Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65561
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

Summary

Dit protocol presenteert een workflow voor de voortplanting, differentiatie en kleuring van gekweekte SH-SY5Y-cellen en primaire hippocampusneuronen van ratten voor visualisatie en analyse van de mitochondriale ultrastructuur met behulp van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie.

Abstract

Mitochondriën spelen veel essentiële rollen in de cel, waaronder energieproductie, regulatie van Ca2+ homeostase, lipidenbiosynthese en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Deze mitochondriën-gemedieerde processen nemen gespecialiseerde rollen op zich in neuronen, coördineren het aërobe metabolisme om aan de hoge energiebehoefte van deze cellen te voldoen, moduleren Ca2+ -signalering, leveren lipiden voor axongroei en -regeneratie en stemmen de ROS-productie af voor neuronale ontwikkeling en functie. Mitochondriale disfunctie is daarom een centrale oorzaak bij neurodegeneratieve ziekten. Mitochondriale structuur en functie zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden. Het morfologisch complexe binnenmembraan met structurele invouwen, cristae genaamd, herbergt veel moleculaire systemen die de kenmerkende processen van het mitochondrion uitvoeren. De architecturale kenmerken van het binnenmembraan zijn ultrastructureel en daarom te klein om te worden gevisualiseerd door traditionele diffractiebeperkte opgeloste microscopie. De meeste inzichten over de mitochondriale ultrastructuur zijn dus afkomstig van elektronenmicroscopie op vaste monsters. Opkomende technologieën op het gebied van superresolutiefluorescentiemicroscopie bieden nu echter een resolutie tot tientallen nanometers, waardoor ultrastructurele kenmerken in levende cellen kunnen worden gevisualiseerd. Beeldvorming met superresolutie biedt daarom een ongekend vermogen om fijne details van de mitochondriale structuur, eiwitverdelingen op nanoschaal en cristae-dynamiek direct in beeld te brengen, wat fundamentele nieuwe inzichten oplevert die mitochondriën koppelen aan menselijke gezondheid en ziekte. Dit protocol presenteert het gebruik van gestimuleerde emissiedepletie (STED) superresolutiemicroscopie om de mitochondriale ultrastructuur van levende menselijke neuroblastoomcellen en primaire rattenneuronen te visualiseren. Deze procedure is georganiseerd in vijf secties: (1) groei en differentiatie van de SH-SY5Y-cellijn, (2) isolatie, plating en groei van primaire hippocampusneuronen van ratten, (3) procedures voor het kleuren van cellen voor levende STED-beeldvorming, (4) procedures voor levende cel-STED-experimenten met behulp van een STED-microscoop ter referentie, en (5) richtlijnen voor segmentatie en beeldverwerking met behulp van voorbeelden om morfologische kenmerken van het binnenmembraan te meten en te kwantificeren.

Introduction

Mitochondriën zijn eukaryote organellen van endosymbiotische oorsprong die verantwoordelijk zijn voor het reguleren van verschillende belangrijke cellulaire processen, waaronder intermediair metabolisme en ATP-productie, ionenhomeostase, lipidenbiosynthese en geprogrammeerde celdood (apoptose). Deze organellen zijn topologisch complex en bevatten een dubbel membraansysteem dat meerderesubcompartimenten 1 vormt (Figuur 1A). Het buitenste mitochondriale membraan (OMM) staat in verbinding met het cytosol en brengt directe interorganelcontacten tot stand 2,3. Het binnenste mitochondriale membraan (IMM) is een energiebesparend membraan dat iongradiënten in stand houdt die voornamelijk zijn opgeslagen als een elektrisch membraanpotentiaal (ΔΨm) om ATP-synthese en andere energie-intensieve processen aan te drijven 4,5. De IMM is verder onderverdeeld in het binnenste grensmembraan (IBM), dat dicht bij de OMM is gedrukt, en uitstekende structuren, cristae genaamd, die worden gebonden door het cristae-membraan (CM). Dit membraan bakent het binnenste matrixcompartiment af van de intrakristallische ruimte (ICS) en de intermembraanruimte (IMS).

Mitochondriën hebben een dynamische morfologie die gebaseerd is op continue en evenwichtige processen van splijting en fusie die worden bestuurd door mechano-enzymen van de dynamine-superfamilie6. Fusie zorgt voor een verhoogde connectiviteit en vorming van reticulaire netwerken, terwijl splijting leidt tot mitochondriale fragmentatie en de verwijdering van beschadigde mitochondriën door mitofagie mogelijk maakt7. De mitochondriale morfologie varieert per weefseltype8 en ontwikkelingsstadium9 en wordt gereguleerd om cellen in staat te stellen zich aan te passen aan factoren zoals energetische behoeften 10,11 en stressoren12. Standaard morfometrische kenmerken van mitochondriën, zoals de mate van netwerkvorming (onderling verbonden versus gefragmenteerd), omtrek, oppervlakte, volume, lengte (beeldverhouding), rondheid en mate van vertakking, kunnen worden gemeten en gekwantificeerd met standaard optische microscopie omdat de afmetingen van deze kenmerken groter zijn dan de diffractielimiet van licht (~200 nm)13.

Cristae-architectuur definieert de interne structuur van mitochondriën (Figuur 1B). De diversiteit van cristae morfologieën kan grofweg worden gecategoriseerd als plat (lamellair of schijfvormig) of buisvormig-vesiculair14. Alle cristae hechten zich aan de IBM door middel van buisvormige of slotachtige structuren die cristae junctions (CJ's) worden genoemd en die kunnen dienen om het IMS van het ICS en het IBM van de CM15 te compartimenteren. De morfologie van Cristae wordt gereguleerd door belangrijke eiwitcomplexen van de IMM, waaronder (1) de mitochondriale contactplaats en het cristae organizing system (MICOS) dat zich in CJ's bevindt en IMM-OMM-contacten stabiliseert 16, (2) de optische atrofie 1 (OPA1) GTPase die de remodellering van cristae reguleert17,18,19, en (3) F1FO ATP-synthase dat stabiliserende oligomere assemblages vormt aan cristae-uiteinden (CT's)20, 21. okt. Bovendien is de IMM verrijkt met niet-dubbellaagse fosfolipiden fosfatidylethanolamine en cardiolipine die het sterk gekromde IMM22 stabiliseren. Cristae zijn ook dynamisch en vertonen morfologische veranderingen onder verschillende omstandigheden, zoals verschillende metabole toestanden 23,24, met verschillende respiratoire substraten 25, onder uithongering en oxidatieve stress 26,27, met apoptose 28,29 en met veroudering 30. Onlangs is aangetoond dat cristae grote verbouwingen kunnen ondergaan op een tijdschaal van seconden, wat hundynamische aard onderstreept. Verschillende kenmerken van cristae kunnen worden gekwantificeerd, waaronder afmetingen van structuren binnen individuele cristae (bijv. CJ-breedte, crista-lengte en -breedte) en parameters die individuele crista relateren aan andere structuren (bijv. intra-cristae-afstand en cristae-invalshoek ten opzichte van de OMM)32. Deze kwantificeerbare cristae-parameters vertonen een directe correlatie met de functie. De mate van mitochondriale ATP-productie is bijvoorbeeld positief gerelateerd aan de overvloed aan cristae, gekwantificeerd als cristae-dichtheid of cristae-nummer genormaliseerd naar een ander kenmerk (bijv. cristae per OMM-gebied)33,34,35. Omdat IMM-morfologie wordt gedefinieerd door kenmerken op nanoschaal, omvat het mitochondriale ultrastructuur, waarvoor beeldvormingstechnieken nodig zijn die een resolutie bieden die groter is dan de lichtdiffractielimiet. Zoals hieronder beschreven, omvatten dergelijke technieken elektronenmicroscopie en superresolutiemicroscopie (nanoscopie).

De neurale en gliacellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn bijzonder afhankelijk van de mitochondriale functie. Gemiddeld vormen de hersenen slechts 2% van het totale lichaamsgewicht, maar gebruiken ze 25% van de totale lichaamsglucose en zijn ze verantwoordelijk voor 20% van het zuurstofverbruik van het lichaam, waardoor ze kwetsbaar zijn voor stoornissen in het energiemetabolisme36. Progressieve neurodegeneratieve ziekten (ND's), waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Huntington (HD), multiple sclerose (MS) en de ziekte van Parkinson (PD), zijn enkele van de meest uitgebreid bestudeerde pathologieën tot nu toe, met onderzoeksinspanningen variërend van het begrijpen van de moleculaire onderbouwing van deze ziekten tot het zoeken naar mogelijke therapeutische preventie en interventies. ND's worden in verband gebracht met verhoogde oxidatieve stress die gedeeltelijk afkomstig is van reactieve zuurstofsoorten (ROS) die worden gegenereerd door de mitochondriale elektronentransportketen (ETC)37, evenals een veranderde mitochondriale calciumverwerking 38 en mitochondriaal lipidenmetabolisme39. Deze fysiologische veranderingen gaan gepaard met opgemerkte defecten in de mitochondriale morfologie die geassocieerd zijn met AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 en PD51,52,53. Deze structurele en functionele defecten kunnen worden gekoppeld door complexe oorzaak-gevolgrelaties. Aangezien de morfologie van cristae bijvoorbeeld OXPHOS-enzymen54 stabiliseert, worden mitochondriale ROS niet alleen gegenereerd door de ETC, maar beschadigen ze ook de infrastructuur waarin de ETC zich bevindt, waardoor een feed-forward ROS-cyclus wordt bevorderd die de gevoeligheid voor oxidatieve schade vergroot. Bovendien is aangetoond dat de desorganisatie van cristae processen in gang zet zoals het vrijkomen van mitochondriaal DNA (mtDNA) en ontstekingsroutes die verband houden met auto-immuun-, metabole en leeftijdsgebonden aandoeningen. Daarom is analyse van de mitochondriale structuur de sleutel tot een volledig begrip van ND's en hun moleculaire onderbouwing.

Populaire methoden voor het bekijken van cristae, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie, elektronentomografie en cryo-elektronentomografie (cryo-ET), en röntgentomografie, in het bijzonder cryo-zachte röntgentomografie, hebben belangrijke bevindingen opgeleverd en werken met een verscheidenheid aan soorten monsters 56,57,58,59,60 . Ondanks recente vooruitgang in de richting van een betere observatie van de organellaire ultrastructuur, hebben deze methoden nog steeds het voorbehoud dat monsterfixatie vereist is en daarom de real-time dynamiek van cristae niet rechtstreeks kan vastleggen. Fluorescentiemicroscopie met superresolutie, met name in de vorm van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), expansiemicroscopie (ExM) en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie, zijn populaire manieren geworden om structuren te bekijken die een resolutie vereisen onder de diffractielimiet die klassieke methoden van optische microscopie beperkt. Wanneer ExM wordt gebruikt in combinatie met een andere superresolutietechniek, zijn de resultaten indrukwekkend, maar het monster moet worden gefixeerd en gekleurd in een gel61. Ter vergelijking: SIM, PALM/STORM en STED zijn allemaal met succes gebruikt met levende monsters, en nieuwe en veelbelovende kleurstoffen die over het algemeen de IMM kleuren, bieden een nieuwe en gemakkelijke benadering voor live beeldvorming van mitochondriën cristae dynamica 62,63,64,65,66. Recente ontwikkelingen op het gebied van levende kleurstoffen voor STED-beeldvorming hebben de helderheid en fotostabiliteit van de kleurstof verbeterd, en deze kleurstoffen richten zich op de IMM met een hogere mate van specificiteit dan hun voorgangers. Deze ontwikkelingen maken het mogelijk om langetermijn timelapse- en z-stack-experimenten te verzamelen met beeldvorming met superresolutie, wat de deur opent naar een betere analyse van levende cellen van de mitochondriale ultrastructuur en dynamiek.

Hierin worden protocollen gegeven voor beeldvorming van levende cellen van ongedifferentieerde en gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen die zijn gekleurd met de PKmito Orange (PKMO)-kleurstof met behulp van STED63. De SH-SY5Y-cellijn is een driemaal gesubkloneerd derivaat van de ouderlijke cellijn, SK-N-SH, gegenereerd uit een beenmergbiopsie van gemetastaseerd neuroblastoom67,68,69,70. Deze cellijn is een veelgebruikt in vitro model in ND-onderzoek, met name bij ziekten zoals AD, HD en PD, waarbij mitochondriale disfunctie sterk betrokken is 10,43,71,72,73. Het vermogen om SH-SY5Y-cellen te differentiëren in cellen met een neuronachtig fenotype door kweekmedia te manipuleren, is een geschikt model gebleken voor neurowetenschappelijk onderzoek zonder afhankelijk te zijn van primaire neuronale cellen 10,74. In dit protocol werd retinoïnezuur (RA) toegevoegd aan het celkweekmedium om de differentiatie van SH-SY5Y-cellen te induceren. RA is een vitamine A-derivaat en het is aangetoond dat het de celcyclus reguleert en de expressie bevordert van transcriptiefactoren die neuronale differentiatie reguleren75. Er is ook een protocol voor het kweken en live cell imaging van neuronen geïsoleerd uit de hippocampus van ratten. Het is aangetoond dat de hippocampus wordt aangetast door mitochondriale degeneratie en speelt, samen met de cortex, een belangrijke rol bij veroudering en ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. Vermeerdering en differentiatie van SH-SY5Y-cellen

  1. Voorbereiding van media voor celgroei en -onderhoud
    1. Bereid compleet, glucoserijk Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L D-glucose, 4 mM L-glutamine, 110 mg/L natriumpyruvaat) aangevuld met een laatste 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum (10.000 eenheden/ml penicilline, 10.000 μg/ml streptomycine en 25 μg/ml amfotericine B), en variërende hoeveelheden foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel). FBS-hoeveelheden in differentiatiemedia variëren tussen de uiteindelijke 10%, 5% of 2% (v/v) FBS.
  2. Onderhoud van de cel
    1. Houd de cellen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS en plaats ze op 37 °C en 5% CO2 en zaai ze vervolgens in DMEM met 5% (v/v) FBS voor differentiatie. Ingevroren celvoorraden werden opgeslagen in FBS met 10% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) bij 1-2 x 107 cellen/ml.
  3. Bereiding van retinoïnezuur (RA)
    1. Los 7,51 mg all-trans-RA (zie Materiaaltabel) op in 5 ml vers bereide 95% ethanol om 5 mM stockoplossing te verkrijgen. Controleer de concentratie met extinctie bij 350 nm (ɛ = 44,300 M-1 cm-1), verkregen uit het productinformatieblad van protocol81 van de fabrikant, met behulp van een verdunning van de stockoplossing bij 5 μM in ethanol. Bewaar 5 mM voorraad beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 6 weken.
  4. Bereiding van poly-D-lysine voor dekglaasje coating
    OPMERKING: Het productprotocol poly-D-lysine (PDL), dat te vinden is in de sectie Documenten en downloads van leverancierssite82, biedt informatie voor het coaten van een verscheidenheid aan kweekvaten.
    1. Dit protocol omvat volumes op basis van een 2-wells kamervat met een oppervlakte van 4cm2 per well, met steriele #1.5 borosilicaat-dekglasbodems (zie Materiaaltabel). Verdun de stockoplossing van PDL tweevoudig tot 50 μg/ml met Dulbecco's PBS (DPBS; geen calcium, geen magnesium).
      OPMERKING: #1.5 of #1.5H dekglas zijn beide acceptabele diktes, die essentieel zijn voor de beeldkwaliteit. Andere diktes veroorzaken sferische aberratie en moeten worden vermeden.
  5. Dekglaasje coating met PDL
    NOTITIE: Dekglaasjes kunnen gedurende 10-15 minuten worden blootgesteld aan ultraviolet (UV) licht in een bioveiligheidskast voor verdere sterilisatie.
    1. Breng 1,2 ml 50 μg/ml PDL-oplossing aan op elk putje met steriele dekglaasjes in een celkweekkast en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de PDL-oplossing en spoel driemaal met 3,6 ml gedestilleerd water. Laat de gecoate kamer na de laatste wasbeurt 2 uur drogen en stel hem bloot aan lucht voordat hij hem afspoelt en onmiddellijk gebruikt of maximaal 2 weken in een luchtdichte verpakking bij 4 °C bewaart.
      NOTITIE: Spoel de dekglaasjes grondig uit, aangezien een teveel aan PDL giftig kan zijn voor cellen.
  6. Differentiatie van SH-SY5Y cellen met RA
    NOTITIE: Gebruik geen cellen boven doorgang 15. Cellen worden gepasseerd bij 80%-90% confluentie. Differentiatieprocedures verschillen, maar volgen vergelijkbare stappen. Aanvullende differentiatie van neuroblastomen naar volwassen neuronen wordt verkregen met verdere behandeling met brain-derived neurotrophic factor (BDNF)68,83,84,85, maar werd niet uitgevoerd in dit protocol.
    OPTIONEEL: Cellen gedurende ten minste 24 uur vóór het zaaien op dekglas aanbrengen. Om cellen uit bevroren voorraden te bereiden, ontdooit u snel 1 ml bevroren injectieflacon met cellen en voegt u deze toe aan 9 ml voorverwarmde media aangevuld met 10% FBS, centrifugeert u gedurende 10 minuten (bij kamertemperatuur) op 350 x g en gooit u het supernatans weg om DMSO te verwijderen. Resuspendeer de celpellet in 5 ml voorverwarmde media en zaadcellen in een T-25-kolf. Zodra cellen 80%-90% confluentie hebben bereikt, passeer je cellen door ze te tellen en te zaaien voor differentiatie indien van toepassing.
    1. Dag 0: Zaadcellen.
      1. Zaai de cellen op een dekglas met kamers van bevroren bouillon of een werkkolf. Gebruik een zaaidichtheid van 1,5 x 104 cellen/cm2.
        OPMERKING: Voor een enkel putje in een standaard dekglas met 2 putjes en een kweekoppervlak van 4cm2 zijn 6,0 x 104 cellen nodig. Cellen die ongedifferentieerd blijven, moeten worden gezaaid met DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS, en cellen die worden gedifferentieerd, moeten worden gezaaid met DMEM aangevuld met 5% (v/v) FBS.
    2. Dag 1: Start RA-differentiatiebehandeling.
      1. Bereid DMEM aangevuld met 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum en een eindconcentratie van 10 μM RA of ethanol van hetzelfde additiefvolume om te dienen als mediumcontrole voor deze differentiatieprocedure. Verwijder de media in het kamerglas dat wordt gebruikt voor het zaaien, spoel af met 1x PBS en voeg de nieuwe DMEM toe aan de putjes.
    3. Dag 3: Vervang media door nieuwe RA- of ethanolhoudende media.
      1. Verwijder media vanaf dag 1 en vervang ze door nieuwe media aangevuld met 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum en 10 μM RA of 95% ethanol met hetzelfde additiefvolume om te dienen als voertuigcontrole voor deze differentiatieprocedure. Verwijder de media in het kamerglas dat wordt gebruikt voor het zaaien, spoel af met 1x PBS en voeg nieuwe media toe aan de putjes.
    4. Dag 6: Voer de beeldvorming van de cellen uit.
      OPMERKING: Celdifferentiatietijden variëren per protocol, maar zes dagen blootstelling aan RA is voldoende om een neuronachtig fenotype in SH-SY5Y-cellen te induceren86.
      1. Voer live beeldvorming uit, met details in secties 3 en 4 (Figuur 2).

2. Primaire hippocampusneuronencultuur van ratten

  1. Materiaalvoorbereiding voor de isolatie van hippocampusneuronen van ratten.
    1. Bereid vers aangevuld DMEM.
      1. Filter een mengsel van DMEM (hoge glucose, geen natriumpyruvaat) aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerde FBS, 1% (v/v) natriumpyruvaatoplossing en 1% (v/v) penicilline-streptomycine (10.000 E/ml). Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.
    2. Bereid verse gesupplementeerde neurongroeimedia voor.
      1. Filter en steriliseer een mengsel van neurongroeimedia aangevuld met 2% (v/v) B27-supplement, 0,25% (v/v) glutaminesupplement en 1% (v/v) penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel). Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid de primaire hippocampusneuronencultuur voor.
    1. Bereid de primaire hippocampusneuronencultuur voor volgens eerder gepubliceerd werk87 en van het productprotocol op de site van de fabrikant waaruit de ontlede E18-hippocampus van de rat wordt verkregen88 (zie Tabel met materialen). Dit protocol resulteert in een voornamelijk neuronale populatie met <2% astrocyten.
      OPMERKING: De slaapmedia waarmee dit weefsel wordt verzonden, zullen worden gebruikt voor toekomstige stappen in dit protocol. Gooi het niet weg.
    2. Bereid materialen en media voor op weefseldissociatie.
      1. Vlam een pasteurpipet om de diameter van de opening te verkleinen en bewaar deze tot gebruik in folie om besmetting te voorkomen. Verwarm de bereide DMEM, 1X Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) en neurongroeimedia voor op 37 °C. Voeg 2 vlokken DNAase met een steriel pincet toe aan een conische buis van 15 ml.
    3. Voer weefseldissociatie uit.
      1. Verwijder zoveel mogelijk van de overwinteringsmedia waarin de ontlede E18-hippocampus van de rat is opgeslagen voordat het weefsel in de conische buis van 15 ml met DNAase wordt geplaatst en kort bij 37 °C wordt geïncubeerd. Voeg 900 μL 1X HBSS toe, gevolgd door 100 μL 0,5% trypsine. Incubeer het weefsel bij 37 °C gedurende 15 min.
        NOTITIE: PDL-gecoate platen kunnen uit de opslag worden gehaald en in een incubator worden geplaatst tot gebruik tijdens deze incubatietijd.
    4. Voer weefselhomogenisatie en celtelling uit.
      1. Verwijder na incubatie met trypsine de media en voeg 1 ml voorverwarmde overwinteringsmedia-DNAase van de vorige stap toe aan het weefsel en homogeniseer met de pasteurpipet. De media zullen er ondoorzichtig uitzien en dan geleidelijk verdwijnen naarmate de homogenisering voortduurt.
      2. Voeg gedissocieerde neuronen toe aan een nieuwe buis met 4 ml voorverwarmde DMEM en tel vervolgens de cellen met behulp van een celteller.
    5. Voer celplating en groei van primaire cellen uit.
      1. Plaatcellen met een dichtheid van ongeveer 1,65 x 104 cellen/cm2 in DMEM. Voor een dekglas met 2 putjes (4cm2) zaait u 65.000 – 70.000 cellen per putje met 2 ml DMEM. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO 2 gedurende2 uur voordat u de therapietrouw controleert. Zodra de cellen beginnen te hechten, verwijdert u 1 ml media en vervangt u deze door hetzelfde volume media in de slaapstand, en schudt u voorzichtig om te mengen. Zodra de media zijn gemengd, herhaalt u dit proces en verwijdert u de helft van de aanwezige media en vervangt u deze door hetzelfde volume neuronengroeimedia, waarna u voorzichtig mengt.
        OPMERKING: De dag van plating wordt beschouwd als dag in vitro (DIV) 0 en cellen zijn klaar om beeld te krijgen bij DIV 7 (Figuur 2).

3. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming van levende cellen

OPMERKING: Celtypen en oorsprong (d.w.z. gekweekte en primaire cellen) kunnen verschillen in kleuringsvereisten; Zie gepubliceerde rapporten voor meer details62,63.

  1. Bereiding van PKmito Orange
    OPMERKING: Andere kleurstoffen die over het algemeen vlekken maken op de IMM zijn gemeld64,65,66 en zijn in de handel verkrijgbaar. PKMO is de enige die in dit protocol wordt gebruikt.
    1. Resuspendeer poeder PKMO (zie Materiaaltabel) in DMSO volgens de instructies van de fabrikant89. Zuig de media uit de cellen en was ze in voorverwarmde fenolrode vrije media. Bereid een voorraad PKMO in voorverwarmde, fenolroodvrije DMEM aangevuld met 2% (v/v) FBS of 10% (v/v), afhankelijk van de differentiatietoestand, HEPES tot een eindconcentratie van 20 mM en 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum voordat de cellen worden gekleurd volgens de instructies van de fabrikant. Deze formulering, zonder PKMO, is het beeldvormingsmedium van levende cellen.
  2. Celkleuring met PKMO
    1. Incubeer de cellen met de kleurstof bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min. Was de cellen driemaal met beeldvormingsmedia van levende cellen en incubeer voor de laatste wasbeurt gedurende 30 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
    2. Voeg verse, voorverwarmde beeldvormingsmedia voor levende cellen toe. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming.
      OPMERKING: Acute behandelingen (bijv. medicijnen en/of stressoren) worden, indien gebruikt, toegevoegd vóór live beeldvorming; zie de sectie Discussie en aanvullende figuur 1.

4. Beeldvorming van levende cellen door STED-microscopie

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een STED-systeem dat is opgebouwd rond een omgekeerde microscoop, met het systeem gespecificeerd in de Materiaaltabel. Dit systeem is uitgerust met gepulseerde excitatielasers (561 nm laser met nominaal vermogen ~300 μW) en een gepulste 775 nm STED depletielaser (nominaal vermogen 1,2 W), een traploos instelbare galvanoscanner en een 615/20 nm filtergebaseerde lawinefotodiodedetector (APD). Hier wordt een 100x/1.40 olie-immersielens voor STED gebruikt. Lightbox-software wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Alle verstrekte details hebben rechtstreeks betrekking op deze software en systeemconfiguratie.

  1. Algemene richtlijnen en stappen voor beeldvorming
    1. Gebruik een incubator of omgevingskamer om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, maar kortstondige experimenten op kamertemperatuur zijn ook acceptabel. Deze stappen zijn specifiek voor de hierboven beschreven STED-opstelling.
    2. Selecteer de laser- en filtersets voor beeldvorming.
      1. Gebruik parameters voor een oranje kleurstof door de kleurstof(fen) te selecteren die bij de kleuring zijn gebruikt (zijn) uit de kleurstoflijst, of degene met spectrale eigenschappen die het dichtst bij de gebruikte kleurstof(fen) liggen. Maak deze actief door erop te dubbelklikken of ze naar de voorbeeldlijst te slepen, waar staat 'Sleep kleurstof(ken) hierheen'.
    3. Selecteer een regio om te imagen.
      1. Maak in een overzicht een interessegebied (ROI) rond een mitochondrion van interesse door de rechthoekige ROI-knop te selecteren en te klikken en te slepen om het gebied vorm te geven. De ROI kan worden vergroot of verkleind en geroteerd met behulp van de ROI-hoeken of gebogen randen die verschijnen wanneer u met de muis over een hoek beweegt.
        OPMERKING: Een samenvatting van de voorgestelde beeldvormingsparameters is te vinden in Tabel 1. Deze parameters werden empirisch aangepast met behulp van de parameters die eerder zijn gerapporteerd voor deze STED-opstelling en kleurstofcombinatie63.
    4. Stel gating in.
      1. Selecteer naast het menu Algemeen het menu Gating of klik en houd vast om het menu aan de weergave toe te voegen. Het wordt aanbevolen om de poort van de STED-detector af te stellen op 1-1.05 tot 7.8-7.85 ns, zoals hier weergegeven. Poorttijden kunnen variëren en zo kort zijn als 1-1.05 tot 7-7.05 ns.
    5. Pas de intensiteit op de juiste manier aan volgens het monster.
      OPMERKING: Over het algemeen is het excitatievermogen dat wordt gebruikt voor STED 2-3 keer het vermogen dat wordt gebruikt voor confocaal, dus een monster dat 5% excitatielaservermogen nodig heeft voor confocaal, kan 10% -15% excitatielaservermogen gebruiken tijdens STED-acquisitie.
      1. Stel de excitatielaser voor STED in op 15%-20% en de STED-depletielaser op 20%-25% met 10 lijnaccumulaties. Gebruik een pixelverblijftijd van 4 μs met een pixelgrootte van 20-25 nm. Het gaatje werd op 1,0 AE gehouden voor gekweekte cellen en 0,7 AE voor primaire hippocampuscellen van ratten om de optische doorsnede in de dichter opeengepakte mitochondriën te verbeteren.
        OPMERKING: Confocale en STED-beelden kunnen beide worden verkregen voor vergelijking naast elkaar (Figuur 3A, B, Figuur 4A) of alleen STED kan worden verkregen.
  2. Aanvullende informatie voor tijdreeksen/z-reeksen
    1. Selecteer de tijdreeks.
      1. Selecteer het vervolgkeuzemenu Tijd. Definieer het aantal iteraties (5 hier gebruikt) en het tijdsinterval (25 of 30 s hier gebruikt) dat gewenst is voor een timelapse (Figuur 3C, D, Figuur 4B).
        OPMERKING: Als het interval korter is dan de acquisitietijd, worden de iteraties zonder enige vertraging voortgezet. Bij het uitvoeren van een timelapse wordt het ten zeerste aanbevolen om een perfecte scherpsteleenheid of soortgelijke focustracking in te schakelen om mogelijke drift te voorkomen.
    2. Stel het volumebereik in.
      1. Stel het z-volumebereik naar wens in door de optie Volume in te schakelen en de twee uiteinden van het bereik aan te passen. De stapgroottes die in dit protocol voor 2D-beeldvorming werden gebruikt, waren 150-200 nm. De aanbevolen stapgrootte met betrekking tot Nyquist-bemonstering die nodig is voor de deconvolutie van ruwe STED kan worden berekend met online tools90.
        OPMERKING: Het vermogen van de STED-uitputtingslaser en het aantal afgebeelde vlakken kunnen het fotobleken van kleurstof en de blootstelling aan licht aan de cel tot schadelijke niveaus verhogen. Controleer op tekenen van fototoxiciteit en fotobeschadiging na acquisitie.

5. Verwerkings- en analysetools voor mitochondriale ultrastructuur

OPMERKING: Beeldverwerking (d.w.z. deconvolutie) is optioneel, maar wordt meestal gebruikt bij het maken en analyseren van STED-afbeeldingen voor publicatie. Deconvolutie om het contrast te verbeteren en ruis te verminderen wordt sterk aanbevolen voor een optimale segmentatie van individuele cristae, zoals hieronder beschreven (Figuur 2).

  1. Deconvolutie van STED-afbeeldingen
    OPMERKING: De software die in dit protocol voor deconvolutie wordt gebruikt, vindt u in de materiaaltabel.
    1. Stel de microscopische parameters van de afbeelding in.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de microscoopmetadata correct zijn ingevoerd in de afbeelding Microscopische parameters. Dit omvat het monteren van een gemiddelde brekingsindex; onderdompelingsmedium; pixel grootte; excitatie-, emissie- en uitputtingsgolflengten; en alle andere relevante informatie. Sjablonen met deze parameters kunnen worden opgeslagen voor hergebruik.
    2. Deconvolueer onbewerkte STED-afbeeldingen met het software-algoritme.
      1. Toegang tot geautomatiseerde deconvolutie-algoritmen in deconvolutiesoftware maakt hands-off deconvolutiebeeldverwerking mogelijk. Selecteer de knop Express en stel het deconvolutietype in op Snel, Standaard, Agressief of Conservatief voor verschillende gradaties van deconvolutievermogen. Representatieve afbeeldingen met de instellingen Express Deconvolution with Aggressive worden weergegeven (Afbeelding 3, Afbeelding 4 en Afbeelding 5).
      2. Sla de beelden van de deconvolutiesoftware op in ICS2-formaat.
    3. Voer de volgende stappen uit voor handmatige deconvolutie.
      1. Kortom, wanneer u handmatige deconvolutie uitvoert, slaat u de sjablonen van de deconvolutiewizard op voor consistentie en heeft u de mogelijkheid om een sjabloon te laden bij het starten van de wizard. Gebruik PSF-informatie (Measured Point Spread Function) als deze is gegenereerd met acquisitie-instellingen en parameters.
      2. Snijd indien nodig een onbewerkte STED-afbeelding bij voordat u de deconvolutiesoftware de afbeelding automatisch laat stabiliseren. Add-ons voor deconvolutiesoftwarepakketten maken specifieke compensatie mogelijk van mogelijke beeldvormingsartefacten zoals thermische drift en chromatische aberraties.
      3. Genereer vervolgens een logaritmisch histogram om handmatig of automatisch achtergrondaftrekkingen uit te voeren. Selecteer het klassieke CMLE-deconvolutiealgoritme (Maximum Likelihood Estimation).
        OPMERKING: Voor deconvolutie zijn de belangrijkste waarden die moeten worden aangepast de signaal-ruisverhoudingsdrempel, het aantal iteraties en de kwaliteitsdrempel. Deze waarden kunnen worden aangepast en de deconvolutie kan worden bekeken om de optimale instellingen te bepalen.
  2. Segmentatie en deeltjesanalyse
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van FIJI (Is Just ImageJ), een open-source software (zie Tabel met materialen), voor segmentatie en analyse. Andere vergelijkbare software, waaronder CellProfiler, Icy, Ilastik en QuPath, is voor deze doeleinden beschikbaar.
    1. Bereid afbeeldingen voor op segmentatie.
      1. Open de .obf raw STED-afbeeldingen of .ics2-bestanden van de deconvolutiesoftware door naar Bestand → Openen te gaan of door op de bestanden te klikken en ze naar de ImageJ-werkbalk te slepen. Vanaf hier kan elke verwerking die het gemakkelijker maakt om afbeeldingen te segmenteren, worden uitgevoerd voordat ze worden gesegmenteerd.
      2. Om wijzigingen consistent te houden, legt u functies vast met behulp van plug-ins → macro's → Record en kopieert en plakt u toetsopdrachten in een nieuwe macro, vanuit Plug-ins → Nieuwe → macro. Zorg ervoor dat u de afbeelding selecteert die u wilt verwerken voordat u de macro uitvoert.
        OPMERKING: Algemeen acceptabele wijzigingen voor kwantificering van grootte en vorm zijn onder meer bijsnijden, het projecteren van een z-stapel en achtergrondaftrekken met afvlakking uitgeschakeld. Wijzigingen moeten consistent worden uitgevoerd tussen afbeeldingen binnen een gegevensset en worden gerapporteerd.
    2. Trainbare Weka-segmentatie-instellingen aanpassen
      OPMERKING: Aanvullende details met stapsgewijze instructies voor het gebruik van de semi-geautomatiseerde segmentatietool en stroomafwaartse analyses voor mitochondriën zijn gepubliceerd91.
      1. Open de gedeconvoleerde STED-afbeeldingen in de plug-in Trainable Weka Segmentation (TWS)92, die zich onder Plug-ins → Segmentatie → Trainbare Weka-segmentatie bevindt. Selecteer in de segmentatie-instellingen de functies Gaussiaanse vervaging, membraanprojecties en Sobel-filter. De standaard membraandikte is 1 en de standaard patchgrootte van het membraan is 19.
      2. Label klasse 1 of 2 als de "Cristae" en de andere als de "Achtergrond" (Figuur 2). Modellen kunnen ook worden opgeslagen met de knop Classificatie opslaan . Selecteer de classificatie Laden om deze instellingen opnieuw te gebruiken voor andere afbeeldingen.
    3. Voer TWS-klassetraceringen uit.
      1. Gebruik het lijngereedschap of andere vormen om een deel van de kristallijn of achtergrond te markeren. Ten minste sommige achtergrondselecties moeten spaties tussen de cristae bevatten. Trek een lijn over de structuur om aan een van beide klassen toe te wijzen en selecteer vervolgens de knop Toevoegen aan de rechterkant voor cristae of achtergrond. Dubbelklik op een tracering om de structuur van dat label te verwijderen.
    4. Voer TWS-classificatietraining uit.
      1. Selecteer de knop Treinclassificatie aan de linkerkant om een kaart te genereren op basis van de informatie die aan de plug-in is verstrekt. De overlay van gesegmenteerde klassen kan worden in- en uitgeschakeld met de knop Overlay in- en uitschakelen, en de dekking van de overlay kan worden aangepast in Instellingen. De classificatie kan opnieuw worden getraind met extra labels. Als u tevreden bent, selecteert u de knop Waarschijnlijkheid ophalen.
    5. Meet de deeltjes.
      1. Gebruik de cristae-waarschijnlijkheidskaart om de afbeelding te drempelen om een masker te genereren en ga vervolgens naar Deeltjes analyseren → analyseren. Over het algemeen kan het standaarddrempeltype worden gebruikt en kan het bereik worden aangepast om ervoor te zorgen dat de volledige cristae wordt verantwoord. De metingen die worden geleverd door deeltjes te analyseren, kunnen worden aangepast door Analyze → Set Measurements.
        OPMERKING: Voorbeelden van grootte- en vormparameters zoals oppervlakte, omtrek, rondheid en hoogte-breedteverhouding van de cristae worden gemeten en weergegeven op basis van de geselecteerde metingen (Figuur 2, Figuur 5A, Aanvullende tabel 1).
      2. OPTIONEEL: Selecteer de onbewerkte STED-afbeelding met dezelfde afmetingen als de gedeconvolueerde afbeelding en pas de ROI's van de manager toe, selecteer vervolgens Meten in de ROI-manager om intensiteitswaarden te verkrijgen.
    6. Verkrijg lijnplots.
      1. Lijnplots werden gegenereerd op basis van de gedeconvolueerde STED-beelden. Teken een meerpuntslijn, pas de lijndikte aan tot enkele pixels breed om ruis uit te middelen en spline de lijn zodat deze in de mitochondriën past (Figuur 2, Figuur 5B). De resulterende gegenereerde lijngrafiek wordt gebruikt om piek-tot-piekafstanden te meten om de periodiciteit en verdeling van cristae over een bepaald bereik te rapporteren.
        OPMERKING: Hieraan gerelateerd kan de dichtheid van cristae worden gerapporteerd als het aantal onafhankelijke cristae binnen een bepaald gebied, zoals bepaald door het buitenste deel van de mitochondriën te meten. Het mitochondriale gebied kan worden bepaald door een filter toe te passen op het gedeconvolueerde of onbewerkte STED-beeld om een masker te genereren. Zorg ervoor dat het masker nauwkeurig past bij de omtrek van de mitochondriën voordat u het gebied meet.

Representative Results

Dit protocol beschrijft celgroeicondities voor gekweekte en primaire cellen met een focus op STED-beeldvorming van levende cellen en daaropvolgende analyses van mitochondriale cristae. Projecties gemaakt met ImageJ van mitochondriën van ongedifferentieerde SH-SY5Y (Figuur 3A) en RA-gedifferentieerde SH-SY5Y (Figuur 3B) cellen kunnen worden verzameld als z-stacks met traditionele confocale en STED, en de ruwe STED-beelden kunnen vervolgens worden gedeconvolueerd. Timelapse-beeldvorming kan ook worden uitgevoerd en vervolgens worden gedeconvolueerd (Figuur 3C,D). Met behulp van enigszins verschillende beeldvormingsparameters voor primaire hippocampusneuronen van ratten (tabel 1), kunnen confocale en onbewerkte STED-beelden worden verkregen als z-stacks en kunnen de onbewerkte STED-beelden worden gedeconvolueerd (Figuur 4A). Timelapse-beeldvorming van mitochondriën van primaire neuronen is ook mogelijk (Figuur 4B). Over het algemeen moeten de time-lapse-beelden mitochondriale dynamische gebeurtenissen kunnen weergeven.

Wanneer ruwe STED- en gedeconvolueerde STED z-stack-projecties van de monsters die voor segmentatie worden gebruikt, consistent lijken, worden kwantitatieve metingen uitgevoerd. De TWS-plug-in gebruikt de gedeconvoleerde STED-afbeelding om te segmenteren om een waarschijnlijkheidsmasker te maken, dat vervolgens wordt gebruikt om een binair masker van de cristae te maken om grootte- en vormparameters te verkrijgen (Figuur 5A). De regio's van dit masker worden opgeslagen in de ROI-manager en kunnen desgewenst worden toegepast op de onbewerkte STED-afbeelding om verschillen in relatieve intensiteit te meten. De gedeconvolueerde STED-projecties kunnen ook worden gebruikt om de periodiciteit en dichtheid van de cristae in een bepaald gebied te bepalen (figuur 5B).

Figure 1
Figuur 1: Mitochondriale morfologie. Mitochondriën hebben een systeem met twee membranen dat verschillende subcompartimenten definieert (A). Cristae zijn invouwen van het binnenmembraan met gedefinieerde kenmerken (B). Afkortingen: OMM, buitenste mitochondriaal membraan; ICS, intrakristalle ruimte; IMS, intermembraanruimte; CM, cristae membraan; IBM, binnenste grensmembraan; IMM, binnenste mitochondriaal membraan; CT, cristae tip; CJ, cristae kruising. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schema van de workflow. SH-SY5Y-cellen of primaire hippocampusneuronen van ratten worden gekweekt op een PDL-gecoat dekglas. SH-SY5Y-cellen worden parallel gekweekt om ongedifferentieerd te blijven of worden onderworpen aan RA-differentiatie in de loop van zes dagen. Primaire hippocampusneuronen van ratten werden gekweekt op een PDL-gecoat dekglas nadat ze zeven dagen lang waren geïsoleerd uit hippocampussecties. Eenmaal klaar om te worden afgebeeld, werden cellen gekleurd met PKMO en afgebeeld met STED. Onbewerkte STED-beelden worden vervolgens gedeconvolueerd en de gedeconvoleerde beelden worden verwerkt in FIJI om grootte- en vormmetingen te verkrijgen, zoals cristae-dichtheid, oppervlakte, omtrek, circulariteit en beeldverhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Beeldvorming van mitochondriën in SH-SY5Y cellen. Representatieve confocale (links), ruwe STED (midden) en Huygens gedeconvolueerde STED beeld z-stack projecties (rechts) van mitochondriën van niet-gedifferentieerde (A) en RA-gedifferentieerde (B) SH-SY5Y-cellen met PKMO-kleuring worden getoond. Een timelapse met intervallen van 30 s en 5 iteraties van RA-gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen wordt getoond (C) met geselecteerde regio's (witte vakken) uitgebreid (D) met behulp van geschaalde afbeeldingen van die regio's zonder interpolatie. Schaal staven: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Beeldvorming van mitochondriën in primaire hippocampusneuronen van ratten. Representatieve confocale (links), ruwe STED (midden) en Huygens gedeconvolueerde STED (rechts) beeld z-stack projecties van mitochondriën van primaire hippocampusneuronen van ratten worden getoond (A). Een timelapse met intervallen van 25 s en 5 iteraties van mitochondriën in deze neuronen wordt getoond (B). Schaal balken: A, 250 nm; B, 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Verwerking van gedeconvoleerde STED-beelden in ImageJ. Representatief gebruik van de plug-in Trainable Weka Segmentation om de grootte en vorm van cristae te meten, wordt weergegeven (A). Van links naar rechts worden de volgende afbeeldingen getoond: de gedeconvolueerde STED-afbeelding, de waarschijnlijkheidskaart op basis van segmentatie van de TWS-plug-in, het masker van drempelwaarden in FIJI met de waarschijnlijkheidskaart als invoer, het masker met de ROI's geschetst en de ROI's die over de originele gedeconvolueerde STED-afbeelding zijn gelegd. De resulterende oppervlakte-, omtrek-, cirkelvormigheids- en hoogte-breedteverhoudingsmetingen die met deze objecten overeenkomen, zijn te vinden in aanvullende tabel 1. Er wordt een lijndiagram weergegeven met behulp van het gedeconvoleerde STED-beeld om piek-tot-piekafstanden te meten als uitlezing voor de dichtheid van cristae (B). Schaalbalken: 0,5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Pixelgrootte (nm) Verblijftijd (μs) Lijn acc. 561 nm excitatie tijdens STED-acquisitie (%) 775 nm STED-uitputtingsvermogen (%) Stapgrootte (nm) Gaatje (AU) Timelapse-interval(en) Timelapse-iteraties
Ongedifferentieerde SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5
RA-gedifferentieerde SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5
Primaire neuronen 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5
OPMERKING: De pixelgrootte kan variëren, afhankelijk van de beeldvereisten en de intentie om afbeeldingen te deconvolveren. Voor deconvolutie is een goede bemonstering vereist. Pixelgroottes voor onbewerkte STED-afbeeldingen zonder deconvolutie kunnen oplopen tot 30 nm.

Tabel 1: Samenvatting van STED-acquisitieparameters. De instellingen die worden gebruikt voor 2D STED-beeldvorming voor elk celtype, ongedifferentieerde SH-SY5Y, RA-gedifferentieerde SH-SY5Y en primaire hippocampusneuronen van ratten, worden weergegeven. Voor alle time-lapses werden 5 iteraties genomen met verschillende intervallen op basis van de ROI-grootte.

Aanvullende figuur 1: Beeldvorming van SH-SY5Y-cellen met amyloïde-β (Aβ)-additie. Representatieve confocale (links), ruwe STED (midden) en gedeconvolueerde STED (rechts) beelden van RA-gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen met PKMO-kleuring (boven) en Aβ-HiLyte647 (onder) worden getoond (A). Samengevoegde z-stack projecties van ruwe PKMO STED (groen) met ruwe Aβ STED (magenta) (B) of gedeconvoleerde PKMO STED (groen) met gedeconvoleerde Aβ STED (magenta) (C) worden getoond. Schaalbalken: 0,5 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Afmetingen en vorm van gesegmenteerde cristae. De grootte- en vormmetingen van oppervlakte (μm2), omtrek (μm), circulariteit en hoogte-breedteverhouding, overeenkomend met de objecten die in figuur 5A worden geschetst van gesegmenteerde mitochondriën, worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Samenvatting van de acquisitieparameters met amyloïde-β monsters. De instellingen die worden gebruikt voor 2D STED-beeldvorming van PKMO en Aβ-HiLyte647 in ongedifferentieerde en RA-gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen worden weergegeven. Confocaal van Aβ-HiLyte647 kan alleen worden gebruikt omdat er geen specifieke structuur is om op te lossen; STED-afbeeldingen van Aβ-HiLyte647 worden hier getoond voor kleinere deeltjesgroottes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Behandelingsprotocol voor amyloïde-β. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol presenteert het gebruik van menselijke neuroblastoomcellijn SH-SY5Y en primaire hippocampusneuronen van ratten met de nieuwe IMM-gerichte PKMO-kleurstof voor STED-beeldvorming met levende cellen. Vanwege de nieuwigheid van PKMO is er momenteel weinig gepubliceerd met behulp van deze kleurstof voor live STED-beeldvorming. Het gebruik van deze celtypen voor SOA-beeldvorming brengt uitdagingen met zich mee, met name omdat neuronale cellen smallere mitochondriën hebben. Een beperking van dit protocol is de gebruikte PKMO-kleurstof, omdat deze giftig kan zijn voor cellen. Verschillende cellen en cellijnen reageren anders op de kleurstof, dus aanpassingen van de kleurstofconcentratie en incubatietijd om de resultaten voor een sterk signaal te optimaliseren zonder de cellen te beschadigen, kunnen nodig zijn. Een voorgestelde oplossing is om de concentratie te verlagen en de kleuringstijd te verlengen63; Dit kan echter leiden tot een slechtere kleuring zonder de levensvatbaarheid van de cellen te vergroten.

Net als PKMO vertoont de commerciële kleurstof Live Orange mito (Table of Materials) ook enige celtoxiciteit. Deze kleurstof werd gebruikt voor een verscheidenheid aan gekweekte cellen, maar was niet in staat om vergelijkbare kleuring te vertonen in RA-gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen met succes met dezelfde parameters als hun ongedifferentieerde tegenhangers (onze niet-gepubliceerde waarnemingen). Ontvankelijke kleuringsprotocollen kunnen echter worden geoptimaliseerd voor deze sonde en gekozen celtypen. Bij deze kleurstof werden detectorpoorttijden van 1-1,05 tot 7-7,05 ns gebruikt, terwijl alle andere parameters in tabel 1 hetzelfde bleven. Over het algemeen leverde het kleuren van cellen met 200-250 nM Live Orange mito gedurende 45 minuten vergelijkbare resultaten op als de getoonde PKMO-resultaten. Kleuring met een hogere concentratie voor minder tijd of een kleuring met een lagere concentratie gedurende dezelfde tijd of iets langer kan verschillende resultaten opleveren en kan gunstig zijn voor andere celtypen of groeiomstandigheden.

Het in beeld brengen van primaire hippocampusneuronen van ratten verschilt van onsterfelijke cellen vanwege de aard van de axon- en dendrietprojecties en de mitochondriale distributie op het moment van beeldvorming. Een moeilijkheid in dit deel van het protocol is dat de zaaidichtheid bepaalt of de primaire culturen zich kunnen hechten en gezond kunnen groeien, en bij hogere dichtheden hebben de projecties de neiging om te overwoekeren met DIV 10. Daarom zullen de mitochondriën die door deze primaire neuronen worden afgebeeld, waarschijnlijk afkomstig zijn van het cellichaam en niet van de projecties; Succesvolle groei vanuit een lagere startceldichtheid levert echter betere beeldvormingsresultaten op latere groeitijdstippen op. De sleutel is om te zorgen voor weinig achtergrond- en onscherp licht om het beste contrast voor STED te hebben. Om de bezorgdheid over de celpopulatie weg te nemen, voorkomt het kweken van primaire hippocampuscellen in B27-gesupplementeerde neuronengroeimedia de groei van gliacellen, en de bron meldt dat <5% van de cellen astrocyten zijn en dat de afwezigheid van NbActiv1-supplement in de groeimedia het aantal astrocyten in culturen vermindert tot <2%87. Voor zowel gekweekte SH-SY5Y-cellen als primaire hippocampusneuronen van ratten draagt de PDL-coating die voor groei wordt gebruikt, bij aan achtergrondwaas in afbeeldingen. Er wordt voldoende signaal-ruisverhouding bereikt met de instellingen die worden gerapporteerd in (tabel 1) en deconvolutie verwijdert het grootste deel van de waargenomen achtergrond.

Naast de beeldvorming die hier wordt behandeld, is het ook mogelijk om behandelingen of stress aan cellen toe te voegen voor of tijdens beeldvorming. Het toevoegen van tert-butylwaterstofperoxide (tBHP) induceert bijvoorbeeld oxidatieve stress en het is mogelijk om veranderingen in mitochondriën in de loop van de tijd na toevoeging te volgen. De toevoeging van amyloïde-β (Aβ) met een fluorescerende tag maakt het mogelijk om de verdeling van dit peptide in relatie tot mitochondriën en de mitochondriale structuur in de loop van de tijd te volgen. Mitochondriale gezondheid is sterk betrokken bij AD en wordt algemeen ondersteund om een rol te spelen bij Aβ-toxiciteit 43,71,72. Met name de differentiatiestatus van SH-SY5Y-cellen beïnvloedt de lokalisatie van Aβ-eiwitprecursor (AβPP)85, en experimenten met AβPP moeten zorgvuldig worden geconstrueerd.

Als voorbeeld van hoe dit protocol kan worden aangepast, wordt aangetoond dat de fluorescerende variant Aβ(1-42)-HiLyte 647 15 minuten voor de beeldvorming kan worden toegevoegd aan PKMO-gekleurde cellen (aanvullende figuur 1). De beeldvormingsparameters zijn vergelijkbaar (aanvullende tabel 2), met als belangrijkste verschil dat een kleiner gaatje nodig is bij het afbeelden van smallere mitochondriën. Het in beeld brengen van Aβ-HiLyte647 met STED vereist minder algehele excitatie (6%-8%) en STED-uitputting (10%-12%) laservermogen en minder ophopingen (zes). Ook de detectorpoort wordt uitgebreid van 0,1 naar 10 ns. Hoewel de STED-resolutie van Aβ niet nodig is, waren de totale signaal-ruisverhouding en de Aβ-deeltjesgrootte van de ruwe STED beter dan die van de confocale beelden, en kan ook daaropvolgende deconvolutie worden uitgevoerd. Het verzamelen van STED-beelden en het deconvoleren van onbewerkte STED z-stack-projecties van Aβ lijkt vooral nuttig bij het samenvoegen met onbewerkte STED- of gedeconvolueerde STED-beelden van de PKMO-kleuring (aanvullende figuur 1B,C). Beide kanalen werden verzameld in een enkele framestap. Metingen van tijdsafhankelijke lokalisatie, vergelijkbaar met die vermeld in figuur 2 en weergegeven in figuur 5, indien van toepassing, en verschillen in de kristalarchitectuur kunnen worden verkregen na stressbehandeling of andere toevoegingen.

Andere mogelijke methoden voor dubbele labeling in levende cellen STED van mitochondriën die hier niet worden gerapporteerd, maar door anderen zijn gemeld, zijn onder meer het gebruik van SNAP-gelabelde eiwitten93, Halo-gelabelde eiwitten en het gebruik van andere celdoorlatende kleurstoffen met generieke doelen, zoals mtDNA63. Met name de etiketteringsstrategie van SNAP- en Halo-tagging beïnvloedt de resulterende fluorescentiesignaalintensiteit en levensduur bij beeldvorming94. Bovendien, hoewel dit protocol verschillende voorbeelden geeft van analyses die kunnen worden toegepast op gesegmenteerde mitochondriën, zijn er veel andere analyses die softwarepakketten op deze afbeeldingen kunnen uitvoeren.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Primaire hippocampusneuronen van ratten werden geleverd door Dr. George Lykotrafitis en Shiju Gu van de afdeling Biomedische Technologie van de Universiteit van Connecticut (Storrs, CT, VS). Het Abberior STED-instrument, gehuisvest in de Advanced Light Microscopy Facility in het Center for Open Research Resources and Equipment, werd verworven met NIH-subsidie S10OD023618 toegekend aan Christopher O'Connell. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH-subsidie R01AG065879 toegekend aan Nathan N. Alder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in -- -- Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) -- The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus -- This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior -- Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior -- STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Tags

Levende cel STED-beeldvorming mitochondriaal binnenmembraan ultrastructuur neuronale celmodellen mitochondriën energieproductie Ca2+ homeostase lipidenbiosynthese reactieve zuurstofsoorten (ROS) neuronen aëroob metabolisme Ca2+-signalering axongroei en -regeneratie ROS-productie neurodegeneratieve ziekten mitochondriale disfunctie binnenmembraanstructuur cristae moleculaire systemen diffractiebeperkte opgeloste microscopie elektronenmicroscopie superresolutie fluorescentiemicroscopie
Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, E. L., Reed, A. L.,… More

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter