukturelle og funktionelle defekter kan kobles af komplekse årsagssammenhænge. For eksempel, da cristae-morfologi stabiliserer OXPHOS-enzymer54, genereres mitokondriel ROS ikke kun af ETC, men de virker også til at skade infrastrukturen, hvor ETC befinder sig, og fremmer en feed-forward ROS-cyklus, der forbedrer modtageligheden for oxidativ skade. Desuden har cristae disorganisering vist sig at udløse processer såsom mitokondrie-DNA (mtDNA) frigivelse og inflammatoriske veje forbundet med autoimmune, metaboliske og aldersrelaterede lidelser55. Derfor er analyse af mitokondriestruktur nøglen til en fuld forståelse af ND'er og deres molekylære underlag.

Populære metoder til visning af cristae, herunder transmissionselektronmikroskopi, elektrontomografi og kryo-elektrontomografi (kryo-ET) og røntgentomografi, især kryoblød røntgentomografi, har afsløret vigtige fund og arbejde med en række prøvetyper 56,57,58,59,60. På trods af de seneste fremskridt mod bedre observation af organellær ultrastruktur kommer disse metoder stadig med det forbehold, at de kræver prøvefiksering og kan derfor ikke fange realtidsdynamikken i cristae direkte. Superopløsningsfluorescensmikroskopi, især i form af struktureret belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), ekspansionsmikroskopi (ExM) og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi, er blevet populære måder at se strukturer, der kræver opløsning under diffraktionsgrænsen, der begrænser klassiske metoder til optisk mikroskopi. Når ExM bruges sammen med en anden superopløsningsteknik, er resultaterne imponerende, men prøven skal fastgøres og farves i en gel61. Til sammenligning er SIM, PALM / STORM og STED alle blevet brugt med succes med levende prøver, og nye og lovende farvestoffer, der generelt pletter IMM, giver en ny og nem tilgang til live billeddannelse af mitokondrier cristae dynamics 62,63,64,65,66. Nylige fremskridt inden for levende farvestoffer til STED-billeddannelse har forbedret farvestoffets lysstyrke og fotostabilitet, og disse farvestoffer målretter IMM mod en højere grad af specificitet end deres forgængere. Disse udviklinger tillader indsamling af langsigtede timelapse- og z-stack-eksperimenter med superopløsningsbilleddannelse, hvilket åbner døren for bedre levende celleanalyse af mitokondriel ultrastruktur og dynamik.

Heri leveres protokoller til levende cellebilleddannelse af udifferentierede og differentierede SH-SY5Y-celler farvet med PKmito Orange (PKMO) farvestof ved anvendelse af STED63. SH-SY5Y-cellelinjen er et tre gange subklonet derivat fra forældrecellelinjen, SK-N-SH, genereret fra en knoglemarvsbiopsi af metastatisk neuroblastom67,68,69,70. Denne cellelinje er en almindeligt anvendt in vitro-model i ND-forskning, især med sygdomme som AD, HD og PD, hvor mitokondriel dysfunktion er stærkt impliceret 10,43,71,72,73. Evnen til at differentiere SH-SY5Y-celler til celler med en neuronlignende fænotype gennem manipulering af kulturmedier har vist sig at være en passende model til neurovidenskabelig forskning uden at stole på primære neuronale celler10,74. I denne protokol blev retinsyre (RA) tilsat til cellekulturmediet for at inducere differentieringen af SH-SY5Y-celler. RA er et vitamin A-derivat og har vist sig at regulere cellecyklussen og fremme ekspressionen af transkriptionsfaktorer, der regulerer neuronal differentiering75. En protokol til dyrkning og levende cellebilleddannelse af neuroner isoleret fra rottehippocampus er også tilvejebragt. Hippocampus har vist sig at være påvirket af mitokondriel degeneration og spiller sammen med cortex en vigtig rolle i aldring og ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. Formering og differentiering af SH-SY5Y-celler

