Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Användning av STED-avbildning av levande celler för att visualisera mitokondriell inre membranultrastruktur i neuronala cellmodeller

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65561
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

Summary

Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för förökning, differentiering och färgning av odlade SH-SY5Y-celler och primära hippocampusneuroner från råttor för visualisering och analys av mitokondriell ultrastruktur med hjälp av stimulated emission depletion (STED) mikroskopi.

Abstract

Mitokondrier spelar många viktiga roller i cellen, inklusive energiproduktion, reglering av Ca2+ homeostas, lipidbiosyntes och produktion av reaktiva syrearter (ROS). Dessa mitokondrimedierade processer tar på sig specialiserade roller i neuroner, samordnar aerob metabolism för att möta de höga energikraven hos dessa celler, modulerar Ca2+ -signalering, tillhandahåller lipider för axontillväxt och regenerering och justerar ROS-produktionen för neuronal utveckling och funktion. Mitokondriell dysfunktion är därför en central drivkraft vid neurodegenerativa sjukdomar. Mitokondriernas struktur och funktion är oupplösligt sammankopplade. Det morfologiskt komplexa inre membranet med strukturella veck som kallas cristae hyser många molekylära system som utför mitokondriens signaturprocesser. De arkitektoniska egenskaperna hos det inre membranet är ultrastrukturella och därför för små för att visualiseras med traditionell diffraktionsbegränsad upplöst mikroskopi. Således har de flesta insikterna om mitokondriell ultrastruktur kommit från elektronmikroskopi på fasta prover. Men ny teknik inom superupplöst fluorescensmikroskopi ger nu upplösning ner till tiotals nanometer, vilket möjliggör visualisering av ultrastrukturella egenskaper i levande celler. Superupplöst avbildning erbjuder därför en oöverträffad förmåga att direkt avbilda fina detaljer i mitokondriell struktur, proteindistributioner i nanoskala och cristae-dynamik, vilket ger grundläggande nya insikter som kopplar mitokondrier till människors hälsa och sjukdom. Detta protokoll presenterar användningen av stimulated emission depletion (STED) superupplösningsmikroskopi för att visualisera den mitokondriella ultrastrukturen hos levande humana neuroblastomceller och primära råttneuroner. Denna procedur är organiserad i fem sektioner: (1) tillväxt och differentiering av SH-SY5Y-cellinjen, (2) isolering, plätering och tillväxt av primära hippocampusneuroner hos råtta, (3) procedurer för färgning av celler för levande STED-avbildning, (4) procedurer för STED-experiment med levande celler som referens, och (5) vägledning för segmentering och bildbehandling med hjälp av exempel för att mäta och kvantifiera morfologiska egenskaper hos det inre membranet.

Introduction

Mitokondrier är eukaryota organeller av endosymbiotiskt ursprung som är ansvariga för att reglera flera viktiga cellulära processer, inklusive intermediär metabolism och ATP-produktion, jonhomeostas, lipidbiosyntes och programmerad celldöd (apoptos). Dessa organeller är topologiskt komplexa och innehåller ett dubbelt membransystem som upprättar flera underavdelningar1 (figur 1A). Det yttre mitokondriemembranet (OMM) samverkar med cytosolen och upprättar direkta kontakter mellan organeller 2,3. Det inre mitokondriella membranet (IMM) är ett energibesparande membran som upprätthåller jongradienter lagrade främst som en elektrisk membranpotential (ΔΨm) för att driva ATP-syntes och andra energikrävande processer 4,5. IMM är vidare uppdelad i det inre gränsmembranet (IBM), som är nära sammanpressat med OMM, och utskjutande strukturer som kallas cristae som är bundna av cristae-membranet (CM). Detta membran avgränsar det innersta matrisfacket från det intrakristalla utrymmet (ICS) och det intermembrana utrymmet (IMS).

Mitokondrier har en dynamisk morfologi baserad på kontinuerliga och balanserade processer av fission och fusion som styrs av mekanoenzymer i dynaminsuperfamiljen6. Fusion möjliggör ökad konnektivitet och bildning av retikulära nätverk, medan fission leder till mitokondriell fragmentering och möjliggör avlägsnande av skadade mitokondrier med mitofagi7. Mitokondriernas morfologi varierar beroende på vävnadstyp8 och utvecklingsstadium9 och regleras för att göra det möjligt för celler att anpassa sig till faktorer som energibehov 10,11 och stressorer 12. Standardmorfometriska egenskaper hos mitokondrier, såsom omfattningen av nätverksbildning (sammankopplad kontra fragmenterad), omkrets, area, volym, längd (bildförhållande), rundhet och förgreningsgrad, kan mätas och kvantifieras med standard optisk mikroskopi eftersom storleken på dessa egenskaper är större än diffraktionsgränsen för ljus (~200 nm)13.

Cristae-arkitekturen definierar mitokondriernas inre struktur (figur 1B). Mångfalden av cristae-morfologier kan i stort sett kategoriseras som platt (lamellär eller diskoidal) eller tubulär-vesikulär14. Alla cristae fäster vid IBM genom rörformiga eller slitsliknande strukturer som kallas cristae junctions (CJ) som kan tjäna till att dela upp IMS från ICS och IBM från CM15. Cristae-morfologi regleras av nyckelproteinkomplex i IMM, inklusive (1) mitokondriekontaktstället och cristae-organiseringssystemet (MICOS) som finns vid CJ och stabiliserar IMM-OMM-kontakter 16, (2) den optiska atrofi 1 (OPA1) GTPas som reglerar cristae-remodellering17,18,19, och (3) F1FOo ATP-syntas som bildar stabiliserande oligomera sammansättningar vid cristae-spetsar (CTs)20, 21. veckor Dessutom är IMM berikad med fosfolipiderna fosfatidyletanolamin och kardiolipin som stabiliserar den starkt krökta IMM22. Cristae är också dynamiska och visar morfologiska förändringar under olika förhållanden, såsom olika metaboliska tillstånd 23,24, med olika andningssubstrat 25, under svält och oxidativ stress 26,27, med apoptos 28,29 och med åldrande 30. Nyligen har det visat sig att Cristae kan genomgå stora ombyggnadshändelser på en tidsskala av sekunder, vilket understryker deras dynamiska natur31. Flera egenskaper hos cristae kan kvantifieras, inklusive dimensioner av strukturer inom enskilda cristae (t.ex. CJ-bredd, cristalängd och bredd) och parametrar som relaterar individuella crista till andra strukturer (t.ex. intra-cristae-avstånd och cristae-infallsvinkel i förhållande till OMM)32. Dessa kvantifierbara cristae-parametrar visar en direkt korrelation med funktion. Till exempel är omfattningen av mitokondriell ATP-produktion positivt relaterad till överflödet av cristae, kvantifierat som cristae-densitet eller cristae-antal normaliserat till en annan egenskap (t.ex. cristae per OMM-område)33,34,35. Eftersom IMM-morfologi definieras av egenskaper i nanoskala omfattar den mitokondriell ultrastruktur, vilket kräver avbildningstekniker som ger en upplösning som är större än ljusdiffraktionsgränsen. Som beskrivs nedan inkluderar sådana tekniker elektronmikroskopi och superupplösningsmikroskopi (nanoskopi).

Nerv- och gliacellerna i centrala nervsystemet (CNS) är särskilt beroende av mitokondriell funktion. I genomsnitt utgör hjärnan endast 2 % av den totala kroppsvikten, men använder 25 % av den totala kroppsglukosen och står för 20 % av kroppens syreförbrukning, vilket gör den sårbar för försämringar i energimetabolismen36. Progressiva neurodegenerativa sjukdomar (ND), inklusive Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateralskleros (ALS), Huntingtons sjukdom (HD), multipel skleros (MS) och Parkinsons sjukdom (PD), är några av de mest studerade patologierna hittills, med forskningsinsatser som sträcker sig från att förstå de molekylära grunderna för dessa sjukdomar till att söka potentiella terapeutiska förebyggande åtgärder och interventioner. ND är förknippade med ökad oxidativ stress som delvis härrör från reaktiva syrearter (ROS) som genereras av mitokondriernas elektrontransportkedja (ETC)37, samt förändrad mitokondriell kalciumhantering 38 och mitokondriell lipidmetabolism39. Dessa fysiologiska förändringar åtföljs av noterade defekter i mitokondriell morfologi som är associerade med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS 50 och PD 51,52,53. Dessa strukturella och funktionella defekter kan kopplas samman med komplexa orsakssamband. Till exempel, med tanke på att cristae-morfologi stabiliserar OXPHOS-enzymer54, genereras mitokondriella ROS inte bara av ETC, utan de verkar också för att skada infrastrukturen där ETC finns, vilket främjar en feed-forward ROS-cykel som ökar känsligheten för oxidativ skada. Dessutom har kristae-desorganisation visat sig utlösa processer som frisättning av mitokondriellt DNA (mtDNA) och inflammatoriska vägar kopplade till autoimmuna, metaboliska och åldersrelaterade sjukdomar55. Därför är analys av mitokondriell struktur nyckeln till en fullständig förståelse av ND och deras molekylära underbyggnad.

Populära metoder för att se cristae, inklusive transmissionselektronmikroskopi, elektrontomografi och kryoelektrontomografi (kryo-ET), och röntgentomografi, i synnerhet kryo-mjuk röntgentomografi, har avslöjat viktiga fynd och arbete med en mängd olika provtyper 56,57,58,59,60. Trots de senaste framstegen mot bättre observation av organellär ultrastruktur, kommer dessa metoder fortfarande med förbehållet att kräva provfixering och kan därför inte fånga realtidsdynamiken hos cristae direkt. Superupplöst fluorescensmikroskopi, särskilt i form av strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), expansionsmikroskopi (ExM) och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi, har blivit populära sätt att se strukturer som kräver upplösning under diffraktionsgränsen som begränsar klassiska metoder för optisk mikroskopi. När ExM används tillsammans med en annan superupplösningsteknik är resultaten imponerande, men provet måste fixeras och färgas i en gel61. Som jämförelse har SIM, PALM/STORM och STED alla framgångsrikt använts med levande prover, och nya och lovande färgämnen som i allmänhet färgar IMM ger ett nytt och enkelt tillvägagångssätt för live-avbildning av mitochondria cristae dynamics 62,63,64,65,66. De senaste framstegen inom levande färgämnen för STED-avbildning har förbättrat färgämnets ljusstyrka och fotostabilitet, och dessa färgämnen riktar sig mot IMM i en högre grad av specificitet än sina föregångare. Denna utveckling gör det möjligt att samla in långsiktiga timelapse- och z-stack-experiment med superupplösningsavbildning, vilket öppnar dörren för bättre livecellanalys av mitokondriell ultrastruktur och dynamik.

Häri tillhandahålls protokoll för avbildning av levande celler av odifferentierade och differentierade SH-SY5Y-celler färgade med PKmito Orange (PKMO)-färgämnet med STED63. SH-SY5Y-cellinjen är ett trefaldigt subklonat derivat från modercellinjen, SK-N-SH, genererad från en benmärgsbiopsi av metastaserande neuroblastom67,68,69,70. Denna cellinje är en vanligt förekommande in vitro-modell i ND-forskning, särskilt med sjukdomar som AD, HD och PD, där mitokondriell dysfunktion är starkt inblandad 10,43,71,72,73. Förmågan att differentiera SH-SY5Y-celler till celler med en neuronliknande fenotyp genom att manipulera odlingsmedia har visat sig vara en lämplig modell för neurovetenskaplig forskning utan att förlita sig på primära neuronala celler10,74. I detta protokoll tillsattes retinsyra (RA) till cellodlingsmediet för att inducera differentiering av SH-SY5Y-celler. RA är ett vitamin A-derivat och har visat sig reglera cellcykeln och främja uttrycket av transkriptionsfaktorer som reglerar neuronal differentiering75. Ett protokoll för odling och avbildning av levande celler av nervceller isolerade från råttans hippocampus tillhandahålls också. Hippocampus har visat sig påverkas av mitokondriell degeneration och spelar, tillsammans med cortex, en viktig roll i åldrande och ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. Förökning och differentiering av SH-SY5Y-celler

  1. Beredning av medier för celltillväxt och cellunderhåll
    1. Förbered komplett, högglukos Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM, 4,5 g/L D-glukos, 4 mM L-glutamin, 110 mg/L natriumpyruvat) kompletterat med en slutlig 1% (v/v) antibiotika-antimykotika (10 000 enheter/ml penicillin, 10 000 μg/ml streptomycin och 25 μg/ml amfotericin B) och varierande mängder fetalt bovint serum (FBS) (se materialförteckning). FBS-mängderna i differentieringsmedier varierar mellan slutliga 10 %, 5 % eller 2 % (v/v) FBS.
  2. Underhåll av celler
    1. Behåll cellerna i DMEM kompletterade med 10 % (v/v) FBS och placera dem vid 37 °C och 5 % CO2, så sedan i DMEM som innehåller 5 % (v / v) FBS för differentiering. Frysta celllager lagrades i FBS med 10 % (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) vid 1-2 x 107 celler/ml.
  3. Beredning av retinsyra (RA)
    1. Lös upp 7,51 mg all-trans-RA (se materialtabell) i 5 ml nyberedd 95 % etanol för att erhålla 5 mM stamlösning. Kontrollera koncentrationen med absorbans vid 350 nm (ɛ = 44 300 M-1 cm-1), som erhållits från produktinformationsbladet i tillverkarens protokoll81, med användning av en spädning av stamlösningen vid 5 μM i etanol. Förvara 5 mM buljong skyddad från ljus vid 4 °C i upp till 6 veckor.
  4. Beredning av poly-D-lysin för täckglasbeläggning
    OBS: Produktprotokollet för poly-D-lysin (PDL), som finns under avsnittet Dokument och nedladdningar på leverantörens webbplats82, ger information för beläggning av en mängd olika odlingskärl.
    1. Detta protokoll inkluderar volymer baserade på ett kärl med 2 brunnar med en yta på 4 cm2 per brunn med sterila #1,5 borosilikattäckande glasbottnar (se materialförteckning). Späd stamlösningen av PDL två gånger till 50 μg/ml med Dulbeccos PBS (DPBS; inget kalcium, inget magnesium).
      OBS: #1.5 eller #1.5H täckglas är båda acceptabla tjocklekar, vilket är viktigt för bildkvaliteten. Andra tjocklekar kommer att inducera sfärisk aberration och bör undvikas.
  5. Täckande beläggning med PDL
    OBS: Täckglas kan utsättas för ultraviolett (UV) ljus i 10-15 minuter i ett biosäkerhetsskåp för ytterligare sterilisering.
    1. Applicera 1,2 ml 50 μg/ml PDL-lösning på varje brunn med sterila kammartäckglas i ett cellodlingsskåp och inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Ta bort PDL-lösningen och skölj tre gånger med 3,6 ml destillerat vatten. Efter avslutad sluttvätt, låt den belagda kammaren torka i 2 timmar exponerad för luft innan du sköljer och använder omedelbart eller förvarar med en lufttät behållare vid 4 °C i upp till 2 veckor.
      OBS: Skölj täckglasen noggrant eftersom överskott av PDL kan vara giftigt för cellerna.
  6. Differentiering av SH-SY5Y-celler med RA
    OBS: Använd inte celler ovanför passage 15. Celler passerar vid 80%-90% sammanflöde. Differentieringsprocedurerna skiljer sig åt men följer liknande steg. Ytterligare differentiering från neuroblastom till mogna nervceller erhålls med ytterligare behandling med BDNF (Brain-derived Neurotrophic Factor) 68,83,84,85, men utfördes inte i detta protokoll.
    VALFRITT: Etablera celler i minst 24 timmar före sådd på täckglas. För att förbereda celler från frysta stammar, tina snabbt 1 ml fryst injektionsflaska med celler och tillsätt till 9 ml förvärmt medium kompletterat med 10 % FBS, centrifugera sedan ner med 350 x g i 10 minuter (vid rumstemperatur) och kassera supernatanten för att avlägsna DMSO. Återsuspendera cellpelleten i 5 ml förvärmt medium och fröceller i en T-25-kolv. När cellerna når 80%-90% sammanflöde, passera celler genom att räkna och seeda dem för differentiering när det är tillämpligt.
    1. Dag 0: Fröceller.
      1. Frö cellerna till ett kammarglas från fryst stam eller en arbetskolv. Använd en såddtäthet på 1,5 x 104 celler/cm2.
        OBS: En enda brunn i ett standard 2-brunns kammarglas med 4 cm2 odlingsyta kommer att kräva 6.0 x 104 celler. Celler som kommer att förbli odifferentierade bör sås med DMEM kompletterat med 10 % (v/v) FBS, och celler som kommer att differentieras bör sås med DMEM kompletterat med 5 % (v/v) FBS.
    2. Dag 1: Påbörja RA-differentieringsbehandling.
      1. Bered DMEM kompletterat med 5 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) antibiotisk-antimykotika och en slutlig koncentration av 10 μM RA eller etanol av samma tillsatsvolym för att fungera som vehikelkontroll för denna differentieringsprocedur. Ta bort mediet i det kammarförsedda täckglaset som används för sådd, skölj med 1x PBS och tillsätt den nya DMEM till brunnarna.
    3. Dag 3: Byt ut media mot nytt RA- eller etanolhaltigt media.
      1. Ta bort media från dag 1 och ersätt med nytt medium kompletterat med 2 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) antibiotikum-antimykotika och antingen 10 μM RA eller 95 % etanol av samma tillsatsvolym för att fungera som vehikelkontroll för denna differentieringsprocedur. Ta bort mediet i det kammarförsedda täckglaset som används för sådd, skölj med 1x PBS och tillsätt nytt media i brunnarna.
    4. Dag 6: Utför avbildningen av cellerna.
      OBS: Celldifferentieringstiderna varierar beroende på protokoll, men sex dagars exponering för RA är tillräckligt för att inducera en neuronliknande fenotyp i SH-SY5Y-celler86.
      1. Utför live-avbildning, med detaljer i avsnitt 3 och 4 (figur 2).

2. Primär hippocampus neuronodling hos råtta

  1. Materialberedning för isolering av hippocampus neuron hos råtta.
    1. Förbered färskt kompletterat DMEM.
      1. Filtersterilisera en blandning av DMEM (hög glukoshalt, inget natriumpyruvat) kompletterat med 10 % (v/v) värmeinaktiverad FBS, 1 % (v/v) natriumpyruvatlösning och 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (10 000 E/ml). Förvaras i upp till 2 veckor vid 4 °C.
    2. Förbered färska kompletterade neurontillväxtmedier.
      1. Filtersterilisera en blandning av neurontillväxtmedier kompletterat med 2 % (v/v) B27-tillskott, 0,25 % (v/v) glutamintillskott och 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (se materialförteckning). Förvaras i upp till 2 veckor vid 4 °C.
  2. Förbered primär hippocampus neuronkultur.
    1. Bered primär hippocampus neuronkultur enligt tidigare publicerat arbete87 och från produktprotokollet på tillverkarens webbplats från vilket den dissekerade E18 råtta hippocampus erhålls88 (se materialtabell). Detta protokoll resulterar i en mestadels neuronal population med <2% astrocyter.
      OBS: Vilolägesmediet som denna vävnad levereras med kommer att användas för framtida steg i detta protokoll. Kasta den inte.
    2. Förbered material och medier för vävnadsdissociation.
      1. Flamma en Pasteur-pipett för att minska bländardiametern och förvara den i folie för att förhindra kontaminering fram till användning. Förvärm den beredda DMEM, 1X Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) och neurontillväxtmedia till 37 °C. Tillsätt 2 flingor DNAas med steril pincett till ett 15 ml koniskt rör.
    3. Utför vävnadsdissociation.
      1. Ta bort så mycket som möjligt av det viloläge som det dissekerade E18-råttans hippocampus förvaras i innan vävnaden placeras i det 15 ml koniska röret som innehåller DNAas och inkuberas en kort stund vid 37 °C. Tillsätt 900 μL 1X HBSS följt av 100 μL 0,5 % trypsin. Inkubera vävnaden vid 37 °C i 15 minuter.
        OBS: PDL-belagda plattor kan tas bort från förvaringen och placeras i en inkubator tills de används under denna inkubationstid.
    4. Utföra vävnadshomogenisering och cellräkning.
      1. Efter inkubation med trypsin, avlägsna mediet och tillsätt 1 ml förvärmt vilolägesmedia-DNAas från föregående steg till vävnaden och homogenisera med Pasteurpipetten. Medierna kommer att se ogenomskinliga ut och sedan gradvis klarna i takt med att homogeniseringen fortsätter.
      2. Tillsätt dissocierade neuroner till ett nytt rör med 4 ml förvärmd DMEM och räkna sedan cellerna med hjälp av en cellräknare.
    5. Utföra cellplätering och tillväxt av primära celler.
      1. Plattceller med en densitet av cirka 1,65 x 104 celler/cm2 i DMEM. För ett täckglas med 2 brunnar (4 cm 2), så 65 000 – 70 000 celler per brunn med2 ml DMEM. Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO 2 i2 timmar innan du kontrollerar vidhäftning. När cellerna börjar fästa tar du bort 1 ml media och ersätter det med samma volym vilolägesmedia, rör sedan försiktigt för att blanda. När mediet är blandat, upprepa denna process och ta bort hälften av det närvarande mediet och ersätt det med samma volym av neurontillväxtmedia, blanda sedan försiktigt.
        OBS: Dagen för plätering anses vara dag in vitro (DIV) 0, och cellerna är redo att avbildas vid DIV 7 (figur 2).

3. Förberedelse av celler för avbildning av levande celler

OBS: Celltyper och ursprung (dvs. odlade och primära celler) kan skilja sig åt i färgningskrav; Se publicerade rapporter för mer information62,63.

  1. Beredning av PKmito Orange
    OBS: Andra färgämnen som i allmänhet fläckar IMM har rapporterats64,65,66 och är kommersiellt tillgängliga. PKMO är det enda som används i detta protokoll.
    1. Återsuspendera pulver PKMO (se materialtabell) i DMSO enligt tillverkarens instruktioner89. Sug upp mediet från cellerna och tvätta i förvärmda fenolröda fria medier. Bered ett lager av PKMO i förvärmd, fenolrödfri DMEM kompletterad med 2 % (v/v) FBS eller 10 % (v/v) beroende på differentieringstillstånd, HEPES till en slutlig koncentration av 20 mM och 1 % (v/v) antibiotika-antimykotika innan du färgar cellerna enligt tillverkarens instruktioner. Denna formulering, utan PKMO, är det levande cellavbildningsmediet.
  2. Cellfärgning med PKMO
    1. Inkubera cellerna med färgämnet vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter. Tvätta cellerna tre gånger med levande bildmaterial och inkubera 5 % COi 30 minuter vid 37 °C för den slutliga tvätten.
    2. Tillsätt nya, förvärmda bildmedier för levande celler. Cellerna är nu redo för avbildning.
      OBS: Akuta behandlingar (t.ex. läkemedel och/eller stressfaktorer), när de används, läggs till före levande avbildning; se avsnittet Diskussion och kompletterande figur 1.

4. Avbildning av levande celler med STED-mikroskopi

OBS: Detta protokoll använder ett STED-system byggt kring ett inverterat mikroskop, med det system som anges i materialförteckningen. Detta system är utrustat med pulsade excitationslasrar (561 nm laser med nominell effekt ~300 μW) och en pulsad 775 nm STED-utarmningslaser (nominell effekt 1,2 W), en kontinuerligt justerbar galvanoskanner och en 615/20 nm filterbaserad lavinfotodioddetektor (APD). Här används en 100x/1.40 oljeimmersionslins för STED. Lightbox-programvara används för bildinsamling. All information som tillhandahålls är direkt relaterad till denna programvara och systeminstallation.

  1. Allmänna riktlinjer och steg för bilddiagnostik
    1. Använd en inkubator eller miljökammare för att upprätthålla cellens livskraft, men kortvariga rumstemperaturexperiment är också acceptabla. Dessa steg är specifika för STED-konfigurationen som beskrivs ovan.
    2. Välj laser- och filtersatser för bildtagning.
      1. Använd parametrar för ett orange färgämne genom att välja det eller de färgämnen som används i färgningen från färgämneslistan, eller det med spektrala egenskaper som ligger närmast färgämnet/färgämnena som används. Gör dessa aktiva genom att dubbelklicka eller dra dem till provlistan, där det står "Dra färgämne(n) hit".
    3. Välj en region att avbilda.
      1. I en översikt skapar du ett intresseområde (ROI) runt en mitokondrie av intresse genom att välja den rektangulära ROI-knappen och klicka och dra för att forma regionen. ROI kan ändras och roteras med hjälp av ROI-hörnen eller böjda kanter som visas när du håller musen över ett hörn.
        OBS: En sammanfattning av de föreslagna bildparametrarna finns i tabell 1. Dessa parametrar justerades empiriskt med hjälp av de som tidigare rapporterats för denna STED-uppställning och färgkombination63.
    4. Ställ in gating.
      1. Bredvid menyn Allmänt väljer du menyn Gating eller klickar och håller ned för att lägga till menyn i vyn. Det rekommenderas att STED-detektorns grind justeras till 1-1.05 till 7.8-7.85 ns, som presenteras här. Grindtiderna kan variera och vara så korta som 1-1,05 till 7-7,05 ns.
    5. Justera intensiteten på lämpligt sätt enligt sample.
      OBS: I allmänhet är excitationseffekten som används för STED 2-3 gånger den effekt som används för konfokal, så ett prov som kräver 5 % excitationslasereffekt för konfokal kan använda 10%-15 % excitationslasereffekt under STED-förvärv.
      1. Ställ in excitationslasern för STED på 15%-20% och STED-utarmningslasern på 20%-25% med 10 linjeackumuleringar. Använd en pixeluppehållstid på 4 μs med en pixelstorlek på 20-25 nm. Nålhålet hölls på 1,0 AE för odlade celler och 0,7 AE för primära hippocampusceller hos råtta för att förbättra optisk snittning i de mer tätt packade mitokondrierna.
        OBS: Konfokala och STED-bilder kan båda förvärvas för jämförelse sida vid sida (Figur 3A, B, Figur 4A) eller endast STED kan förvärvas.
  2. Tilläggsuppgifter om tidsserier/z-serier
    1. Välj tidsserien.
      1. Välj listrutan Tid. Definiera antalet iterationer (5 används här) och tidsintervallet (25 eller 30 s används här) som önskas för en timelapse (figur 3C, D, figur 4B).
        OBS: Om intervallet är kortare än insamlingstiden kommer iterationerna att fortsätta utan dröjsmål. När du utför en timelapse rekommenderas starkt att du använder en perfekt fokusenhet eller liknande fokusspårning för att undvika potentiell drift.
    2. Ställ in volymintervallet.
      1. Ställ in z-volymområdet efter önskemål genom att aktivera alternativet Volume och justera de två ändarna av intervallet. Stegstorlekarna som användes i detta protokoll för 2D-avbildning var 150-200 nm. Rekommenderad stegstorlek med avseende på Nyquistprovtagning som krävs för dekonvolution av rå STED kan beräknas med onlineverktyg90.
        OBS: STED-utarmningslasereffekten och antalet plan som avbildas kan öka färgämnesfotoblekning och ljusexponering för cellen till skadliga nivåer. Kontrollera om det finns tecken på fototoxicitet och fotoskador efter förvärvet.

5. Process- och analysverktyg för mitokondriell ultrastruktur

OBS: Bildbehandling (dvs. dekonvolution) är valfritt men används vanligtvis när man gör och analyserar STED-bilder för publicering. Dekonvolution för att förbättra kontrasten och minska bruset rekommenderas starkt för optimal segmentering av enskilda cristae, som beskrivs nedan (figur 2).

  1. Dekonvolution av STED-avbildning
    OBS: Programvaran som används för dekonvolution i detta protokoll finns i materialtabellen.
    1. Ställ in bildens mikroskopiska parametrar.
      OBS: Se till att mikroskopmetadata matas in korrekt i bildens mikroskopiska parametrar. Detta inkluderar monteringsmedium brytningsindex; nedsänkningsmedium; pixelstorlek; excitations-, emissions- och utarmningsvåglängder; och all annan relevant information. Mallar med dessa parametrar kan sparas för återanvändning.
    2. Dekonvolutera råa STED-bilder med mjukvarualgoritmen.
      1. Tillgång till automatiserade dekonvolutionsalgoritmer i deconvolution-programvara möjliggör hands-off deconvolution-bildbehandling. Välj knappen Express och ställ in avfaltningstypen på Snabb, Standard, Aggressiv eller Konservativ för olika grader av avfaltningskraft. Representativa bilder som använder Express Deconvolution med aggressiva inställningar visas (bild 3, bild 4 och figur 5).
      2. Spara bilderna från avfaltningsprogrammet i ICS2-format.
    3. Utför följande steg för manuell dekonvolution.
      1. När du utför manuell dekonvolution sparar du mallarna för deconvolution-guiden för konsekvens och har möjlighet att läsa in en mall när du startar guiden. Använd information om PSF-funktionen (Measured Point Spread Function) om den genereras med exponeringsinställningar och parametrar.
      2. Beskär rå STED-bild, om det behövs, innan du låter avfaltningsprogrammet automatiskt stabilisera bilden. Tillägg till dekonvolutionsprogramvarupaket möjliggör specifik kompensation av möjliga avbildningsartefakter som termisk drift och kromatiska aberrationer.
      3. Generera sedan ett logaritmiskt histogram för att manuellt eller automatiskt utföra bakgrundssubtraktion. Välj den klassiska CMLE-algoritmen (maximum likelihood estimation).
        OBS: För dekonvolution är de viktigaste värdena som ska justeras tröskelvärdet för signal-brusförhållandet, antalet iterationer och kvalitetströskeln. Dessa värden kan justeras och deconvolutionen kan förhandsgranskas för att fastställa optimala inställningar.
  2. Segmentering och partikelanalys
    OBS: Detta protokoll använder FIJI (Is Just ImageJ), en programvara med öppen källkod (se Tabell över material), för segmentering och analys. Annan jämförbar programvara, inklusive CellProfiler, Icy, Ilastik och QuPath, är tillgänglig för dessa ändamål.
    1. Förbered bilder för segmentering.
      1. Öppna .obf raw STED-bilderna eller .ics2-filerna från deconvolution-programvaran genom att gå till Arkiv → Öppna eller klicka och dra filerna till verktygsfältet ImageJ. Härifrån kan all bearbetning som gör det lättare att segmentera bilder utföras före segmentering.
      2. För att hålla ändringarna konsekventa, spela in funktioner med hjälp av plugins → makron → Spela in och kopiera och klistra in tangentkommandon i ett nytt makro, från Plugins → Nytt → makro. Se till att välja den bild som ska bearbetas innan du kör makrot.
        OBS: Allmänt accepterade ändringar för kvantifiering av storlek och form inkluderar beskärning, projicering av en z-stack och bakgrundssubtraktion med utjämning inaktiverad. Ändringar bör utföras konsekvent bland bilder inom en datauppsättning och rapporteras.
    2. Justera inställningar för Weka-segmentering som kan tränas
      OBS: Ytterligare detaljer med steg-för-steg-instruktioner för användning av det halvautomatiska segmenteringsverktyget och nedströmsanalyser för mitokondrier har publicerats91.
      1. Öppna de dekonvolverade STED-bilderna i plugin-programmet Trainable Weka Segmentation (TWS)92 , som finns under Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. I segmenteringsinställningarna väljer du funktionerna Gaussisk oskärpa, membranprojektioner och Sobelfilter . Standardvärdet för membrantjockleken är 1 och standardstorleken för membranplåstret är 19.
      2. Märk antingen klass 1 eller 2 som "Cristae" och den andra som "Bakgrund" (figur 2). Modeller kan också sparas med knappen Spara klassificerare . Välj Läs in klassificeraren för att återanvända de här inställningarna för andra bilder.
    3. Utför TWS-klassspårningar.
      1. Använd linjeverktyget eller andra former för att markera en del av kritorna eller bakgrunden. Åtminstone vissa bakgrundsval bör innehålla mellanrum mellan kritorna. Rita en linje över strukturen som ska tilldelas någon av klasserna och välj sedan knappen Lägg till på höger sida för antingen krita eller bakgrund. Dubbelklicka på ett spår för att ta bort strukturen från etiketten.
    4. Utför TWS-klassificeringsträning.
      1. Välj knappen Träna klassificerare till vänster för att generera en karta baserat på den information som tillhandahålls till plugin-programmet. Övertäckningen för segmenterade klasser kan slås på och av med knappen Växla överlägg, och opaciteten för övertäckningen kan justeras i Inställningar. Klassificeraren kan tränas om med ytterligare etiketter. När du är nöjd väljer du knappen Hämta sannolikhet.
    5. Mät partiklarna.
      1. Använd sannolikhetskartan för cristae, tröskel bilden för att generera en mask och gå sedan till Analysera → Analysera partiklar. I allmänhet kan standardtröskeltypen användas och intervallet justeras för att säkerställa att hela kriteriet redovisas. Mätningarna som tillhandahålls genom att analysera partiklar kan justeras med Analyze → Set Measurements.
        OBS: Exempel på storleks- och formparametrar som area, omkrets, cirkularitet och bildförhållande för cristae mäts och visas baserat på de valda måtten (figur 2, figur 5A, tilläggstabell 1).
      2. VALFRITT: Välj den råa STED-bilden med samma dimensioner som den deconvolved-bilden och tillämpa ROI:erna från hanteraren och välj sedan Mät i ROI-hanteraren för att få intensitetsvärden.
    6. Hämta linjediagram.
      1. Linjediagram genererades från de dekonvolverade STED-bilderna. Rita en flerpunktslinje, justera linjetjockleken till flera pixlar bred för att jämna ut bruset och splinea linjen så att den passar mitokondrierna (figur 2, figur 5B). Det resulterande linjediagrammet som genereras används för att mäta topp-till-topp-avstånd för att rapportera periodiciteten och fördelningen av cristae över ett visst intervall.
        OBS: Relaterat kan cristae-densitet rapporteras som antalet oberoende cristae inom ett givet område som bestäms genom att mäta den yttre delen av mitokondrierna. Det mitokondriella området kan bestämmas genom att applicera ett filter på den dekonvolverade eller råa STED-bilden för att generera en mask. Se till att masken passar exakt på mitokondriernas kontur innan du mäter området.

Representative Results

Detta protokoll beskriver celltillväxtförhållanden för odlade och primära celler med fokus på STED-avbildning av levande celler och efterföljande analyser av mitokondriella cristae. Projektioner gjorda med ImageJ av mitokondrier från odifferentierade SH-SY5Y (Figur 3A) och RA-differentierade SH-SY5Y (Figur 3B) celler kan samlas in som z-stackar med traditionell konfokal och STED, och de råa STED-bilderna kan sedan dekonvolveras. Timelapse-avbildning kan också utföras och därefter dekonvolveras (Figur 3C,D). Genom att använda något olika avbildningsparametrar för primära hippocampusneuroner hos råtta (tabell 1) kan konfokala och råa STED-bilder erhållas som z-stackar, och de råa STED-bilderna kan dekonvolveras (figur 4A). Timelapse-avbildning av mitokondrier från primära nervceller är också möjlig (Figur 4B). I allmänhet bör time-lapse-bilderna kunna visa mitokondriella dynamiska händelser.

När råa STED och deconvolved STED z-stack-projektioner från proverna som används för segmentering verkar konsekventa, utförs kvantitativa mätningar. TWS-pluginet använder den dekonvolverade STED-bilden för att segmentera för att skapa en sannolikhetsmask, som sedan används för att skapa en binär mask av cristae för att få storleks- och formparametrar (figur 5A). Regionerna från den här masken sparas i ROI-hanteraren och kan tillämpas på den råa STED-bilden om så önskas för att mäta skillnader i relativ intensitet. De dekonvolverade STED-prognoserna kan också användas för att bestämma cristae-periodiciteten och densiteten i ett givet område (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: Mitokondriell morfologi. Mitokondrier har ett tvåmembransystem som definierar olika underavdelningar (A). Cristae är veck av det inre membranet med definierade egenskaper (B). Förkortningar: OMM, yttre mitokondriellt membran; ICS, intrakristalliserat rum; IMS, intermembranutrymme; CM, cristae membran; IBM, inre gränsmembran; IMM, inre mitokondriellt membran; CT, cristae spets; CJ, cristae korsning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Schematisk bild av arbetsflödet. SH-SY5Y-celler eller primära hippocampusneuroner från råttor odlas på ett PDL-belagt täckglas. SH-SY5Y-celler odlas parallellt för att förbli odifferentierade eller utsättas för RA-differentiering under loppet av sex dagar. Primära hippocampusneuroner från råttor odlades på ett PDL-belagt täckglas efter att ha isolerats från hippocampussektioner i sju dagar. När cellerna var redo att avbildas färgades de med PKMO och avbildades med STED. Råa STED-bilder dekonvolveras sedan och de dekonvolverade bilderna bearbetas i FIJI för att erhålla storleks- och formmått, såsom cristae-densitet, area, omkrets, cirkularitet och bildförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Avbildning av mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Representativ konfokal (vänster), rå STED (mitten) och Huygens dekonvolverade STED-bilder z-stackprojektioner (höger) av mitokondrier från icke-differentierade (A) och RA-differentierade (B) SH-SY5Y-celler med PKMO-färgning visas. En timelapse med 30 s intervall och 5 iterationer av RA-differentierade SH-SY5Y-celler visas (C) med valda regioner (vita rutor) expanderade (D) med hjälp av skalade bilder av dessa regioner utan interpolering. Skalstreck: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av mitokondrier i primära hippocampusneuroner hos råtta. Representativ konfokal (vänster), rå STED (mitten) och Huygens dekonvolverade STED (höger) bild z-stackprojektioner av mitokondrier från primära hippocampus neuroner från råtta visas (A). En timelapse med 25 s intervall och 5 iterationer av mitokondrier i dessa neuroner visas (B). Skalstreck: A, 250 nm; B, 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Bearbetning av dekonvolverade STED-bilder i ImageJ. Representativ användning av plugin-programmet Trainable Weka Segmentation för att mäta cristae-storlek och form visas (A). Från vänster till höger visas följande bilder: den dekonvolverade STED-bilden, sannolikhetskartan baserad på segmentering från TWS-plugin-programmet, masken från tröskelvärden i FIJI med sannolikhetskartan som indata, masken med ROI:erna beskrivna och ROI:erna överlagrade på den ursprungliga dekonvolverade STED-bilden. De resulterande mätningarna av area, omkrets, cirkularitet och bildförhållande som motsvarar dessa objekt finns i tilläggstabell 1. Ett linjediagram som använder den dekonvolverade STED-bilden för att mäta topp-till-topp-avstånd som en avläsning för cristae-densitet visas (B). Skalstreck: 0,5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Pixelstorlek (nm) Uppehållstid (μs) Linje enl. 561 nm excitation under STED-förvärv (%) 775 nm STED-utarmningseffekt (%) Stegstorlek (nm) Nålhål (AU) Timelapse-intervall (s) Timelapse-iterationer
Odifferentierad SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5
RA-differentierad SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5
Primära neuroner 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5
OBS: Pixelstorleken kan variera beroende på bildkrav och avsikt att dekonvolvera bilder. Korrekt sampling krävs för dekonvolution. Pixelstorlekarna för råa STED-bilder utan dekonvolution kan gå upp till 30 nm.

Tabell 1: Sammanfattning av STED-förvärvsparametrar. Inställningarna som används för 2D STED-avbildning för varje celltyp, odifferentierad SH-SY5Y, RA-differentierad SH-SY5Y och primära hippocampusneuroner från råtta, visas. För alla time-lapses togs 5 iterationer med varierande intervall baserat på ROI-storlek.

Tilläggsfigur 1: Avbildning av SH-SY5Y-celler med amyloid-β (Aβ) tillsats. Representativa konfokala (vänster), råa STED (mitten) och dekonvolverade STED (höger) bilder av RA-differentierade SH-SY5Y-celler med PKMO-fläck (överst) och Aβ-HiLyte647 (nederst) visas (A). Sammanslagna z-stackprojektioner av rå PKMO STED (grön) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller dekonvolverad PKMO STED (grön) med dekonvolverad Aβ STED (magenta) (C) visas. Skalstaplar: 0,5 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell 1: Storleks- och formmätningar av segmenterade cristae. Storleks- och formmätningarna av area (μm2), omkrets (μm), cirkularitet och bildförhållande, motsvarande de objekt som beskrivs i figur 5A från segmenterade mitokondrier, visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell 2: Sammanfattning av insamlingsparametrar med amyloid-β-prover. Inställningarna som används för 2D STED-avbildning av PKMO och Aβ-HiLyte647 i odifferentierade och RA-differentierade SH-SY5Y-celler visas. Konfokal av Aβ-HiLyte647 kan användas ensamt eftersom det inte finns någon specifik struktur att lösa; STED-bilder av Aβ-HiLyte647 visas här för mindre partikelstorlekar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Behandlingsprotokoll för amyloid-β. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta protokoll presenterar användningen av humana neuroblastomcellinjen SH-SY5Y och primära hippocampusneuroner från råtta med det nya IMM-riktade PKMO-färgämnet för STED-avbildning av levande celler. På grund av nyheten med PKMO finns det för närvarande lite publicerat som använder detta färgämne för levande STED-avbildning. Att använda dessa celltyper för STED-avbildning innebär utmaningar, särskilt eftersom neuronala celler har smalare mitokondrier. En begränsning med detta protokoll är det PKMO-färgämne som används, eftersom det kan vara giftigt för celler. Olika celler och cellinjer reagerar olika på färgämnet, därför kan justeringar av färgämneskoncentration och inkubationstid för att optimera resultaten för stark signal utan att skada cellerna krävas. En föreslagen lösning är att sänka koncentrationen och öka färgningstiden63; Detta kan dock resultera i sämre färgning utan att öka cellviabiliteten.

I likhet med PKMO uppvisar det kommersiella färgämnet Live Orange mito (Table of Materials) också viss celltoxicitet. Detta färgämne användes för en mängd olika odlade celler men kunde inte uppvisa jämförbar färgning i RA-differentierade SH-SY5Y-celler framgångsrikt med samma parametrar som deras odifferentierade motsvarigheter (våra opublicerade observationer). Lämpliga färgningsprotokoll kan dock optimeras för denna sond och valda celltyper. Med detta färgämne användes detektorns regleringstider på 1-1,05 till 7-7,05 ns, med alla andra parametrar i tabell 1 desamma. Generellt sett gav färgning av celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 minuter jämförbara resultat som de PKMO-resultat som visades. Färgning med högre koncentration under kortare tid eller färgning med lägre koncentration under samma tid eller något längre kan ge olika resultat och kan vara gynnsamt för andra celltyper eller tillväxtförhållanden.

Avbildning av primära hippocampusneuroner hos råttor skiljer sig från odödliga celler på grund av arten av axon- och dendritutskotten samt mitokondriell distribution vid tidpunkten för avbildning. En svårighet i denna del av protokollet är att såddtätheten avgör om de primära kulturerna kommer att kunna fästa och växa hälsosamt, och vid högre densiteter tenderar prognoserna att växa över vid DIV 10. Därför kommer mitokondrierna som avbildas från dessa primära neuroner sannolikt att komma från cellkroppen och inte projektionerna; Framgångsrik tillväxt från en lägre celltäthet ger dock bättre avbildningsresultat vid senare tillväxttillfällen. Nyckeln är att säkerställa låg bakgrund och oskarpt ljus för att få bästa kontrast för STED. För att ta itu med farhågor om cellpopulationen förhindrar odling av primära hippocampusceller i B27-kompletterade neurontillväxtmedier tillväxten av gliaceller, och källan rapporterar att <5 % av cellerna är astrocyter och frånvaron av NbActiv1-tillskott i odlingsmediet minskar antalet astrocyter i kulturer till <2 %87. För både odlade SH-SY5Y-celler och primära hippocampusneuroner från råtta bidrar PDL-beläggningen som används för tillväxt till bakgrundsdis i bilder. Tillräcklig signal-till-brus uppnås med de inställningar som rapporteras i (tabell 1) och dekonvolution tar bort det mesta av den observerade bakgrunden.

Förutom den avbildning som behandlas här är det också möjligt att lägga till behandlingar eller stress på celler före eller under avbildning. Till exempel inducerar tillsats av tert-butylväteperoxid (tBHP) oxidativ stress, och det är möjligt att övervaka förändringar i mitokondrier över tid efter tillsats. Tillsatsen av amyloid-β (Aβ) med en fluorescerande tagg möjliggör övervakning av distributionen av denna peptid i förhållande till mitokondrier samt mitokondriestrukturen över tid. Mitokondriell hälsa har varit starkt inblandad i AD och har brett stöd för att spela en roll i Aβ-toxicitet 43,71,72. Differentieringsstatusen för SH-SY5Y-celler påverkar lokaliseringen av Aβ-proteinprekursorn (AβPP)85, och experiment med AβPP bör konstrueras noggrant.

Som ett exempel på hur detta protokoll kan anpassas visas att den fluorescerande varianten Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan adderas till PKMO-färgade celler 15 minuter före avbildning (Supplement Figure 1). Avbildningsparametrarna är likartade (tilläggstabell 2), med den största skillnaden att ett mindre hål behövs vid avbildning av smalare mitokondrier. Avbildning av Aβ-HiLyte647 med STED kräver mindre total excitation (6%-8%) och STED-utarmning (10%-12%) lasereffekt och färre ansamlingar (sex). Detektorgrinden har också utökats från 0,1 till 10 ns. Även om STED-upplösning av Aβ inte är nödvändig, var det totala signal-brusförhållandet och Aβ-partikelstorleken för rå STED bättre än för de konfokala bilderna, och efterföljande dekonvolution kan också utföras. Att samla in STED-bilder och dekonvolvera råa STED z-stackprojektioner av Aβ verkar särskilt användbart vid sammanslagning med råa STED- eller dekonvolverade STED-bilder av PKMO-fläcken (tilläggsfigur 1B,C). Båda kanalerna samlades i ett enda bildsteg. Mätningar av tidsberoende lokalisering, liknande de som anges i figur 2 och visas i figur 5, där så är tillämpligt, och skillnader i kritarkitekturen kan erhållas efter stressbehandling eller andra tillägg.

Andra möjliga metoder för dubbelmärkning i levande celler STED av mitokondrier som inte rapporterats här men som har rapporterats av andra inkluderar användning av SNAP-märkta proteiner93, Halo-märkta proteiner och användning av andra cellpermeabla färgämnen med generiska mål, såsom mtDNA63. Noterbart är att märkningsstrategin för SNAP- och Halo-taggning påverkar den resulterande fluorescenssignalens intensitet och livslängd vid avbildning94. Dessutom, även om detta protokoll presenterar flera exempel på analyser som kan tillämpas på segmenterade mitokondrier, finns det många andra analyser som programvarupaket kan utföra på dessa bilder.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Primära nervceller i hippocampus hos råttor levererades av Dr. George Lykotrafitis och Shiju Gu från avdelningen för biomedicinsk teknik vid University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet som finns i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment förvärvades med NIH-anslag S10OD023618 tilldelades Christopher O'Connell. Denna forskning finansierades av NIH-anslag R01AG065879 tilldelades Nathan N. Alder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in -- -- Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) -- The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus -- This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior -- Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior -- STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Tags

STED-avbildning av levande celler mitokondriellt inre membran ultrastruktur neuronala cellmodeller mitokondrier energiproduktion Ca2+-homeostas lipidbiosyntes reaktiva syrearter (ROS) neuroner aerob metabolism Ca2+-signalering axontillväxt och regenerering ROS-produktion neurodegenerativa sjukdomar mitokondriell dysfunktion inre membranstruktur Cristae molekylära system diffraktionsbegränsad upplöst mikroskopi elektronmikroskopi superupplösningsfluorescensmikroskopi
Användning av STED-avbildning av levande celler för att visualisera mitokondriell inre membranultrastruktur i neuronala cellmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, E. L., Reed, A. L.,… More

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter