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Neuroscience

न्यूरोनल सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल इनर मेम्ब्रेन अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग का उपयोग करना

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65561
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

Summary

यह प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर विज़ुअलाइज़ेशन और उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के प्रसार, भेदभाव और धुंधलापन के लिए एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में कई आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें ऊर्जा उत्पादन, सीए2 + होमियोस्टैसिस का विनियमन, लिपिड जैवसंश्लेषण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन शामिल है। ये माइटोकॉन्ड्रिया-मध्यस्थता प्रक्रियाएं न्यूरॉन्स में विशेष भूमिका निभाती हैं, इन कोशिकाओं की उच्च ऊर्जा मांगों को पूरा करने के लिए एरोबिक चयापचय का समन्वय करती हैं, सीए2 + सिग्नलिंग को संशोधित करती हैं, अक्षतंतु विकास और पुनर्जनन के लिए लिपिड प्रदान करती हैं, और न्यूरोनल विकास और कार्य के लिए आरओएस उत्पादन को ट्यून करती हैं। इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक केंद्रीय चालक है। माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और कार्य अटूट रूप से जुड़े हुए हैं। क्रिस्टे नामक संरचनात्मक परतों के साथ रूपात्मक रूप से जटिल आंतरिक झिल्ली कई आणविक प्रणालियों को आश्रय देती है जो माइटोकॉन्ड्रियन की हस्ताक्षर प्रक्रियाओं को निष्पादित करती हैं। आंतरिक झिल्ली की वास्तुशिल्प विशेषताएं अल्ट्रास्ट्रक्चरल हैं और इसलिए, पारंपरिक विवर्तन-सीमित हल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर पर अधिकांश अंतर्दृष्टि निश्चित नमूनों पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से आई है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में उभरती प्रौद्योगिकियां अब दसियों नैनोमीटर तक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती हैं, जिससे लाइव कोशिकाओं में अल्ट्रास्ट्रक्चरल सुविधाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल संरचना, नैनोस्केल प्रोटीन वितरण और क्रिस्टे गतिशीलता के ठीक विवरण ों को सीधे चित्रित करने की एक अभूतपूर्व क्षमता प्रदान करता है, जो मौलिक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो माइटोकॉन्ड्रिया को मानव स्वास्थ्य और बीमारी से जोड़ता है। यह प्रोटोकॉल जीवित मानव न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के उपयोग को प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया को पांच वर्गों में व्यवस्थित किया जाता है: (1) एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन का विकास और भेदभाव, (2) प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का अलगाव, चढ़ाना और विकास, (3) लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को धुंधला करने की प्रक्रियाएं, (4) संदर्भ के लिए एसटीईडी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाइव सेल एसटीईडी प्रयोगों के लिए प्रक्रियाएं, और (5) आंतरिक झिल्ली की रूपात्मक विशेषताओं को मापने और मापने के लिए उदाहरणों का उपयोग करके विभाजन और छवि प्रसंस्करण के लिए मार्गदर्शन।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया एंडोसिम्बायोटिक मूल के यूकेरियोटिक ऑर्गेनेल हैं जो मध्यस्थ चयापचय और एटीपी उत्पादन, आयन होमियोस्टैसिस, लिपिड बायोसिंथेसिस और प्रोग्राम्ड सेल डेथ (एपोप्टोसिस) सहित कई प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। ये ऑर्गेनेल टोपोलॉजिकल रूप से जटिल होते हैं, जिसमें एक डबल झिल्ली प्रणाली होती है जो कई सबकम्पार्टमेंट 1 (चित्रा 1 ए) स्थापित करती है। बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) साइटोसोल के साथ इंटरफेस करती है और प्रत्यक्ष अंतर-ऑर्गेनेल संपर्क 2,3 स्थापित करती है। आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) एक ऊर्जा-संरक्षण झिल्ली है जो मुख्य रूप से एटीपी संश्लेषण और अन्य ऊर्जा-आवश्यकप्रक्रियाओं को चलाने के लिए एक विद्युत झिल्ली क्षमता (त्रिभुजएम) के रूप में संग्रहीत आयन ग्रेडिएंट को बनाए रखती है। आईएमएम को आगे आंतरिक सीमा झिल्ली (आईबीएम) में विभाजित किया गया है, जो ओएमएम से निकटता से जुड़ा हुआ है, और क्रिस्टे नामक उभरी हुई संरचनाएं जो क्रिस्टे झिल्ली (सीएम) से बंधी हुई हैं। यह झिल्ली इंट्राक्रिस्टल स्पेस (आईसीएस) और इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (आईएमएस) से सबसे भीतरी मैट्रिक्स डिब्बे को चित्रित करती है।

माइटोकॉन्ड्रिया में विखंडन और संलयन की निरंतर और संतुलित प्रक्रियाओं के आधार पर एक गतिशील आकृति विज्ञान होता है जो डायनामिन सुपरफैमिली6 के मेकेनोएंजाइम द्वारा नियंत्रित होता है। संलयन बढ़ी हुई कनेक्टिविटी और जालीदार नेटवर्क के गठन की अनुमति देता है, जबकि विखंडन माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन की ओर जाता है और माइटोफैगी7 द्वारा क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने में सक्षम बनाता है। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान ऊतक प्रकार8 और विकासात्मक चरण9 द्वारा भिन्न होता है और कोशिकाओं को ऊर्जावान आवश्यकताओं10,11 और तनाव12 सहित कारकों के अनुकूल होने की अनुमति देने के लिए विनियमित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया की मानक मोर्फोमेट्रिक विशेषताएं, जैसे नेटवर्क गठन की सीमा (परस्पर बनाम खंडित), परिधि, क्षेत्र, मात्रा, लंबाई (पहलू अनुपात), गोलाई, और शाखाओं की डिग्री, मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा और परिमाणित किया जा सकता है क्योंकि इन विशेषताओं के आकार प्रकाश की विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम)13 से अधिक हैं।

क्रिस्टे आर्किटेक्चर माइटोकॉन्ड्रिया की आंतरिक संरचना को परिभाषित करता है (चित्रा 1 बी)। क्रिस्टे आकृति विज्ञान की विविधता को मोटे तौर पर फ्लैट (लैमेलर या डिस्कोइडल) या ट्यूबलर-वेसिकुलर14 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। सभी क्रिस्टे आईबीएम में ट्यूबलर या स्लॉट जैसी संरचनाओं के माध्यम से जुड़ते हैं जिन्हें क्रिस्टे जंक्शन (सीजे) कहा जाता है जो आईएमएस को आईसीएस से और आईबीएम को सीएम15 से अलग करने का काम कर सकते हैं। क्रिस्टे आकृति विज्ञान को आईएमएम के प्रमुख प्रोटीन परिसरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें (1) माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइट और क्रिस्टे आयोजन प्रणाली (एमआईसीओएस) शामिल है जो सीजे में रहता है और आईएमएम-ओएमएम संपर्कों को स्थिर करता है16, (2) ऑप्टिक एट्रोफी 1 (ओपीए 1) जीटीपेस जो क्रिस्टे रीमॉडेलिंग17,18,19 को नियंत्रित करता है, और (3) एफ1एफओ एटीपी सिंथेस जो क्रिस्टे टिप्स (सीटी) 20 पर स्थिर ओलिगोमेरिक असेंबली बनाता है। 21. इसके अलावा, आईएमएम नॉनबाइलेयर फॉस्फोलिपिड्स फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन और कार्डियोलिपिन में समृद्ध है जो अत्यधिक घुमावदार आईएमएम22 को स्थिर करता है। क्रिस्टे भी गतिशील हैं, विभिन्न स्थितियों के तहत रूपात्मक परिवर्तन ों का प्रदर्शन करते हैं, जैसे कि विभिन्न चयापचय अवस्थाएं 23,24, विभिन्न श्वसन सब्सट्रेट्स 25 के साथ, भुखमरी और ऑक्सीडेटिव तनाव 26,27 के तहत, एपोप्टोसिस 28,29 के साथ, और उम्र बढ़ने के साथ30. हाल ही में यह दिखाया गया है कि क्रिस्टे सेकंड के टाइमस्केल पर प्रमुख रीमॉडेलिंग घटनाओं से गुजर सकता है, जो उनकी गतिशील प्रकृतिको रेखांकित करता है। क्रिस्टे की कई विशेषताओं को परिमाणित किया जा सकता है, जिसमें व्यक्तिगत क्रिस्टे के भीतर संरचनाओं के आयाम (जैसे, सीजे चौड़ाई, क्रिस्टा लंबाई और चौड़ाई) और पैरामीटर शामिल हैं जो व्यक्तिगत क्रिस्टा को अन्य संरचनाओं से संबंधित करते हैं (उदाहरण के लिए, ओएमएम के सापेक्ष इंट्रा-क्रिस्टा स्पेसिंग और क्रिस्टे घटना कोण)। ये मात्रात्मक क्रिस्टे पैरामीटर फ़ंक्शन के साथ सीधा संबंध दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन की सीमा क्रिस्टे की प्रचुरता से सकारात्मक रूप से संबंधित है, जिसे क्रिस्टे घनत्व या क्रिस्टे संख्या के रूप में एक अन्य विशेषता (जैसे, क्रिस्टे प्रति ओएमएम क्षेत्र) 33,34,35 के रूप में सामान्यीकृत किया गया है। क्योंकि आईएमएम आकृति विज्ञान को नैनोस्केल विशेषताओं द्वारा परिभाषित किया गया है, इसमें माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर शामिल है, जिसके लिए इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है जो प्रकाश विवर्तन सीमा से अधिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती हैं। जैसा कि नीचे वर्णित है, ऐसी तकनीकों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (नैनोस्कोपी) शामिल हैं।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की तंत्रिका और ग्लियल कोशिकाएं विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर निर्भर हैं। औसतन, मस्तिष्क कुल शरीर के वजन का केवल 2% होता है, लेकिन कुल शरीर ग्लूकोज का 25% उपयोग करता है और शरीर की ऑक्सीजन की खपत का 20% हिस्सा होता है, जिससे यह ऊर्जा चयापचय में हानि के लिए कमजोर हो जाताहै। अल्जाइमर रोग (एडी), एम्योट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), हंटिंगटन रोग (एचडी), मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), और पार्किंसंस रोग (पीडी) सहित प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग (एनडी), आज तक के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किए गए विकृति विज्ञान में से कुछ हैं, इन रोगों के आणविक आधार को समझने से लेकर संभावित चिकित्सीय रोकथाम और हस्तक्षेप की मांग करने तक के अनुसंधान प्रयासों के साथ। एनडी माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) 37 द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम हैंडलिंग 38 और माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड चयापचय39 से उत्पन्न होने वाले ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि के साथ जुड़े हुए हैं। ये शारीरिक परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में उल्लेखनीय दोषों के साथ होते हैं जो एडी 40,41,42,43,44, एएलएस 45,46, एचडी47,48,49, एमएस 50 और पीडी 51,52,53 से जुड़े होते हैं।. इन संरचनात्मक और कार्यात्मक दोषों को जटिल कारण-प्रभाव संबंधों द्वारा जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह देखते हुए कि क्रिस्टे आकृति विज्ञान ओएक्सपीएचओएसएंजाइम 54 को स्थिर करता है, माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस न केवल ईटीसी द्वारा उत्पन्न होते हैं, बल्कि वे उस बुनियादी ढांचे को नुकसान पहुंचाने के लिए भी कार्य करते हैं जिसमें ईटीसी रहता है, एक फीड-फॉरवर्ड आरओएस चक्र को बढ़ावा देता है जो ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए संवेदनशीलता को बढ़ाता है। इसके अलावा, क्रिस्टे विघटन को माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) रिलीज और ऑटोम्यून्यून, चयापचय और उम्र सेसंबंधित विकारों से जुड़े भड़काऊ मार्गों जैसी प्रक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का विश्लेषण एनडी और उनके आणविक आधार की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी), और एक्स-रे टोमोग्राफी, विशेष रूप से क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी सहित क्रिस्टे को देखने के लोकप्रिय तरीकों ने महत्वपूर्ण निष्कर्षों का खुलासा किया है और विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों 56,57,58,59,60 के साथ काम किया है।. ऑर्गेनेलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के बेहतर अवलोकन की दिशा में हालिया प्रगति के बावजूद, ये विधियां अभी भी नमूना निर्धारण की आवश्यकता की चेतावनी के साथ आती हैं और इसलिए, सीधे क्रिस्टे की वास्तविक समय की गतिशीलता को पकड़ नहीं सकती हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, विशेष रूप से संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम), और उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी के रूप में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के शास्त्रीय तरीकों को बाधित करने वाली विवर्तन सीमा से नीचे रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता वाली संरचनाओं को देखने के लोकप्रिय तरीके बन गए हैं। जब एक्सएम का उपयोग किसी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक के साथ संयोजन में किया जाता है, तो परिणाम प्रभावशाली होते हैं, लेकिन नमूना को जेल61 में तय और दाग दिया जाना चाहिए। तुलनात्मक रूप से, सिम, पाम / स्टॉर्म, और एसटीईडी सभी को लाइव नमूनों के साथ सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, और नए और आशाजनक रंजक जो आम तौर पर आईएमएम को दाग देते हैं, माइटोकॉन्ड्रिया क्रिस्टी डायनामिक्स 62,63,64,65,66 की लाइव इमेजिंग के लिए एक नया और आसान दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। एसटीईडी इमेजिंग के लिए लाइव रंगों में हालिया प्रगति ने डाई चमक और फोटोस्टेबिलिटी में सुधार किया है, और ये रंजक अपने पूर्ववर्तियों की तुलना में विशिष्टता की उच्च डिग्री पर आईएमएम को लक्षित करते हैं। ये विकास सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ दीर्घकालिक टाइमलैप्स और जेड-स्टैक प्रयोगों के संग्रह की अनुमति देते हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर और गतिशीलता के बेहतर लाइव सेल विश्लेषण के लिए दरवाजा खुलता है।

यहां, एसटीईडी63 का उपयोग करके पीकेमिटो ऑरेंज (पीकेएमओ) डाई से सना अविभाजित और विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं। एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन माता-पिता की सेल लाइन, एसके-एन-एसएच से तीन बार उपक्लोन व्युत्पन्न है, जो मेटास्टैटिक न्यूरोब्लास्टोमा67,68,69,70 की अस्थि मज्जा बायोप्सी से उत्पन्न होती है। यह सेल लाइन एनडी अनुसंधान में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला इन विट्रो मॉडल है, विशेष रूप से एडी, एचडी और पीडी जैसी बीमारियों के साथ, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 10,43,71,72,73 में भारी फंसा हुआ है। संस्कृति मीडिया में हेरफेर के माध्यम से न्यूरॉन जैसे फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता ने प्राथमिक न्यूरोनल कोशिकाओं10,74 पर भरोसा किए बिना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त मॉडल साबित किया है। इस प्रोटोकॉल में, एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए सेल कल्चर माध्यम में रेटिनोइक एसिड (आरए) जोड़ा गया था। आरए एक विटामिन ए व्युत्पन्न है और सेल चक्र को विनियमित करने और प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जो न्यूरोनल भेदभावको नियंत्रित करते हैं। चूहे हिप्पोकैम्पस से अलग न्यूरॉन्स के संवर्धन और लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है। हिप्पोकैम्पस को माइटोकॉन्ड्रियल अपघटन से प्रभावित दिखाया गया है और कॉर्टेक्स के साथ, उम्र बढ़ने और एनडी 76,77,78,79,80 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

Protocol

1. SH-SY5Y कोशिकाओं का प्रसार और विभेदन

  1. सेल विकास और रखरखाव के लिए मीडिया की तैयारी
    1. पूर्ण, उच्च-ग्लूकोज डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम, 4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज, 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट) को अंतिम 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (10,000 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन, 10,000 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg / mL एम्फोटेरिसिन बी) के साथ पूरक तैयार करें। भेदभाव मीडिया में एफबीएस की मात्रा अंतिम 10%, 5%, या 2% (वी / वी) एफबीएस के बीच भिन्न होती है।
  2. सेल रखरखाव
    1. डीएमईएम में कोशिकाओं को 10% (वी / वी) एफबीएस के साथ पूरक बनाए रखें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें, फिर डीएमईएम में बीज जिसमें भेदभाव के लिए 5% (वी / वी) एफबीएस हो। जमे हुए सेल स्टॉक को एफबीएस में 1-2 x 107 सेल / एमएल पर 10% (वी / वी) डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ संग्रहीत किया गया था।
  3. रेटिनोइक एसिड (आरए) की तैयारी
    1. 5 एमएम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए ताजा तैयार 95% इथेनॉल के 5 एमएल में 7.51 मिलीग्राम ऑल-ट्रांस-आरए (सामग्री की तालिका देखें) घोलें। इथेनॉल में 5 μM पर स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने का उपयोग करके, निर्माता के प्रोटोकॉल81 से उत्पाद सूचना पत्रक से प्राप्त 350 nm (3 = 44,300 M-1 cm-1) पर अवशोषण के साथ एकाग्रता की पुष्टि करें। 6 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित 5 एमएम स्टॉक स्टोर करें।
  4. कवरस्लिप कोटिंग के लिए पॉली-डी-लाइसिन की तैयारी
    नोट: पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) उत्पाद प्रोटोकॉल, विक्रेता साइट82 के दस्तावेज़ और डाउनलोड अनुभाग के तहत पाया गया, विभिन्न प्रकार के संस्कृति जहाजों को कोटिंग के लिए जानकारी प्रदान करता है।
    1. इस प्रोटोकॉल में बाँझ # 1.5 बोरोसिलिकेट कवरग्लास बॉटम (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 4 सेमी 2 प्रति कुएं के क्षेत्र के साथ2-अच्छी तरह से चैंबर वाले पोत पर आधारित वॉल्यूम शामिल हैं। डुलबेकको के पीबीएस (डीपीबीएस; कोई कैल्शियम नहीं, कोई मैग्नीशियम नहीं) के साथ पीडीएल के स्टॉक समाधान को दो गुना 50 μg / mL तक पतला करें।
      नोट: # 1.5 या # 1.5 एच कवरग्लास दोनों स्वीकार्य मोटाई हैं, जो छवि की गुणवत्ता के लिए आवश्यक हैं। अन्य मोटाई गोलाकार विपथन को प्रेरित करेगी और इससे बचा जाना चाहिए।
  5. पीडीएल के साथ कवरस्लिप कोटिंग
    नोट: आगे नसबंदी के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में 10-15 मिनट के लिए कवरस्लिप को पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के संपर्क में लाया जा सकता है।
    1. सेल कल्चर कैबिनेट में बाँझ चैंबर्ड कवरलिप्स के प्रत्येक कुएं पर 50 μg / mL PDL समाधान के 1.2 मिलीलीटर लागू करें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीडीएल घोल निकालें और 3.6 मिलीलीटर आसुत जल से तीन बार कुल्ला करें। अंतिम धोने के बाद, लेपित कक्ष को 2 सप्ताह तक धोने और तुरंत उपयोग करने से पहले हवा के संपर्क में 2 घंटे तक सूखने दें या 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एयर-टाइट कंटेनर के साथ भंडारण करें।
      नोट: कवरलिप्स को अच्छी तरह से कुल्ला करें क्योंकि अतिरिक्त पीडीएल कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है।
  6. आरए के साथ एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं का भेदभाव।
    नोट: गद्यांश 15 से ऊपर की कोशिकाओं का उपयोग न करें। कोशिकाओं को 80% -90% प्रवाह पर पारित किया जाता है। भेदभाव प्रक्रियाएं भिन्न होती हैं लेकिन समान चरणों का पालन करती हैं। मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) 68,83,84,85 के साथ आगे के उपचार के साथ न्यूरोब्लास्टोमा से परिपक्व न्यूरॉन्स तक अतिरिक्त भेदभाव प्राप्त किया जाता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन नहीं किया गया था।
    वैकल्पिक: कवरग्लास पर बीज बोने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की स्थापना करें। जमे हुए स्टॉक से कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, कोशिकाओं की 1 एमएल जमी हुई शीशी को तेजी से पिघलाएं और 10% एफबीएस के साथ पूरक 9 एमएल प्रीवार्ममीडिया में जोड़ें, फिर 10 मिनट (कमरे के तापमान पर) के लिए 350 x g पर स्पिन करें और डीएमएसओ को हटाने के लिए सुपरनैटेंट को छोड़ दें। टी -25 फ्लास्क में प्रीवार्म्ड मीडिया और बीज कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक बार जब कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो लागू होने पर विभेदन के लिए उन्हें गिनने और सीडिंग करके कोशिकाओं को पारित करें।
    1. दिन 0: बीज कोशिकाएं।
      1. जमे हुए स्टॉक या एक कामकाजी फ्लास्क से कोशिकाओं को एक चैंबर वाले कवरग्लास पर बीज दें। 1.5 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 के सीडिंग घनत्व का उपयोग करें।
        नोट: 4 सेमी 2 संस्कृति क्षेत्र के साथ मानक2-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में एक एकल कुएं को 6.0 x 104 कोशिकाओं की आवश्यकता होगी। जो कोशिकाएं उदासीन रहेंगी, उन्हें डीएमईएम के साथ 10% (वी / वी) एफबीएस के साथ पूरक किया जाना चाहिए, और जिन कोशिकाओं को विभेदित किया जाएगा, उन्हें डीएमईएम के साथ 5% (वी / वी) एफबीएस के साथ पूरक किया जाना चाहिए।
    2. दिन 1: आरए भेदभाव उपचार शुरू करें।
      1. डीएमईएम को 5% (वी / वी) एफबीएस, 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, और 10 μM आरए या उसी योजक मात्रा के इथेनॉल की अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक तैयार करें ताकि इस भेदभाव प्रक्रिया के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में काम किया जा सके। बीज बोने के लिए उपयोग किए जाने वाले चैंबर वाले कवरग्लास में मीडिया को हटा दें, 1x पीबीएस के साथ कुल्ला करें, और कुओं में नए डीएमईएम जोड़ें।
    3. दिन 3: ताजा आरए- या इथेनॉल युक्त मीडिया के साथ मीडिया को बदलें।
      1. पहले दिन से मीडिया को हटा दें और इस विभेदन प्रक्रिया के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए 2% (वी / वी) एफबीएस, 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, और या तो 10 μM आरए या उसी योजक मात्रा के 95% इथेनॉल के साथ पूरक ताजा मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें। बीज बोने के लिए उपयोग किए जाने वाले चैंबर वाले कवरग्लास में मीडिया को हटा दें, 1x पीबीएस से कुल्ला करें, और कुओं में नया मीडिया जोड़ें।
    4. दिन 6: कोशिकाओं की इमेजिंग करें।
      नोट: सेल भेदभाव समय प्रोटोकॉल द्वारा भिन्न होता है, लेकिन आरए के संपर्क में छह दिन एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं86 में न्यूरॉन जैसे फेनोटाइप को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है।
      1. अनुभाग 3 और 4 (चित्रा 2) में विवरण के साथ लाइव इमेजिंग करें।

2. प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृति।

  1. चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन अलगाव के लिए सामग्री तैयारी।
    1. ताजा पूरक डीएमईएम तैयार करें।
      1. डीएमईएम (उच्च ग्लूकोज, कोई सोडियम पाइरूवेट नहीं) के मिश्रण को 10% (वी / वी) गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, 1% (वी / वी) सोडियम पाइरूवेट समाधान, और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) के साथ पूरक करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें।
    2. ताजा पूरक न्यूरॉन विकास मीडिया तैयार करें।
      1. 2% (वी / वी) बी 27 पूरक, 0.25% (वी / वी) ग्लूटामाइन पूरक, और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक न्यूरॉन विकास मीडिया के मिश्रण को फिल्टर-स्टरलाइज़ करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें।
  2. प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन कल्चर तैयार करें।
    1. पहले प्रकाशित कार्य87 के बाद प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन कल्चर तैयार करें और निर्माता की साइट पर उत्पाद प्रोटोकॉल से जहां से विच्छेदित ई 18 चूहा हिप्पोकैम्पसप्राप्त किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप <2% एस्ट्रोसाइट्स के साथ ज्यादातर न्यूरोनल आबादी होती है।
      नोट: हाइबरनेट मीडिया जिसके साथ इस ऊतक को भेज दिया जाता है, इस प्रोटोकॉल में भविष्य के चरणों के लिए उपयोग किया जाएगा। इसे न छोड़ें।
    2. ऊतक पृथक्करण के लिए सामग्री और मीडिया तैयार करें।
      1. एपर्चर व्यास को कम करने के लिए एक पाश्चर पिपेट को लौएं और उपयोग तक संदूषण को रोकने के लिए इसे पन्नी में स्टोर करें। तैयार डीएमईएम, 1एक्स हैंक के बफर्ड साल्ट सॉल्यूशन (एचबीएसएस) और न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ चिमटी के साथ डीएनएस के 2 गुच्छे जोड़ें।
    3. ऊतक पृथक्करण करें।
      1. जितना संभव हो उतना हाइबरनेट मीडिया को हटा दें, विच्छेदित ई 18 चूहे हिप्पोकैम्पस को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखने से पहले जितना संभव हो उतना संग्रहीत किया जाता है, जिसमें डीएनएस होता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्षेप में इंजेक्ट किया जाता है। 1X HBSS के 900 μL जोड़ें और इसके बाद 0.5% ट्रिप्सिन के 100 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक को इनक्यूबेट करें।
        नोट: पीडीएल लेपित प्लेटों को भंडारण से हटाया जा सकता है और इस इनक्यूबेशन समय के दौरान उपयोग तक इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है।
    4. ऊतक समरूपीकरण और कोशिका गणना करें।
      1. ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेशन के बाद, मीडिया को हटा दें और ऊतक में पिछले चरण से 1 एमएल प्रीवार्म्ड हाइबरनेट मीडिया-डीएनएस जोड़ें और पाश्चर पिपेट के साथ समरूप करें। मीडिया अपारदर्शी दिखेगा और फिर धीरे-धीरे स्पष्ट हो जाएगा क्योंकि होमोजेनाइजेशन जारी है।
      2. 4 एमएल प्रीवार्म्ड डीएमईएम के साथ एक नई ट्यूब में विघटित न्यूरॉन्स जोड़ें और फिर सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    5. सेल चढ़ाना और प्राथमिक कोशिकाओं का विकास करें।
      1. डीएमईएम में लगभग 1.65 x 104 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं। 2-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास (4 सेमी 2) के लिए,2 एमएल डीएमईएम के साथ प्रति कुएं 65,000 - 70,000 कोशिकाओं का बीज। पालन की जांच करने से पहले 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एक बार जब कोशिकाएं पालन करना शुरू कर देती हैं, तो 1 एमएल मीडिया को हटा दें और इसे हाइबरनेट मीडिया की समान मात्रा के साथ बदलें, फिर धीरे से मिश्रण करने के लिए आंदोलन करें। एक बार जब मीडिया मिश्रित हो जाता है, तो इस प्रक्रिया को दोहराएं और मौजूद मीडिया के आधे हिस्से को हटा दें और न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया की समान मात्रा के साथ बदलें, फिर धीरे से मिश्रण करें।
        नोट: चढ़ाना का दिन इन विट्रो (DIV) 0 माना जाता है, और कोशिकाएं DIV 7 (चित्रा 2) पर छवि बनाने के लिए तैयार हैं।

3. लाइव सेल इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सेल प्रकार और उत्पत्ति (यानी, सुसंस्कृत और प्राथमिक कोशिकाएं) धुंधला आवश्यकताओं में भिन्न हो सकती हैं; अधिक जानकारी के लिए प्रकाशित रिपोर्टदेखें 62,63.

  1. पीकेमिटो ऑरेंज की तैयारी
    नोट: अन्य रंजक जो आम तौर पर आईएमएम को दाग देते हैं,उन्हें 64,65,66 रिपोर्ट किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पीकेएमओ इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला एकमात्र है।
    1. निर्माताके निर्देशों के अनुसार डीएमएसओ में पाउडर पीकेएमओ (सामग्री की तालिका देखें) को पुन: निलंबित करें। कोशिकाओं से मीडिया को अलग करें और पहले से गर्म फिनोल-लाल मुक्त मीडिया में धोएं। निर्माता के निर्देशों का पालन करने वाली कोशिकाओं को धुंधला करने से पहले प्रीवार्म, फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम में पीकेएमओ का स्टॉक तैयार करें, जो विभेदन स्थिति के आधार पर 2% (वी / वी) एफबीएस या 10% (वी / वी) के साथ पूरक हो, एचईपीईएस 20 एमएम की अंतिम एकाग्रता और 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक। यह सूत्रीकरण, पीकेएमओ के बिना, लाइव सेल इमेजिंग मीडिया है।
  2. पीकेएमओ के साथ सेल धुंधला होना।
    1. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर डाई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। लाइव सेल इमेजिंग मीडिया के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं, और अंतिम धोने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. ताजा, गर्म लाइव सेल इमेजिंग मीडिया जोड़ें। कोशिकाएं अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
      नोट: तीव्र उपचार (जैसे, ड्रग्स और / या तनाव), जब उपयोग किया जाता है, तो लाइव इमेजिंग से पहले जोड़ा जाता है; चर्चा अनुभाग और अनुपूरक चित्र 1 देखें।

4. एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव कोशिकाओं की इमेजिंग।

नोट: यह प्रोटोकॉल सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट प्रणाली के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चारों ओर निर्मित एक एसटीईडी सिस्टम का उपयोग करता है। यह प्रणाली स्पंदित उत्तेजना लेजर (नाममात्र शक्ति ~ 300 μW के साथ 561 एनएम लेजर) और एक स्पंदित 775 एनएम एसटीईडी रिक्तीकरण लेजर (नाममात्र शक्ति 1.2 डब्ल्यू), एक निरंतर समायोज्य गैल्वानो स्कैनर और 615/20 एनएम फिल्टर-आधारित हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टर (एपीडी) से लैस है। एसटीईडी के लिए 100x/1.40 तेल विसर्जन लेंस का उपयोग यहां किया जाता है। छवि अधिग्रहण के लिए लाइटबॉक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है। प्रदान किए गए सभी विवरण सीधे इस सॉफ्टवेयर और सिस्टम सेटअप से संबंधित हैं।

  1. इमेजिंग के लिए सामान्य दिशानिर्देश और कदम
    1. सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए एक स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर या पर्यावरण कक्ष का उपयोग करें, लेकिन अल्पकालिक कमरे के तापमान के प्रयोग भी स्वीकार्य हैं। ये चरण ऊपर वर्णित STED सेटअप के लिए विशिष्ट हैं।
    2. इमेजिंग के लिए लेजर और फ़िल्टर सेट का चयन करें।
      1. डाई सूची से धुंधला करने में उपयोग किए जाने वाले डाई (ओं) का चयन करके नारंगी डाई के लिए मापदंडों का उपयोग करें, या उपयोग किए गए डाई (ओं) के निकटतम वर्णक्रमीय गुणों वाले का चयन करें। इन्हें डबल-क्लिक करके या नमूना सूची में खींचकर सक्रिय बनाएं, जहां यह कहता है "डाई को यहां खींचें।
    3. छवि बनाने के लिए किसी क्षेत्र का चयन करें.
      1. एक अवलोकन में, आयताकार आरओआई बटन का चयन करके और क्षेत्र को आकार देने के लिए क्लिक करके और खींचकर रुचि के एक माइटोकॉन्ड्रियन के चारों ओर रुचि का एक क्षेत्र ( आरओआई ) बनाएं। आरओआई को आरओआई कोनों या घुमावदार किनारों का उपयोग करके आकार बदला और घुमाया जा सकता है जो एक कोने पर माउस को घुमाते समय दिखाई देते हैं ।
        नोट: सुझाए गए इमेजिंग मापदंडों का सारांश तालिका 1 में पाया जा सकता है। इन मापदंडों को इस एसटीईडी सेटअप और डाई संयोजन63 के लिए पहले रिपोर्ट किए गए लोगों का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से समायोजित किया गया था।
    4. गेटिंग सेट करें।
      1. सामान्य मेनू के बगल में, गेटिंग मेनू का चयन करें या मेनू को दृश्य में जोड़ने के लिए क्लिक करें और दबाए रखें। यह अनुशंसा की जाती है कि एसटीईडी डिटेक्टर गेटिंग को 1-1.05 से 7.8-7.85 एनएस तक समायोजित किया जाए, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है। गेटिंग समय अलग-अलग हो सकता है और 1-1.05 से 7-7.05 एनएस जितना छोटा हो सकता है।
    5. नमूने के अनुसार तीव्रता को उचित रूप से समायोजित करें।
      नोट: आम तौर पर, एसटीईडी के लिए उपयोग की जाने वाली उत्तेजना शक्ति कॉन्फोकल के लिए उपयोग की जाने वाली शक्ति का 2-3 गुना होती है, इसलिए कॉन्फोकल के लिए 5% उत्तेजना लेजर पावर की आवश्यकता वाला नमूना एसटीईडी अधिग्रहण के दौरान 10% -15% उत्तेजना लेजर पावर का उपयोग कर सकता है।
      1. एसटीईडी के लिए उत्तेजना लेजर को 15% -20% और एसटीईडी रिक्तीकरण लेजर को 10 लाइन संचय के साथ 20% -25% तक सेट करें। 20-25 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ 4 μs के पिक्सेल निवास समय का उपयोग करें। अधिक घनी आबादी वाले माइटोकॉन्ड्रिया में ऑप्टिकल सेक्शनिंग में सुधार के लिए पिनहोल को सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए 1.0 एयू और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल कोशिकाओं के लिए 0.7 एयू पर रखा गया था।
        नोट: कॉन्फोकल और एसटीईडी छवियों को साइड-बाय-साइड तुलना (चित्रा 3 ए, बी, चित्रा 4 ए) के लिए अधिग्रहित किया जा सकता है या केवल एसटीईडी प्राप्त किया जा सकता है।
  2. समय श्रृंखला/z-श्रृंखला के लिए अतिरिक्त जानकारी
    1. समय श्रृंखला का चयन करें.
      1. टाइम ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें। टाइमलैप्स के लिए वांछित पुनरावृत्तियों की संख्या (यहां उपयोग किए जाने वाले 5) और समय अंतराल (25 या 30 सेकंड यहां उपयोग किए जाते हैं) को परिभाषित करें (चित्रा 3 सी, डी, चित्रा 4 बी)।
        नोट: यदि अंतराल अधिग्रहण समय से कम है, तो पुनरावृत्तियां बिना किसी देरी के जारी रहेंगी। टाइमलैप्स करते समय, संभावित बहाव से बचने के लिए एक आदर्श फोकस यूनिट या इसी तरह के फोकस ट्रैकिंग को संलग्न करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
    2. वॉल्यूम श्रेणी सेट करें.
      1. वीओल्यूम विकल्प को सक्षम करके और रेंज के दो सिरों को समायोजित करके इच्छानुसार जेड-वॉल्यूम रेंज सेट करें। 2 डी इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले चरण आकार 150-200 एनएम थे। कच्चे एसटीईडी के डीकन्वोल्यूशन के लिए आवश्यक न्यक्विस्ट नमूनाकरण के संबंध में अनुशंसित चरण आकार की गणना ऑनलाइन टूल90 के साथ की जा सकती है।
        नोट: एसटीईडी रिक्तीकरण लेजर शक्ति और चित्रित विमानों की संख्या डाई फोटोब्लीचिंग और सेल के प्रकाश जोखिम को हानिकारक स्तर तक बढ़ा सकती है। अधिग्रहण के बाद फोटोटॉक्सिसिटी और फोटोडैमेज के संकेतों की जांच करें।

5. माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए प्रसंस्करण और विश्लेषणात्मक उपकरण

नोट: छवि प्रसंस्करण (यानी, डीकन्वोल्यूशन) वैकल्पिक है लेकिन आमतौर पर प्रकाशन के लिए एसटीईडी छवियों को बनाते और विश्लेषण करते समय उपयोग किया जाता है। कंट्रास्ट में सुधार और शोर को कम करने के लिए डीकॉन्वोल्यूशन को व्यक्तिगत क्रिस्टे के इष्टतम विभाजन के लिए अत्यधिक सुझाव दिया जाता है, जैसा कि नीचे वर्णित है (चित्रा 2)।

  1. एसटीईडी इमेज डिकन्वोल्यूशन
    नोट: इस प्रोटोकॉल में डीकन्वोल्यूशन के लिए उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है।
    1. छवि के सूक्ष्म पैरामीटर सेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप मेटाडेटा छवि माइक्रोस्कोपिक पैरामीटर में सही ढंग से दर्ज किया गया है। इसमें मध्यम अपवर्तक सूचकांक शामिल है; विसर्जन माध्यम; पिक्सेल का आकार; उत्तेजना, उत्सर्जन और कमी तरंग दैर्ध्य; और कोई अन्य प्रासंगिक जानकारी। इन मापदंडों वाले टेम्पलेट्स को पुन: उपयोग के लिए सहेजा जा सकता है.
    2. सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म के साथ डीकॉन्वोल्यूट कच्चे एसटीईडी छवियां।
      1. डीकन्वोल्यूशन सॉफ्टवेयर में स्वचालित डीकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम तक पहुंच से डीकन्वोल्यूशन इमेज प्रोसेसिंग को बंद करने की अनुमति मिलती है। एक्सप्रेस बटन का चयन करें और डीकन्वोल्यूशन पावर की अलग-अलग डिग्री के लिए डीकॉन्वोल्यूशन प्रकार को फास्ट, स्टैंडर्ड, एग्रेसिव या कंजर्वेटिव पर सेट करें। आक्रामक सेटिंग्स के साथ एक्सप्रेस डीकॉन्वोल्यूशन का उपयोग करने वाले प्रतिनिधि चित्र दिखाए गए हैं (चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5)।
      2. छवियों को ICS2 प्रारूप में डीकन्वोल्यूशन सॉफ्टवेयर से सहेजें।
    3. मैन्युअल डीकन्वोल्यूशन के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
      1. संक्षेप में, मैन्युअल डीकन्वोल्यूशन करते समय, डिकन्वोल्यूशन विज़ार्ड टेम्प्लेट को संगतता के लिए सहेजें और विज़ार्ड को प्रारंभ करने पर टेम्पलेट लोड करने का विकल्प रखें। अधिग्रहण सेटअप और पैरामीटर के साथ उत्पन्न होने पर मापा बिंदु प्रसार फ़ंक्शन (पीएसएफ) जानकारी का उपयोग करें।
      2. यदि आवश्यक हो, तो डीकन्वोल्यूशन सॉफ्टवेयर को छवि को ऑटो-स्थिर करने से पहले कच्चे एसटीईडी छवि को क्रॉप करें। डीकन्वोल्यूशन सॉफ्टवेयर पैकेज ों में ऐड-ऑन थर्मल बहाव और क्रोमैटिक विपथन जैसे संभावित इमेजिंग कलाकृतियों के विशिष्ट मुआवजे की अनुमति देते हैं।
      3. इसके बाद, मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि घटाव करने के लिए एक लघुगणकीय हिस्टोग्राम उत्पन्न करें। क्लासिक अधिकतम संभावना अनुमान (CMLE) डीकन्वोल्यूशन एल्गोरिथ्म का चयन करें।
        नोट: डीकन्वोल्यूशन के लिए, समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण मान सिग्नल-टू-शोर अनुपात सीमा, पुनरावृत्तियों की संख्या और गुणवत्ता सीमा हैं। इन मूल्यों को समायोजित किया जा सकता है, और इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए डीकन्वोल्यूशन का पूर्वावलोकन किया जा सकता है।
  2. विभाजन और कण विश्लेषण
    नोट: यह प्रोटोकॉल फिजी (Is Just ImageJ), एक ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है (देखें सामग्री की तालिका), विभाजन और विश्लेषण के लिए। सेलप्रोफाइलर, बर्फीले, इलास्टिक और क्यूपाथ सहित अन्य तुलनीय सॉफ्टवेयर, इन उद्देश्यों के लिए उपलब्ध हैं।
    1. विभाजन के लिए चित्र तैयार करें।
      1. फ़ाइल → ओपन पर जाकर या ImageJ टूलबार पर फ़ाइलों को क्लिक करके और खींचकर डीकन्वोल्यूशन सॉफ़्टवेयर से .obf raw STED छवियों या .ics2 फ़ाइलों को खोलें। यहां से, कोई भी प्रसंस्करण जो छवियों को सेगमेंट करना आसान बनाता है, विभाजन से पहले किया जा सकता है।
      2. परिवर्तनों को सुसंगत रखने के लिए, प्लगइन्स → मैक्रोज़ का उपयोग करके फ़ंक्शन रिकॉर्ड करें → प्लगइन्स से न्यू → मैक्रो तक एक नए मैक्रो में कुंजी आदेशों → कॉपी और पेस्ट करें। मैक्रो चलाने से पहले प्रक्रिया करने के लिए छवि का चयन करना सुनिश्चित करें।
        नोट: आकार और आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए आमतौर पर स्वीकार्य परिवर्तनों में फसल शामिल हैं, जेड-स्टैक प्रोजेक्ट करना, और चिकनी अक्षम के साथ पृष्ठभूमि घटाव। परिवर्तन एक डेटा सेट के भीतर छवियों के बीच लगातार किया जाना चाहिए और रिपोर्ट किया जाना चाहिए।
    2. ट्रेन करने योग्य वेका विभाजन सेटिंग्स समायोजित करें
      नोट: माइटोकॉन्ड्रिया के लिए अर्ध-स्वचालित विभाजन उपकरण और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण का उपयोग करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देशों के साथ अतिरिक्तविवरण प्रकाशित किए गए हैं।
      1. ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन के प्लगइन्स → सेगमेंटेशन → ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन के तहत स्थित ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन (टीडब्ल्यूएस) 92 प्लगइन में डिकॉन्वोल्ड एसटीईडी छवियों को खोलें। विभाजन सेटिंग्स में, गॉसियन ब्लर, झिल्ली अनुमान और सोबेल फ़िल्टर सुविधाओं का चयन करें। झिल्ली मोटाई डिफ़ॉल्ट 1 है, और झिल्ली पैच आकार डिफ़ॉल्ट 19 है।
      2. कक्षा 1 या 2 को "क्रिस्टा" और दूसरे को "पृष्ठभूमि" के रूप में लेबल करें (चित्रा 2)। मॉडल को सेव क्लासिफायर बटन के साथ भी सहेजा जा सकता है। अन्य छवियों के लिए इन सेटिंग्स का पुन: उपयोग करने के लिए लोड क्लासिफायर का चयन करें।
    3. TWS वर्ग के निशान निष्पादित करें।
      1. कुछ क्रिस्टे या पृष्ठभूमि को हाइलाइट करने के लिए लाइन टूल या अन्य आकृतियों का उपयोग करें। कम से कम कुछ पृष्ठभूमि चयनों में क्रिस्टे के बीच रिक्त स्थान शामिल होना चाहिए। किसी भी वर्ग को असाइन करने के लिए संरचना पर एक रेखा खींचें, फिर क्रिस्टे या पृष्ठभूमि के लिए दाईं ओर जोड़ें बटन का चयन करें। उस लेबल से संरचना को हटाने के लिए ट्रेस पर डबल-क्लिक करें।
    4. TWS वर्गीकरण प्रशिक्षण करें।
      1. प्लगइन को प्रदान की गई जानकारी के आधार पर मानचित्र उत्पन्न करने के लिए बाईं ओर ट्रेन क्लासिफायर बटन का चयन करें। खंडित कक्षाओं के ओवरले को टॉगल ओवरले बटन के साथ चालू और बंद किया जा सकता है, और ओवरले की अस्पष्टता को सेटिंग्स में समायोजित किया जा सकता है। क्लासिफायर को अतिरिक्त लेबल के साथ पुन: प्रशिक्षित किया जा सकता है। एक बार संतुष्ट होने के बाद, संभाव्यता प्राप्त करें बटन का चयन करें।
    5. कणों को मापें।
      1. क्रिस्टे संभाव्यता मानचित्र का उपयोग करके, एक मुखौटा उत्पन्न करने के लिए छवि को दहलीज करें और फिर कणों का विश्लेषण → विश्लेषण करने पर जाएं। आम तौर पर, डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड प्रकार का उपयोग किया जा सकता है और पूरे क्रिस्टे का हिसाब सुनिश्चित करने के लिए सीमा को समायोजित किया जा सकता है। कणों का विश्लेषण करके प्रदान किए गए माप को विश्लेषण → सेट माप द्वारा समायोजित किया जा सकता है।
        नोट: आकार और आकार मापदंडों के उदाहरण जैसे क्षेत्र, परिधि, परिपत्रता और क्रिस्टे के पहलू अनुपात को चयनित मापों के आधार पर मापा और प्रदर्शित किया जाता है (चित्रा 2, चित्रा 5 ए, पूरक तालिका 1)।
      2. वैकल्पिक: डिकोनवोलाइज्ड छवि के समान आयामों के साथ कच्ची एसटीईडी छवि का चयन करें और प्रबंधक से आरओआई लागू करें, फिर तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए आरओआई प्रबंधक में माप का चयन करें।
    6. लाइन प्लॉट प्राप्त करें।
      1. डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवियों से लाइन प्लॉट उत्पन्न किए गए थे। एक बहु-बिंदु रेखा खींचें, शोर को औसत करने के लिए लाइन मोटाई को कई पिक्सेल चौड़ा समायोजित करें, और माइटोकॉन्ड्रिया को फिट करने के लिए लाइन को स्लाइन करें (चित्रा 2, चित्रा 5 बी)। परिणामी लाइन प्लॉट का उपयोग एक निश्चित सीमा पर क्रिस्टे की आवधिकता और वितरण की रिपोर्ट करने के लिए पीक-टू-पीक दूरी को मापने के लिए किया जाता है।
        नोट: संबंधित रूप से, क्रिस्टे घनत्व को माइटोकॉन्ड्रिया के बाहरी हिस्से को मापकर निर्धारित किसी दिए गए क्षेत्र के भीतर स्वतंत्र क्रिस्टे की गिनती के रूप में रिपोर्ट किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र को मास्क उत्पन्न करने के लिए डिकोनवोलाइज्ड या कच्चे एसटीईडी छवि पर एक फिल्टर लागू करके निर्धारित किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि मास्क क्षेत्र को मापने से पहले माइटोकॉन्ड्रिया की रूपरेखा को सटीक रूप से फिट करता है।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग और माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे के बाद के विश्लेषण पर ध्यान देने के साथ सुसंस्कृत और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए सेल विकास की स्थिति का वर्णन करता है। अविभाजित SH-SY5Y (चित्रा 3A) और RA-विभेदित SH-SY5Y (चित्रा 3B) कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया की छवि J के साथ किए गए अनुमानों को पारंपरिक कॉन्फोकल और एसटीईडी के साथ जेड-स्टैक के रूप में एकत्र किया जा सकता है, और कच्चे एसटीईडी छवियों को तब डिकोनवोलकिया जा सकता है। टाइमलैप्स इमेजिंग भी की जा सकती है और बाद में डिकोनवोल्ड (चित्रा 3 सी, डी)। प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स (तालिका 1) के लिए थोड़ा अलग इमेजिंग मापदंडों का उपयोग करके, कॉन्फोकल और कच्चे एसटीईडी छवियों को जेड-स्टैक के रूप में प्राप्त किया जा सकता है, और कच्चे एसटीईडी छवियों को डिकोनवोलाइज्ड किया जा सकता है (चित्रा 4 ए)। प्राथमिक न्यूरॉन्स से माइटोकॉन्ड्रिया की टाइमलैप्स इमेजिंग भी संभव है (चित्रा 4 बी)। सामान्य तौर पर, टाइम-लैप्स छवियों को माइटोकॉन्ड्रियल गतिशील घटनाओं को दिखाने में सक्षम होना चाहिए।

जब विभाजन के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों से कच्चे एसटीईडी और डिकोनवोल्ड एसटीईडी जेड-स्टैक अनुमान सुसंगत दिखाई देते हैं, तो मात्रात्मक माप किए जाते हैं। टीडब्ल्यूएस प्लगइन एक संभाव्यता मास्क बनाने के लिए सेगमेंट करने के लिए डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवि का उपयोग करता है, जिसका उपयोग आकार और आकार पैरामीटर (चित्रा 5 ए) प्राप्त करने के लिए क्रिस्टे का बाइनरी मास्क बनाने के लिए किया जाता है। इस मास्क के क्षेत्रों को आरओआई प्रबंधक में सहेजा जाता है और सापेक्ष तीव्रता में अंतर को मापने के लिए वांछित होने पर कच्चे एसटीईडी छवि पर लागू किया जा सकता है। किसी दिए गए क्षेत्र में क्रिस्टी आवधिकता और घनत्व को निर्धारित करने के लिए डिकोनवोल्ड एसटीईडी अनुमानों का भी उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 5 बी)।

Figure 1
चित्र 1: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान। माइटोकॉन्ड्रिया में एक दो-झिल्ली प्रणाली होती है जो विभिन्न उप-डिब्बों (ए) को परिभाषित करती है। क्रिस्टे परिभाषित विशेषताओं (बी) के साथ आंतरिक झिल्ली के इनफोल्ड हैं। संक्षेप: ओएमएम, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली; आईसीएस, इंट्राक्रिस्टल स्पेस; आईएमएस, इंटरमेम्ब्रेन स्पेस; सीएम, क्रिस्टे झिल्ली; आईबीएम, आंतरिक सीमा झिल्ली; आईएमएम, आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली; सीटी, क्रिस्टे टिप; सीजे, क्रिस्टे जंक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाएं या प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स पीडीएल-लेपित कवरग्लास पर उगाए जाते हैं। एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को छह दिनों के दौरान उदासीन रहने या आरए भेदभाव के अधीन रहने के लिए समानांतर में उगाया जाता है। सात दिनों तक हिप्पोकैम्पल वर्गों से अलग होने के बाद प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को पीडीएल-लेपित कवरग्लास पर उगाया गया था। एक बार छवि बनाने के लिए तैयार होने के बाद, कोशिकाओं को पीकेएमओ के साथ दाग दिया गया और एसटीईडी के साथ चित्रित किया गया। कच्चे एसटीईडी छवियों को तब डिकोनवोल्ड किया जाता है, और आकार और आकार माप प्राप्त करने के लिए फिजी में डिकोनवोल्ड छवियों को संसाधित किया जाता है, जैसे कि क्रिस्टे घनत्व, क्षेत्र, परिधि, परिपत्रता और पहलू अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग। पीकेएमओ धुंधला होने के साथ गैर-विभेदित (ए) और आरए-विभेदित (बी) एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिनिधि कॉन्फोकल (बाएं), कच्चे एसटीईडी (केंद्र), और ह्यूजेंस डिकोनवोलाइज्ड एसटीईडी छवि जेड-स्टैक अनुमान (दाएं) दिखाए गए हैं। आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं के 30 सेकंड अंतराल और 5 पुनरावृत्तियों के साथ एक टाइमलैप्स दिखाया गया है (सी) चयनित क्षेत्रों (सफेद बक्से) के साथ प्रक्षेप के बिना उन क्षेत्रों की स्केल की गई छवियों का उपयोग करके (डी) पर विस्तारित किया गया है। स्केल बार: ए, बी, 250 एनएम; C, D, 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग। प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स से माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिनिधि कॉन्फोकल (बाएं), कच्चे एसटीईडी (केंद्र), और ह्यूजेंस डिकोनवोल्ड एसटीईडी (दाएं) छवि जेड-स्टैक अनुमान दिखाए गए हैं (ए)। इन न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया के 25 एस अंतराल और 5 पुनरावृत्तियों के साथ एक टाइमलैप्स दिखाया गया है (बी)। स्केल बार: ए, 250 एनएम; B, 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इमेजजे में डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवियों का प्रसंस्करण। क्रिस्टे आकार और आकार को मापने के लिए ट्रेनेबल वेका विभाजन प्लगइन का प्रतिनिधि उपयोग दिखाया गया है (ए)। बाएं से दाएं, निम्नलिखित छवियां दिखाई जाती हैं: डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवि, टीडब्ल्यूएस प्लगइन से विभाजन के आधार पर संभाव्यता मानचित्र, इनपुट के रूप में संभाव्यता मानचित्र का उपयोग करके फिजी में थ्रेशोल्डिंग से मुखौटा, आरओआई के साथ मुखौटा, और आरओआई मूल डिकोनवोलाइज्ड एसटीईडी छवि पर ओवरले। परिणामी क्षेत्रफल, परिधि, परिपत्रता और इन वस्तुओं के अनुरूप पहलू अनुपात माप पूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है। क्रिस्टे घनत्व के लिए रीडआउट के रूप में पीक-टू-पीक दूरी को मापने के लिए डिकोनवोलाइज्ड एसटीईडी छवि का उपयोग करके एक लाइन प्लॉट दिखाया गया है (बी)। स्केल सलाखों: 0.5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पिक्सेल आकार (nm) समय (μs) लाइन एसीसी। एसटीईडी अधिग्रहण के दौरान 561 एनएम उत्तेजना (%) 775 एनएम एसटीईडी रिक्तीकरण शक्ति (%) चरण का आकार (nm) पिनहोल (एयू) टाइमलैप्स अंतराल (ओं) टाइमलैप्स पुनरावृत्तियां
अलग-अलग SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5
आरए-डिफरे-एनटिएटेड एसएच-एसवाई 5 वाई 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5
प्राथमिक न्यूरॉन्स 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5
नोट: पिक्सेल का आकार इमेजिंग आवश्यकताओं और छवियों को अलग करने के इरादे के आधार पर भिन्न हो सकता है। डीकन्वोल्यूशन के लिए उचित नमूने की आवश्यकता होती है। डीकन्वोल्यूशन के बिना कच्चे एसटीईडी छवियों के लिए पिक्सेल आकार 30 एनएम तक जा सकता है।

तालिका 1: एसटीईडी अधिग्रहण मापदंडों का सारांश। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए 2 डी एसटीईडी इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स, उदासीन एसएच-एसवाई 5 वाई, आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई, और प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स, प्रदर्शित होते हैं। सभी समय-अंतराल के लिए, आरओआई आकार के आधार पर अलग-अलग अंतराल के साथ 5 पुनरावृत्तियों को लिया गया था।

पूरक चित्र 1: एमिलॉयड-β (ए) जोड़ के साथ एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं की इमेजिंग। पीकेएमओ स्टेन (ऊपर) और ए-हाइलाइट 647 (नीचे) के साथ आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल (बाएं), कच्चे एसटीईडी (केंद्र), और डिकोनवोल्ड एसटीईडी (दाएं) छवियां दिखाई गई हैं। कच्चे पीकेएमओ एसटीईडी (हरे) के विलय किए गए जेड-स्टैक अनुमानों को कच्चे एएएसटीईडी (मैजेंटा) (बी) या डीकोनवोलाइज्ड पीकेएमओ एसटीईडी (हरे) के साथ डीकोनवोलाइज्ड ए: एसटीईडी (मैजेंटा) (सी) के साथ दिखाया गया है। स्केल सलाखों: 0.5 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: खंडित क्रिस्टे का आकार और आकार माप। खंडित माइटोकॉन्ड्रिया से चित्रा 5 ए में उल्लिखित वस्तुओं के अनुरूप क्षेत्र (μm2), परिधि (μm), परिपत्रता और पहलू अनुपात के आकार और आकार माप दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: अमाइलॉइड-β नमूने के साथ अधिग्रहण मापदंडों का सारांश। अविभाजित और आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में पीकेएमओ और ए-हाइलाइट 647 के 2 डी एसटीईडी इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स प्रदर्शित की जाती हैं। A-HiLyte647 के कॉन्फोकल का उपयोग अकेले किया जा सकता है क्योंकि हल करने के लिए कोई विशिष्ट संरचना नहीं है; छोटे कण आकार ों के लिए A-HiLyte647 की STED छवियां यहां दिखाई गई हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: अमाइलॉइड-β उपचार प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग के लिए नए आईएमएम-टारगेटिंग पीकेएमओ डाई के साथ मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन एसएच-एसवाई 5 वाई और प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के उपयोग को प्रस्तुत करता है। पीकेएमओ की नवीनता के कारण, वर्तमान में लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए इस डाई का उपयोग करके बहुत कम प्रकाशित किया गया है। एसटीईडी इमेजिंग के लिए इन सेल प्रकारों का उपयोग करना चुनौतियां पैदा करता है, विशेष रूप से क्योंकि न्यूरोनल कोशिकाओं में संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा पीकेएमओ डाई का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। विभिन्न कोशिकाएं और सेल लाइनें डाई के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देती हैं, इस प्रकार, डाई एकाग्रता में समायोजन और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना मजबूत संकेत के लिए परिणामों को अनुकूलित करने के लिए इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है। एक सुझाया गया समाधान एकाग्रता को कम करना और धुंधला समय63 को बढ़ाना है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता में वृद्धि के बिना खराब धुंधलापन हो सकता है।

पीकेएमओ के समान, वाणिज्यिक डाई लाइव ऑरेंज माइटो (सामग्री की तालिका) भी कुछ सेल विषाक्तता प्रदर्शित करता है। इस डाई का उपयोग विभिन्न प्रकार की सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए किया गया था, लेकिन आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में उनके अविभाजित समकक्षों (हमारे अप्रकाशित अवलोकनों) के समान मापदंडों के साथ सफलतापूर्वक तुलनीय धुंधलापन प्रदर्शित करने में असमर्थ था। हालांकि, इस जांच और चुने हुए सेल प्रकारों के लिए उत्तरदायी धुंधला प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है। इस डाई के साथ, 1-1.05 से 7-7.05 एनएस के डिटेक्टर गेटिंग समय का उपयोग किया गया था, जिसमें तालिका 1 में अन्य सभी पैरामीटर समान थे। आम तौर पर, 45 मिनट के लिए 200-250 एनएम लाइव ऑरेंज माइटो के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने से पीकेएमओ परिणामों के समान परिणाम मिले। कम समय के लिए उच्च सांद्रता धुंधला होना या समान समय या थोड़े लंबे समय तक कम एकाग्रता धुंधला होना अलग-अलग परिणाम दे सकता है और अन्य सेल प्रकारों या विकास स्थितियों के अनुकूल हो सकता है।

इमेजिंग के समय अक्षतंतु और डेंड्राइट अनुमानों की प्रकृति के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के कारण इमेजिंग प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स अमर कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक कठिनाई यह है कि सीडिंग घनत्व यह निर्धारित करता है कि क्या प्राथमिक संस्कृतियां स्वस्थ रूप से पालन करने और बढ़ने में सक्षम होंगी, और उच्च घनत्व पर, अनुमान डीआईवी 10 से अधिक हो जाते हैं। इसलिए, इन प्राथमिक न्यूरॉन्स से चित्रित माइटोकॉन्ड्रिया संभवतः कोशिका शरीर से आएंगे और अनुमानों से नहीं; हालांकि, कम शुरुआती सेल घनत्व से सफल विकास बाद के विकास समय में बेहतर इमेजिंग परिणाम देता है। एसटीईडी के लिए सबसे अच्छा कंट्रास्ट होने के लिए कम पृष्ठभूमि और आउट-ऑफ-फोकस लाइट सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। सेल आबादी के बारे में चिंताओं को दूर करने के लिए, बी 27-पूरक न्यूरॉन विकास मीडिया में प्राथमिक हिप्पोकैम्पल कोशिकाओं का संवर्धन ग्लियल कोशिकाओं के विकास को रोकता है, और स्रोत की रिपोर्ट है कि <5% कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स हैं और विकास मीडिया में एनबीएक्टिव 1 पूरक की अनुपस्थिति संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स की संख्या <2% 87 तक कम हो जाती है। सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स दोनों के लिए, विकास के लिए उपयोग की जाने वाली पीडीएल कोटिंग छवियों में पृष्ठभूमि धुंध में योगदान देती है। (तालिका 1) में रिपोर्ट की गई सेटिंग्स के साथ पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर पूरा किया जाता है और डीकन्वोल्यूशन देखी गई अधिकांश पृष्ठभूमि को हटा देता है।

यहां कवर की गई इमेजिंग के अलावा, इमेजिंग से पहले या दौरान कोशिकाओं में उपचार या तनाव जोड़ना भी संभव है। उदाहरण के लिए, टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोजन पेरोक्साइड (टीबीएचपी) जोड़ना ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है, और इसके बाद समय के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तन की निगरानी करना संभव है। फ्लोरोसेंट टैग के साथ एमिलॉयड-β (ए) के अलावा माइटोकॉन्ड्रिया के साथ-साथ समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल संरचना के संबंध में इस पेप्टाइड के वितरण की निगरानी की अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को एडी में भारी फंसाया गया है और व्यापक रूप से ए विषाक्तता 43,71,72 में भूमिका निभाने के लिए समर्थित है। विशेष रूप से, SH-SY5Y कोशिकाओं की विभेदन स्थिति A3 प्रोटीन अग्रदूत (A3PP) स्थानीयकरण85 को प्रभावित करती है, और A3PP का उपयोग करने वाले प्रयोगों का सावधानीपूर्वक निर्माण किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल को कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, इसके एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि फ्लोरोसेंट संस्करण ए (1-42) -हाइलाइट 647 को इमेजिंग से 15 मिनट पहले पीकेएमओ-दाग वाली कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है (पूरक चित्रा 1)। इमेजिंग पैरामीटर समान हैं (पूरक तालिका 2), मुख्य अंतर यह है कि संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग करते समय एक छोटे पिनहोल की आवश्यकता होती है। एसटीईडी के साथ इमेजिंग ए-हाइलाइट 647 को कम समग्र उत्तेजना (6% -8%) और एसटीईडी की कमी (10% -12%) लेजर शक्ति और कम संचय (छह) की आवश्यकता होती है। डिटेक्टर गेटिंग को भी 0.1 से 10 एनएस तक बढ़ाया जाता है। यद्यपि ए का एसटीईडी रिज़ॉल्यूशन आवश्यक नहीं है, कच्चे एसटीईडी का समग्र सिग्नल-टू-शोर अनुपात और ए कण आकार कॉन्फोकल छवियों की तुलना में बेहतर था, और बाद में डीकॉन्वोल्यूशन भी किया जा सकता है। एसटीईडी छवियों को एकत्र करना और एके कच्चे एसटीईडी जेड-स्टैक अनुमानों को अलग करना विशेष रूप से उपयोगी प्रतीत होता है जब पीकेएमओ दाग (पूरक चित्रा 1 बी, सी) के कच्चे एसटीईडी या डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवियों के साथ विलय किया जाता है। दोनों चैनलों को एक ही फ्रेम चरण में एकत्र किया गया था। समय-निर्भर स्थानीयकरण के माप, चित्र 2 में सूचीबद्ध और चित्रा 5 में दिखाए गए लोगों के समान, जहां लागू होते हैं, और क्रिस्टे आर्किटेक्चर अंतर तनाव उपचार या अन्य परिवर्धन के बाद प्राप्त किए जा सकते हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव सेल एसटीईडी में दोहरी-लेबलिंग के लिए अन्य संभावित तरीकों की रिपोर्ट यहां नहीं की गई है, लेकिन दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई है जिसमें एसएनएपी-टैग किए गए प्रोटीन93, हेलो-टैग ्ड प्रोटीन का उपयोग और सामान्य लक्ष्यों के साथ अन्य सेल-पारगम्य रंगों का उपयोग शामिल है, जैसे कि एमटीडीएनए63। विशेष रूप से, एसएनएपी और हेलो टैगिंग की लेबलिंग रणनीति इमेजिंग94 के दौरान परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता और दीर्घायु को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल विश्लेषण के कई उदाहरण प्रस्तुत करता है जिन्हें खंडित माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू किया जा सकता है, ऐसे कई अन्य विश्लेषण हैं जो सॉफ्टवेयर पैकेज इन छवियों पर कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की आपूर्ति कनेक्टिकट विश्वविद्यालय (स्टॉर्स, सीटी, यूएसए) में बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग के डॉ जॉर्ज लाइकोट्राफिटिस और शिजू गु द्वारा की गई थी। सेंटर फॉर ओपन रिसर्च रिसोर्सेज एंड इक्विपमेंट में एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा में स्थित एब्बेरियर एसटीईडी उपकरण को एनआईएच अनुदान S10OD023618 क्रिस्टोफर ओ'कॉनेल को सम्मानित करने के साथ अधिग्रहित किया गया था। इस शोध को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था R01AG065879 नाथन एन एल्डर को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in -- -- Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) -- The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus -- This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior -- Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior -- STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available

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References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

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Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).

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