  1. Forberedelse af medier til cellevækst og vedligeholdelse
    1. Forbered komplet, højglukose Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, 4,5 g / L D-glucose, 4 mM L-glutamin, 110 mg / L natriumpyruvat) suppleret med et sidste 1% (v / v) antibiotikum-antimykotisk (10.000 enheder / ml penicillin, 10.000 μg / ml streptomycin og 25 μg / ml amphotericin B) og varierende mængder føtalt bovint serum (FBS) (se materialetabel). FBS-beløb i differentieringsmedier varierer mellem endelige 10%, 5% eller 2% (v / v) FBS.
  2. Vedligeholdelse af celler
    1. Vedligehold cellerne i DMEM suppleret med 10% (v / v) FBS og placer dem ved 37 ° C og 5% CO2, derefter frø i DMEM indeholdende 5% (v / v) FBS til differentiering. Frosne cellestammer blev opbevaret i FBS med 10% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO) ved 1-2 x 107 celler / ml.
  3. Fremstilling af retinsyre (RA)
    1. 7,51 mg all-trans-RA (se materialetabellen) opløses i 5 ml frisklavet 95% ethanol for at opnå 5 mM stamopløsning. Absorbanskoncentrationen kontrolleres ved 350 nm (ɛ = 44,300 M-1 cm-1) fra produktdatabladet i fabrikantens protokol81 ved hjælp af en fortynding af stamopløsningen ved 5 μM i ethanol. Opbevar 5 mM materiale beskyttet mod lys ved 4 °C i op til 6 uger.
  4. Fremstilling af poly-D-lysin til dækslipbelægning
    BEMÆRK: PDL-produktprotokollen (poly-D-lysin), der findes under afsnittet Dokumenter og downloads på leverandørwebsted82, indeholder oplysninger om belægning af en række kulturbeholdere.
    1. Denne protokol omfatter volumener baseret på en 2-brønds kammerbeholder med et areal på 4 cm2 pr. brønd med sterile #1,5 borosilikatdækglasbunde (se materialetabel). Stamopløsningen af PDL fortyndes dobbelt til 50 μg/ml med Dulbeccos PBS (DPBS; intet calcium, intet magnesium).
      BEMÆRK: #1.5 eller #1.5H dækglas er begge acceptable tykkelser, som er afgørende for billedkvaliteten. Andre tykkelser vil fremkalde sfærisk aberration og bør undgås.
  5. Coverslip belægning med PDL
    BEMÆRK: Dæksedler kan udsættes for ultraviolet (UV) lys i 10-15 minutter i et biosikkerhedsskab til yderligere sterilisering.
    1. Påfør 1,2 ml 50 μg/ml PDL-opløsning i hvert hul med sterile kammerdæksler i et cellekulturskab og inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Fjern PDL-opløsningen og skyl tre gange med 3,6 ml destilleret vand. Efter endt vask henstår det coatede kammer med at tørre i 2 timer og udsættes for luft, inden det skylles og straks tages i brug eller opbevares sammen med en lufttæt beholder ved 4 °C i op til 2 uger.
      BEMÆRK: Skyl dæksedlerne grundigt, da overskydende PDL kan være giftigt for celler.
  6. Differentiering af SH-SY5Y-celler med RA
    BEMÆRK: Brug ikke celler over passage 15. Celler passeres ved 80% -90% sammenløb. Differentieringsprocedurerne er forskellige, men følger de samme trin. Yderligere differentiering fra neuroblastomer til modne neuroner opnås ved yderligere behandling med hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) 68,83,84,85, men blev ikke udført i denne protokol.
    VALGFRIT: Etabler celler i mindst 24 timer før såning på dækglas. For at klargøre celler fra frosne lagre optøs hurtigt 1 ml frosset hætteglas med celler og tilsættes til 9 ml forvarmet medie suppleret med 10% FBS, centrifugeres derefter ned ved 350 x g i 10 minutter (ved stuetemperatur) og supernatant kasseres for at fjerne DMSO. Resuspender cellepillen i 5 ml forvarmede medier og frøceller i en T-25-kolbe. Når celler når 80% -90% sammenløb, passerer celler ved at tælle og pode dem til differentiering, når det er relevant.
    1. Dag 0: Frøceller.
      1. Frø cellerne på et kammerdækglas fra frosne lagre eller en arbejdskolbe. Brug en såtæthed på 1,5 x 104 celler/cm2.
        BEMÆRK: En enkelt brønd i et standard 2-brønds kammerdækglas med 4 cm2 kulturareal kræver 6,0 x 104 celler. Celler, der forbliver udifferentierede, skal podes med DMEM suppleret med 10% (v / v) FBS, og celler, der vil blive differentieret, skal podes med DMEM suppleret med 5% (v / v) FBS.
    2. Dag 1: Start RA differentieringsbehandling.
      1. Der fremstilles DMEM suppleret med 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) antibiotikum-antimykotisk og en slutkoncentration på 10 μM RA eller ethanol med samme additivvolumen for at tjene som køretøjskontrol for denne differentieringsprocedure. Fjern mediet i det kammerdækkede dækglas, der bruges til såning, skyl med 1x PBS, og tilsæt den nye DMEM til hullerne.
    3. Dag 3: Udskift medier med friske RA- eller ethanolholdige medier.
      1. Medier fjernes fra dag 1 og erstattes med friske medier suppleret med 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) antibiotikum-antimykotikum og enten 10 μM RA eller 95% ethanol med samme additivvolumen for at tjene som køretøjskontrol for denne differentieringsprocedure. Fjern mediet i det kammerdækkede dækglas, der bruges til såning, skyl med 1x PBS, og tilsæt nye medier til hullerne.
    4. Dag 6: Udfør billeddannelsen af cellerne.
      BEMÆRK: Celledifferentieringstider varierer efter protokol, men seks dages eksponering for RA er tilstrækkelig til at inducere en neuronlignende fænotype i SH-SY5Y-celler86.
      1. Udfør live-billeddannelse med detaljer i afsnit 3 og 4 (figur 2).

2. Primær rottehippocampus neuron kultur

  1. Materialer forberedelse til rotte hippocampus neuron isolering.
    1. Forbered frisk suppleret DMEM.
      1. Filtersteriliser en blanding af DMEM (høj glucose, ingen natriumpyruvat) suppleret med 10% (v / v) varmeinaktiveret FBS, 1% (v / v) natriumpyruvatopløsning og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (10.000 E / ml). Opbevares i op til 2 uger ved 4 °C.
    2. Forbered frisk suppleret neuron vækstmedier.
      1. Filtersteriliser en blanding af neuronvækstmedier suppleret med 2% (v / v) B27-tilskud, 0,25% (v / v) glutamintilskud og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (se materialetabel). Opbevares i op til 2 uger ved 4 °C.
  2. Forbered primær hippocampus neuron kultur.
    1. Forbered primær hippocampus neuronkultur efter tidligere offentliggjort arbejde87 og fra produktprotokollen på producentens websted, hvorfra den dissekerede E18 rottehippocampus opnås88 (se materialetabel). Denne protokol resulterer i en hovedsagelig neuronal population med <2% astrocytter.
      BEMÆRK: Dvalemediet, som dette væv leveres med, vil blive brugt til fremtidige trin i denne protokol. Kassér det ikke.
    2. Forbered materialer og medier til vævsdissociation.
      1. Tænd en Pasteur-pipette for at reducere blændediameteren, og opbevar den i folie for at forhindre kontaminering indtil brug. Forvarm den tilberedte DMEM, 1X Hanks bufferede saltopløsning (HBSS) og neuronvækstmedier til 37 °C. Tilsæt 2 flager DNAase med steril pincet til et 15 ml konisk rør.
    3. Udfør vævsdissociation.
      1. Så meget af dvalemediet, som den dissekerede E18-rottehippocampus opbevares i, fjernes som muligt, inden vævet anbringes i det 15 ml koniske rør, der indeholder DNAase, og inkuberes kortvarigt ved 37 °C. Tilsæt 900 μL 1X HBSS efterfulgt af 100 μL 0,5% trypsin. Vævet inkuberes ved 37 °C i 15 min.
        BEMÆRK: PDL-belagte plader kan fjernes fra opbevaring og anbringes i en inkubator indtil brug i løbet af denne inkubationstid.
    4. Udfør vævshomogenisering og celletælling.
      1. Efter inkubation med trypsin fjernes mediet, og der tilsættes 1 ml forvarmet dvalemedie-DNAase fra det foregående trin til vævet og homogeniseres med Pasteur-pipetten. Mediet vil se uigennemsigtigt ud og derefter gradvist klart, efterhånden som homogeniseringen fortsætter.
      2. Tilføj dissocierede neuroner til et nyt rør med 4 ml forvarmet DMEM, og tæl derefter cellerne ved hjælp af en celletæller.
    5. Udfør cellebelægning og vækst af primære celler.
      1. Pladeceller med en densitet på ca. 1,65 x 104 celler/cm2 i DMEM. For et dækglas med 2 brønde (4 cm 2) skal der sås 65.000 - 70.000 celler pr. Brønd med2 ml DMEM. Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO 2 i2 timer, før der kontrolleres for vedhæftning. Når cellerne begynder at klæbe, skal du fjerne 1 ml medier og erstatte det med det samme volumen dvalemedie og derefter forsigtigt omrøre for at blande. Når mediet er blandet, skal du gentage denne proces og fjerne halvdelen af det tilstedeværende medie og erstatte med det samme volumen neuronvækstmedier og derefter forsigtigt blande.
        BEMÆRK: Pletteringsdagen betragtes som dag in vitro (DIV) 0, og cellerne er klar til afbildning ved DIV 7 (figur 2).

3. Forberedelse af celler til levende cellebilleddannelse

BEMÆRK: Celletyper og oprindelse (dvs. dyrkede og primære celler) kan variere i farvningskrav; Se offentliggjorte rapporter for yderligere oplysninger62,63.

  1. Fremstilling af PKmito Orange
    BEMÆRK: Andre farvestoffer, der generelt pletter IMM, er blevet rapporteret64,65,66 og er kommercielt tilgængelige. PKMO er den eneste, der anvendes i denne protokol.
    1. Resuspender pulver PKMO (se materialetabel) i DMSO i henhold til producentens anvisninger89. Opsug mediet fra celler og vask i forvarmede phenolrøde frie medier. Forbered et lager af PKMO i forvarmet, phenolrødfri DMEM suppleret med 2% (v / v) FBS eller 10% (v / v) afhængigt af differentieringstilstand, HEPES til en endelig koncentration på 20 mM og 1% (v / v) antibiotika-antimykotikum, før cellerne farves efter producentens anvisninger. Denne formulering, uden PKMO, er levende cellebilleddannelsesmedier.
  2. Cellefarvning med PKMO
    1. Cellerne inkuberes med farvestoffet ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min. Cellerne vaskes tre gange med billeddannende levende celler, og til den endelige vask inkuberes der i 30 minutter ved 37 °C, 5 % CO2.
    2. Tilføj friske, forvarmede live-cellebilledmedier. Cellerne er nu klar til billeddannelse.
      BEMÆRK: Akutte behandlinger (f.eks. medicin og / eller stressorer), når de anvendes, tilføjes før levende billeddannelse; se afsnittet Diskussion og Supplerende figur 1.

4. Billeddannelse af levende celler ved STED-mikroskopi

BEMÆRK: Denne protokol bruger et STED-system bygget op omkring et inverteret mikroskop med det system, der er angivet i materialetabellen. Dette system er udstyret med pulserende excitationslasere (561 nm laser med nominel effekt ~ 300 μW) og en pulserende 775 nm STED-udtømningslaser (nominel effekt 1,2 W), en kontinuerligt justerbar galvanoscanner og en 615/20 nm filterbaseret lavinefotodiodedetektor (APD). Her anvendes et 100x/1,40 olienedsænkningsglas til STED. Lightbox-software bruges til billedoptagelse. Alle angivne detaljer er direkte relateret til denne software og systemopsætning.

  1. Generelle retningslinjer og trin til billedbehandling
    1. Brug en stage-top inkubator eller miljøkammer for at opretholde cellelevedygtighed, men kortsigtede rumtemperatureksperimenter er også acceptable. Disse trin er specifikke for den STED-opsætning, der er beskrevet ovenfor.
    2. Vælg laser- og filtersæt til billeddannelse.
      1. Brug parametre for et orange farvestof ved at vælge det eller de farvestoffer, der anvendes i farvningen, fra farvelisten eller det med spektrale egenskaber, der er tættest på det eller de anvendte farvestoffer. Gør disse aktive ved at dobbeltklikke eller trække dem til eksempellisten, hvor der står "Træk farvestof(r) hertil."
    3. Vælg et område, der skal afbildes.
      1. I en oversigt kan du oprette et interesseområde (ROI) omkring et mitokondrie af interesse ved at vælge den rektangulære ROI-knap og klikke og trække for at forme regionen. ROI kan ændres størrelse og roteres ved hjælp af ROI-hjørnerne eller buede kanter, der vises, mens musen holdes over et hjørne.
        BEMÆRK: En oversigt over de foreslåede billeddannelsesparametre findes i tabel 1. Disse parametre blev empirisk justeret ved hjælp af dem, der tidligere er rapporteret for denne STED-opsætning og farvekombination63.
    4. Konfigurer gating.
      1. Vælg menuen Gating ud for menuen Generelt, eller klik og hold nede for at føje menuen til visningen. Det anbefales, at STED-detektorgating justeres til 1-1,05 til 7,8-7,85 ns, som vist her. Gating tider kan variere og være så korte som 1-1.05 til 7-7.05 ns.
    5. Intensiteten justeres passende i henhold til prøven.
      BEMÆRK: Generelt er excitationseffekten, der bruges til STED, 2-3 gange den effekt, der bruges til konfokal, så en prøve, der kræver 5% excitationslasereffekt til konfokal, kan bruge 10% -15% excitationslasereffekt under STED-erhvervelse.
      1. Indstil excitationslaseren til STED til 15% -20% og STED-udtømningslaseren til 20% -25% med 10 linjeakkumuleringer. Brug en pixelopholdstid på 4 μs med en pixelstørrelse på 20-25 nm. Pinhullet blev holdt på 1,0 AU for dyrkede celler og 0,7 AU for primære hippocampale celler hos rotter for at forbedre den optiske sektionering i de tættere pakkede mitokondrier.
        BEMÆRK: Konfokale og STED-billeder kan begge erhverves til sammenligning side om side (figur 3A, B, figur 4A), eller kun STED kan hentes.
  2. Yderligere oplysninger om tidsserier/z-serier
    1. Vælg tidsserien.
      1. Vælg rullemenuen Tid. Definer antallet af gentagelser (5 brugt her) og tidsinterval (25 eller 30 sek. brugt her), der ønskes for et timelapse (figur 3C, D, figur 4B).
        BEMÆRK: Hvis intervallet er kortere end anskaffelsestiden, fortsætter iterationerne uden forsinkelse. Når du udfører en timelapse, anbefales det stærkt at aktivere en perfekt fokusenhed eller lignende fokussporing for at undgå potentiel drift.
    2. Indstil lydstyrkeområdet.
      1. Indstil z-volumenområdet som ønsket ved at aktivere indstillingen Volume og justere de to ender af området. Trinstørrelser, der blev brugt i denne protokol til 2D-billeddannelse, var 150-200 nm. Den anbefalede trinstørrelse med hensyn til Nyquist-prøveudtagning, der kræves til dekonvolution af rå STED, kan beregnes med onlineværktøjer90.
        BEMÆRK: STED-udtømningslasereffekten og antallet af afbildede fly kan øge farvestoffotoblegning og lyseksponering for cellen til skadelige niveauer. Kontroller for tegn på fototoksicitet og fotoskader efter erhvervelse.

5. Behandlings- og analyseværktøjer til mitokondriel ultrastruktur

BEMÆRK: Billedbehandling (dvs. dekonvolution) er valgfri, men bruges typisk til fremstilling og analyse af STED-billeder til offentliggørelse. Dekonvolution for at forbedre kontrasten og reducere støj anbefales stærkt for optimal segmentering af individuelle cristae, som beskrevet nedenfor (figur 2).

  1. Dekonvolution af STED-billede
    BEMÆRK: Den software, der bruges til dekonvolution i denne protokol, findes i materialetabellen.
    1. Indstil billedets mikroskopiske parametre.
      BEMÆRK: Sørg for, at mikroskopmetadata er indtastet korrekt i billedets mikroskopiske parametre. Dette inkluderer monteringsmedium brydningsindeks; nedsænkningsmedium; pixelstørrelse; excitations-, emission- og udtømningsbølgelængder; og alle andre relevante oplysninger. Skabeloner med disse parametre kan gemmes til genbrug.
    2. Deconvolute rå STED-billeder med softwarealgoritmen.
      1. Adgang til automatiserede dekonvolutionsalgoritmer i dekonvolutionssoftware muliggør hands-off dekonvolution billedbehandling. Vælg knappen Express, og indstil dekonvolutionstypen til Hurtig, Standard, Aggressiv eller Konservativ for forskellige grader af dekonvolutionskraft. Repræsentative billeder, der bruger Express Deconvolution med aggressive indstillinger, vises (figur 3, figur 4 og figur 5).
      2. Gem billederne fra dekonvolutionssoftwaren i ICS2-format.
    3. Udfør følgende trin for manuel dekonvolution.
      1. Kort sagt, når du udfører manuel dekonvolution, skal du gemme dekonvolutionsguidens skabeloner for konsistens og have mulighed for at indlæse en skabelon, når guiden startes. Brug PSF-oplysninger (measured point spread function), hvis de genereres med anskaffelsesopsætning og parametre.
      2. Beskær rå STED-billede, hvis det er nødvendigt, før dekonvolutionssoftwaren automatisk stabiliserer billedet. Tilføjelser til dekonvolutionssoftwarepakker tillader specifik kompensation for mulige billedartefakter såsom termisk drift og kromatiske aberrationer.
      3. Generer derefter et logaritmisk histogram for manuelt eller automatisk at udføre baggrundssubtraktion. Vælg den klassiske CMLE-dekonvolutionsalgoritme (Maximum Likelihood Estimation).
        BEMÆRK: For dekonvolution er nøgleværdierne, der skal justeres, signal-støj-forholdstærsklen, antallet af iterationer og kvalitetstærsklen. Disse værdier kan justeres, og dekonvolutionen kan forhåndsvises for at bestemme optimale indstillinger.
  2. Segmentering og partikelanalyse
    BEMÆRK: Denne protokol bruger FIJI (Is Just ImageJ), en open source-software (se Tabel over materialer), til segmentering og analyse. Anden sammenlignelig software, herunder CellProfiler, Icy, Ilastik og QuPath, er tilgængelig til disse formål.
    1. Forbered billeder til segmentering.
      1. Åbn .obf raw STED-billeder eller .ics2-filer fra deconvolution-softwaren ved at gå til File → Åbn eller klik og træk filerne til værktøjslinjen ImageJ. Herfra kan enhver behandling, der gør billeder lettere at segmentere, udføres før segmentering.
      2. For at holde ændringerne ensartede skal du registrere funktioner ved hjælp af Plugins → Macros → Optag og kopier og indsæt nøglekommandoer i en ny makro fra Plugins → New → Macro. Sørg for at vælge det billede, der skal behandles, før du kører makroen.
        BEMÆRK: Almindeligt acceptable ændringer til kvantificering af størrelse og form inkluderer beskæring, projicering af en z-stak og baggrundssubtraktion med udjævning deaktiveret. Ændringer skal udføres konsekvent blandt billeder i et datasæt og rapporteres.
    2. Juster Weka-segmenteringsindstillinger, der kan trænes
      BEMÆRK: Yderligere detaljer med trinvise instruktioner til brug af det halvautomatiske segmenteringsværktøj og downstream-analyser for mitokondrier er offentliggjort91.
      1. Åbn de deconvolved STED-billeder i plugin'et Trainable Weka Segmentation (TWS)92 , der findes under Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. I segmenteringsindstillingerne skal du vælge Gaussisk sløring, membranprojektioner og Sobel-filterfunktioner . Standardværdien for membrantykkelse er 1, og standardværdien for membranplaster er 19.
      2. Mærk enten klasse 1 eller 2 som "Cristae" og den anden som "Baggrund" (figur 2). Modeller kan også gemmes med knappen Gem klassifikator . Vælg Indlæs klassifikator for at genbruge disse indstillinger til andre billeder.
    3. Udfør TWS-klassesporinger.
      1. Brug stregværktøjet eller andre figurer til at fremhæve noget af cristae eller baggrunden. I det mindste nogle baggrundsvalg bør omfatte mellemrum mellem cristae. Tegn en streg over strukturen, der skal tildeles en af klasserne, og vælg derefter knappen Føj til i højre side for enten cristae eller baggrund. Dobbeltklik på en sporing for at fjerne strukturen fra etiketten.
    4. Udfør TWS-klassificeringstræning.
      1. Vælg knappen Train classifier i venstre side for at generere et kort baseret på de oplysninger, der leveres til plugin'et. Overlejringen af segmenterede klasser kan slås til og fra med knappen Skift overlay , og overlejringens opacitet kan justeres i Indstillinger. Klassifikatoren kan omskoles med yderligere etiketter. Når du er tilfreds, skal du vælge knappen Få sandsynlighed .
    5. Mål partiklerne.
      1. Brug cristae-sandsynlighedskortet til at spærre billedet for at generere en maske og derefter gå til Analysér → Analysér partikler. Generelt kan standardtærskeltypen bruges, og intervallet justeres for at sikre, at der tages højde for hele cristae. Målingerne ved analyse af partikler kan justeres ved hjælp af Analyser → Indstil målinger.
        BEMÆRK: Eksempler på størrelses- og formparametre såsom areal, omkreds, cirkularitet og størrelsesforhold for cristae måles og vises baseret på de valgte målinger (figur 2, figur 5A, supplerende tabel 1).
      2. VALGFRIT: Vælg det rå STED-billede med de samme dimensioner som det dekonvolverede billede, anvend investeringsafkastene fra manageren, og vælg derefter Mål i ROI-manageren for at få intensitetsværdier.
    6. Hent linjediagrammer.
      1. Linjediagrammer blev genereret fra de deconvolved STED-billeder. Tegn en flerpunktslinje, juster linjetykkelsen til flere pixels bred for at udjævne støj, og spline linjen, så den passer til mitokondrierne (figur 2, figur 5B). Det resulterende genererede linjeplot bruges til at måle afstande fra top til top for at rapportere periodiciteten og fordelingen af cristae over et bestemt interval.
        BEMÆRK: Relateret, cristae densitet kan rapporteres som antallet af uafhængige cristae inden for et givet område som bestemt ved at måle den ydre del af mitokondrierne. Mitokondrieområdet kan bestemmes ved at anvende et filter på det deconvolved eller rå STED-billede for at generere en maske. Sørg for, at masken passer nøjagtigt til mitokondriernes omrids, før du måler området.

Representative Results

Denne protokol beskriver cellevækstbetingelser for dyrkede og primære celler med fokus på levende celle STED-billeddannelse og efterfølgende analyser af mitokondriecristae. Fremskrivninger lavet med ImageJ af mitokondrier fra udifferentierede SH-SY5Y (figur 3A) og RA-differentierede SH-SY5Y (figur 3B) celler kan indsamles som z-stakke med traditionelle konfokale og STED, og de rå STED-billeder kan derefter deconvolvedes. Timelapse-billeddannelse kan også udføres og efterfølgende deconvolved (figur 3C, D). Ved hjælp af lidt forskellige billeddannelsesparametre for primære hippocampale neuroner hos rotter (tabel 1) kan konfokale og rå STED-billeder erhverves som z-stakke, og de rå STED-billeder kan deconvolved (figur 4A). Timelapse-billeddannelse af mitokondrier fra primære neuroner er også mulig (figur 4B). Generelt skal time-lapse-billederne kunne vise mitokondriedynamiske hændelser.

Når rå STED og deconvolved STED z-stack fremskrivninger fra de prøver, der anvendes til segmentering, synes konsistente, udføres kvantitative målinger. TWS-pluginet bruger det dekonvolverede STED-billede til at segmentere for at lave en sandsynlighedsmaske, som derefter bruges til at oprette en binær maske af cristae for at opnå størrelses- og formparametre (figur 5A). Regionerne fra denne maske gemmes i ROI-styringen og kan anvendes på det rå STED-billede, hvis det ønskes for at måle forskelle i relativ intensitet. De deconvolved STED-fremskrivninger kan også bruges til at bestemme cristae-periodiciteten og densiteten i et givet område (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: Mitokondriel morfologi. Mitokondrier har et to-membran system, der definerer forskellige underrum (A). Cristae er indfoldninger af den indre membran med definerede funktioner (B). Forkortelser: OMM, ydre mitokondriemembran; ICS, intracristal rum; IMS, intermembran rum; CM, cristae membran; IBM, indre grænsemembran; IMM, indre mitokondriemembran; CT, cristae spids; CJ, cristae kryds. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk arbejdsgang. SH-SY5Y-celler eller primære rottehippocampale neuroner dyrkes på et PDL-belagt dækglas. SH-SY5Y-celler dyrkes parallelt for at forblive udifferentierede eller udsættes for RA-differentiering i løbet af seks dage. Primære hippocampale neuroner hos rotter blev dyrket på et PDL-belagt dækglas efter at have været isoleret fra hippocampale sektioner i syv dage. Når de var klar til at blive afbildet, blev cellerne farvet med PKMO og afbildet med STED. Rå STED-billeder dekonvoleres derefter, og de dekonvolverede billeder behandles i FIJI for at opnå størrelses- og formmålinger, såsom cristae-tæthed, areal, omkreds, cirkularitet og billedformat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeddannelse af mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED billede z-stack fremskrivninger (højre) af mitokondrier fra ikke-differentierede (A) og RA-differentierede (B) SH-SY5Y-celler med PKMO-farvning vises. En timelapse med 30 s intervaller og 5 iterationer af RA-differentierede SH-SY5Y-celler vises (C) med udvalgte regioner (hvide bokse) udvidet på (D) ved hjælp af skalerede billeder af disse regioner uden interpolation. Skalastænger: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Billeddannelse af mitokondrier i primære hippocampale neuroner hos rotter. Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED (højre) billede z-stack fremskrivninger af mitokondrier fra primære rottehippocampale neuroner er vist (A). En timelapse med 25 s intervaller og 5 iterationer af mitokondrier i disse neuroner er vist (B). Skalastænger: A, 250 nm; B, 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Behandling af deconvolved STED-billeder i ImageJ. Repræsentativ brug af Trainable Weka Segmentation-pluginet til måling af cristae-størrelse og -form vises (A). Fra venstre mod højre vises følgende billeder: det deconvolved STED-billede, sandsynlighedskortet baseret på segmentering fra TWS-pluginet, masken fra tærskelværdi i FIJI ved hjælp af sandsynlighedskortet som input, masken med ROI'erne skitseret og ROI'erne overlejret på det originale deconvolved STED-billede. De resulterende målinger af areal, perimeter, cirkularitet og størrelsesforhold, der svarer til disse objekter, findes i supplerende tabel 1. Et linjeplot, der bruger det dekonvolverede STED-billede til at måle afstande fra top til top som aflæsning for cristae-tæthed, vises (B). Skalabjælker: 0,5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Pixelstørrelse (nm) Opholdstid (μs) Linje iflg. 561 nm excitation under STED-erhvervelse (%) 775 nm STED-udtømningseffekt (%) Trinstørrelse (nm) Pinhole (AU) Timelapse-interval(mer) Timelapse-iterationer
Ikke-differentieret SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5
RA-Differe-ntiated SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5
Primære neuroner 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5
BEMÆRK: Pixelstørrelsen kan variere afhængigt af billedkravene og hensigten om at dekonvolere billeder. Korrekt prøveudtagning er nødvendig for dekonvolution. Pixelstørrelser til rå STED-billeder uden dekonvolution kan gå op til 30 nm.

Tabel 1: Oversigt over STED-anskaffelsesparametre. De indstillinger, der bruges til 2D STED-billeddannelse for hver celletype, udifferentieret SH-SY5Y, RA-differentieret SH-SY5Y og primære hippocampale neuroner hos rotter, vises. For alle time-lapses blev der taget 5 iterationer med varierende intervaller baseret på ROI-størrelse.

Supplerende figur 1: Billeddannelse af SH-SY5Y-celler med tilsætning af amyloid-β (Aβ). Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og dekonvolverede STED (højre) billeder af RA-differentierede SH-SY5Y-celler med PKMO-plet (øverst) og Aβ-HiLyte647 (nederst) vises (A). Flettede z-stack-projektioner af rå PKMO STED (grøn) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller deconvolved PKMO STED (grøn) med deconvolved Aβ STED (magenta) (C) vises. Skalabjælker: 0,5 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Størrelses- og formmålinger af segmenteret cristae. Størrelses- og formmålingerne af areal (μm2), omkreds (μm), cirkularitet og billedformat, svarende til objekterne skitseret i figur 5A fra segmenterede mitokondrier, vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Sammenfatning af anskaffelsesparametre med amyloid-β-prøver. De indstillinger, der bruges til 2D STED-billeddannelse af PKMO og Aβ-HiLyte647 i udifferentierede og RA-differentierede SH-SY5Y-celler, vises. Konfokal af Aβ-HiLyte647 kan anvendes alene, da der ikke er nogen specifik struktur at løse; STED-billeder af Aβ-HiLyte647 vises her for mindre partikelstørrelser. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Amyloid-β behandlingsprotokol. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol præsenterer brugen af human neuroblastomcellelinje SH-SY5Y og primære hippocampale neuroner hos rotter med det nye IMM-målrettede PKMO-farvestof til levende celle STED-billeddannelse. På grund af nyheden i PKMO er der i øjeblikket lidt offentliggjort ved hjælp af dette farvestof til levende STED-billeddannelse. Brug af disse celletyper til STED-billeddannelse udgør udfordringer, specifikt fordi neuronale celler har smallere mitokondrier. En begrænsning af denne protokol er det anvendte PKMO-farvestof, da det kan være giftigt for celler. Forskellige celler og cellelinjer reagerer forskelligt på farvestoffet, således kan justeringer af farvestofkoncentration og inkubationstid for at optimere resultaterne for stærkt signal uden at skade celler være påkrævet. En foreslået løsning er at sænke koncentrationen og øge farvningstiden63; Dette kan dog resultere i dårligere farvning uden at øge cellelevedygtigheden.

På samme måde som PKMO udviser det kommercielle farvestof Live Orange mito (Table of Materials) også en vis celletoksicitet. Dette farvestof blev brugt til en række dyrkede celler, men var ikke i stand til at udvise sammenlignelig farvning i RA-differentierede SH-SY5Y-celler med succes med de samme parametre som deres udifferentierede modstykker (vores upublicerede observationer). Imidlertid kan modtagelige farvningsprotokoller optimeres til denne sonde og valgte celletyper. Med dette farvestof blev detektorgatingtider på 1-1,05 til 7-7,05 ns anvendt, mens alle andre parametre i tabel 1 forblev de samme. Generelt gav farvning af celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 minutter sammenlignelige resultater som PKMO-resultaterne viste. Farvning med højere koncentration i kortere tid eller farvning med lavere koncentration i samme tid eller lidt længere kan give forskellige resultater og kan være gunstig for andre celletyper eller vækstbetingelser.

Billeddannelse af primære rottehippocampale neuroner adskiller sig fra udødeliggjorte celler på grund af arten af axon- og dendritfremspringene samt mitokondriefordeling på billeddannelsestidspunktet. En vanskelighed i denne del af protokollen er, at såtætheden bestemmer, om de primære kulturer vil være i stand til at klæbe og vokse sundt, og ved højere tætheder har fremskrivningerne tendens til at vokse over DIV 10. Derfor vil mitokondrierne, der er afbildet fra disse primære neuroner, sandsynligvis komme fra cellekroppen og ikke fremskrivningerne; Imidlertid giver vellykket vækst fra en lavere startcelletæthed bedre billeddannelsesresultater ved senere væksttider. Nøglen er at sikre lav baggrund og ude af fokus lys for at få den bedste kontrast til STED. For at imødegå bekymringer vedrørende cellepopulationen forhindrer dyrkning af primære hippocampale celler i B27-suppleret neuronvækstmedier væksten af gliaceller, og kilden rapporterer, at <5% af cellerne er astrocytter, og fraværet af NbActiv1-supplement i vækstmedierne reducerer antallet af astrocytter i kulturer til <2%87. For både dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampale neuroner hos rotter bidrager PDL-belægningen, der anvendes til vækst, til baggrundståge i billeder. Der opnås tilstrækkelig signal-støj-støj med de indstillinger, der er rapporteret i (tabel 1), og dekonvolution fjerner det meste af den observerede baggrund.

Ud over den billeddannelse, der er dækket her, er det også muligt at tilføje behandlinger eller stress til celler før eller under billeddannelse. For eksempel inducerer tilsætning af tert-butylhydrogenperoxid (tBHP) oxidativ stress, og det er muligt at overvåge ændringer i mitokondrier over tid efter tilsætning. Tilsætningen af amyloid-β (Aβ) med et fluorescerende mærke muliggør overvågning af fordelingen af dette peptid i forhold til mitokondrier såvel som mitokondriestrukturen over tid. Mitokondriel sundhed har været stærkt impliceret i AD og er bredt støttet til at spille en rolle i Aβ toksicitet 43,71,72. Især påvirker differentieringsstatus for SH-SY5Y-celler Aβ-proteinforløber (AβPP) lokalisering85, og eksperimenter med AβPP bør konstrueres omhyggeligt.

Som et eksempel på, hvordan denne protokol kan tilpasses, er det vist, at den fluorescerende variant Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan tilsættes PKMO-farvede celler 15 min før billeddannelse (supplerende figur 1). Billeddannelsesparametrene er ens (supplerende tabel 2), hvor den væsentligste forskel er, at der er behov for et mindre pinhole ved billeddannelse af smallere mitokondrier. Billeddannelse af Aβ-HiLyte647 med STED kræver mindre samlet excitation (6% -8%) og STED-udtømning (10% -12%) lasereffekt og færre akkumuleringer (seks). Detektor gating forlænges også fra 0,1 til 10 ns. Selvom STED-opløsning af Aβ ikke er nødvendig, var det samlede signal-støj-forhold og Aβ-partikelstørrelsen af rå STED bedre end de konfokale billeder, og efterfølgende dekonvolution kan også udføres. Indsamling af STED-billeder og deconvolving af rå STED z-stack-projektioner af Aβ synes især nyttigt, når man fusionerer med rå STED- eller deconvolved STED-billeder af PKMO-pletten (supplerende figur 1B, C). Begge kanaler blev samlet i et enkelt rammetrin. Målinger af tidsafhængig lokalisering, svarende til dem, der er anført i figur 2 og vist i figur 5, hvor det er relevant, og cristae-arkitekturforskelle kan opnås efter stressbehandling eller andre tilføjelser.

Andre mulige metoder til dobbeltmærkning i levende celle STED af mitokondrier, der ikke er rapporteret her, men er blevet rapporteret af andre, omfatter brugen af SNAP-mærkede proteiner93, Halo-mærkede proteiner og brugen af andre cellegennemtrængelige farvestoffer med generiske mål, såsom mtDNA63. Især påvirker mærkningsstrategien for SNAP- og Halo-mærkning den resulterende fluorescenssignalintensitet og levetid ved billeddannelse94. Derudover, mens denne protokol præsenterer flere eksempler på analyser, der kan anvendes på segmenterede mitokondrier, er der mange andre analyser, som softwarepakker kan udføre på disse billeder.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Primære hippocampale neuroner hos rotter blev leveret af Dr. George Lykotrafitis og Shiju Gu fra Biomedical Engineering Department ved University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet, der ligger i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment, blev erhvervet med NIH-bevilling S10OD023618 tildelt Christopher O'Connell. Denne forskning blev finansieret af NIH-bevilling R01AG065879 tildelt Nathan N. Alder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in -- -- Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) -- The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus -- This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior -- Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior -- STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Tags

Levende celle STED-billeddannelse Mitokondriel indre membran Ultrastruktur Neuronale cellemodeller Mitokondrier Energiproduktion Ca2+ Homeostase Lipidbiosyntese Reaktive iltarter (ROS) Neuroner Aerob metabolisme Ca2+ signalering Axonvækst og regenerering ROS-produktion Neurodegenerative sygdomme Mitokondriel dysfunktion Indre membranstruktur Cristae Molekylære systemer Diffraktionsbegrænset opløst mikroskopi Elektronmikroskopi Superopløsningsfluorescensmikroskopi
Brug af Live Cell STED-billeddannelse til at visualisere mitokondriel indre membran ultrastruktur i neuronale cellemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, E. L., Reed, A. L.,… More

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter