Summary
在这里，我们提出了一种改进的悬浮固定方法，使用大鼠夹克在针灸实验中有效地固定大鼠。此外，还阐明了该固定装置的结构和应用，以及其在电针治疗中的应用说明和评估。
Abstract
在基础实验针灸研究中，大鼠通常被用作实验动物。但是，他们很难保持固定的姿势。在电针治疗过程中，正确固定大鼠是必不可少的。目前使用多种大鼠固定方法，包括麻醉固定、高平台固定、结合固定和自制大鼠外套固定。然而，这些方法都有其局限性，可能会在一定程度上影响实验的效率和可操作性。该协议介绍了一种使用老鼠衣服悬挂和固定大鼠的方法。首先，老鼠穿着与其体型相匹配的老鼠夹克，利用它们对黑暗和挖洞的偏好。然后在大鼠穿上大鼠衣服后进行针刺操作。当悬浮时，老鼠相对静止，因为它们的四肢不能移动。这种固定方法不仅具有经济和用户友好的好处，而且确保了将大鼠稳定可靠地固定在舒适放松的位置。它还有效地减少了时间消耗、实验空间和人力资源。此外，这种方法允许暴露用于大鼠针灸的大多数穴位。本文主要集中介绍该设备的组成，包括专门设计的老鼠夹克、高架固定架及其连接结构。此外，还将提供一个说明性示例，以演示基于大鼠服装的悬吊固定方法在大鼠电针操作中的应用。
Introduction
针灸是一种传统的疗法，其特点是在特定的穴位或其他位置针刺，以预防和治疗疾病。电针将丝状针与电刺激1相结合，通过调整相关参数可以精确控制刺激量，促进针灸治疗的标准化2。近年来，对电针机制的研究不断拓展和深化3,4，这导致以电针机制为重点的研究逐年增加5。
在电针的基础研究中，大鼠是最常用的动物。在电针治疗期间，接受者必须保持静止，以确保手术顺利进行。与人类受试者的临床试验不同，动物实验中使用的小动物在15-30分钟的电针治疗过程中不能有意识地遵循命令。这给研究人员带来了实现稳定可靠固定的主要挑战。固定不当会导致动物6产生焦虑、抑郁、恐惧等负面情绪，这不仅增加了大鼠受伤的风险和实验人员被咬伤的机会，而且影响了研究结果的稳定性和说服力。
在以往的研究中，研究人员在针灸或电针手术前经常使用麻醉固定7、高平台固定8、结合固定 6,9 或大鼠外套固定10。然而，考虑到麻醉对身体11和脑功能12的影响，并考虑到针灸是在临床病例中对清醒的患者进行的，麻醉可能会在一定程度上影响研究结果。因此，与麻醉固定相比，清醒状态下大鼠的舒适固定是更好的选择。
然而，在非麻醉状态下，各种固定方法也有其各自的局限性，包括由于大鼠皮毛覆盖在大鼠身上而限制的穴位暴露10，需要至少两个人进行手术13，不可调节的固定器尺寸14，或大鼠处于强迫位置的应力状态6.为了解决这些技术问题，我们设计了一种大鼠夹克和一个固定架，适用于大鼠身体大部分部位的针灸操作。这可以帮助研究人员有效地对大鼠进行针灸手术。
该协议的基本原理如下：首先，老鼠夹克上的封闭式头盔利用了老鼠对黑暗和挖洞的自然倾向，从而限制了它们的活动范围。其次，靠近大鼠四肢关节的捆绑绳提供了物理压缩约束，对它们的运动施加了一定的限制。然而，即使穿着夹克，老鼠仍然能够跳跃和水平移动。最后，由于老鼠在悬挂时没有固定的受力点就无法接触地面，因此我们在老鼠夹克上增加了一个悬挂固定装置，进一步限制了它们的运动并确保针头固定。固定装置的组成如图 1所示。
图 1：大鼠夹克和悬架固定示意图。（A） 大鼠夹克在平面视图下的一般外观。 （B） 大鼠夹克的三维视图。 （C） 特别定制的老鼠夹克，在头部和后腰部的穴位附近有一个切口。 （D） 多只大鼠同时悬挂在高架上的图示。1：织物整体视图;2：前肢出口;3：后肢出口;4：系绳;5：缝合后形成的空腔;6：露出头部穴位的切口;7：用于暴露背部和腰部穴位的切口。8：缝合位置。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
本研究中对大鼠进行的所有程序均遵守中华人民共和国正式采用的《国家实验动物福利和伦理审查指南》（2018）和国家科学院出版社的《实验动物护理和使用指南》15。该协议由三个主要步骤组成。首先，老鼠夹克是根据不同体重的大鼠的个体体型量身定制和合身的。接下来，按照标准程序进行针灸操作。最后，将大鼠悬浮在夹克中，而针头保持在原位，以适应同一组内大鼠同时干预的需要。
1. 针前准备
- 老鼠夹克的生产
- 在制作夹克之前称重并测量它们的体型。为了验证该协议对不同体重的大鼠的适用性，选择体重为220g，300g，400g和520g的大鼠进行其身体尺寸的独立测量，包括从a到f的测量，如图 2所示。
注：大鼠的身体比例与其相应的夹克尺寸之间的相关性也显示在 图2中。不同体重大鼠的相关体长参数记录在 表1中。 - 剪一块长方形的厚而深色的织物，制成老鼠夹克。使用展开宽度等于大鼠腹部最厚部分周围测量的周长的织物。织物的长度等于从大鼠鼻尖到尾巴根部的距离（见 图2）。
- 将织物对折，以约45°-65°的角度切掉左上角，形成右梯形（见 图3A）。
- 用棉线将左侧两侧缝紧。有关指导，请参阅图 1B 和 图 3B 。
- 切两个小孔，在织物的每一侧，让大鼠的上肢和下肢穿过（见 图3C）。两个上肢之间的距离决定了大鼠外套上孔之间的间距。两个下肢之间的距离决定了大鼠外套下孔之间的间距。
- 利用大鼠腋窝与髂骨前部之间的纵向距离作为大鼠外套上下孔之间的间距。用肩关节的周长来确定大鼠夹克上孔的周长。将髋关节的周长用于大鼠夹克下孔的周长。
- 在每个孔旁边，缝上一条长长的布带，可以从夹克的开口端交叉并紧紧缠绕在身体上，以固定老鼠。
- 在制作夹克之前称重并测量它们的体型。为了验证该协议对不同体重的大鼠的适用性，选择体重为220g，300g，400g和520g的大鼠进行其身体尺寸的独立测量，包括从a到f的测量，如图 2所示。
- 大鼠夹克的穿着方法
- 在继续给老鼠穿上夹克之前戴上手套。首先用一只手握住老鼠夹克的中间和背面。用另一只手将老鼠的尾巴从喂食笼中取出，轻轻地将其放入夹克中。
- 当老鼠向前移动时，它的头会接触到夹克的头饰。此时，用双手小心地将其左右上肢从夹克上的孔中拉出。
- 从夹克的开口端取下绑绳，从左到右交叉，然后将其牢固地缠绕在老鼠的躯干上。将其紧紧地系在躯干的另一侧，以确保正确固定。在束缚大鼠的上肢之后，重复相同的过程以固定其下肢。
- 采取预防措施，避免在将四肢从夹克孔中拉出时被老鼠的爪子咬伤或抓伤。确保绳子的松紧度调整得当，即不要太紧而引起大鼠局部肢体缺血和缺氧，不要太松，让大鼠容易逃脱（见 视频1）。
- 固定架和S形铁钩
- 固定架由两个沉重的铁托盘（长 24 厘米、宽 12 厘米、高 2 厘米）和一根铁柱（长 60 厘米）组成，铁柱牢固地焊接在每个托盘上。使用可调整和保持在固定高度的螺钉连接结构，将一根实心铁棒（长 145 厘米）固定在两根铁柱上的相同高度（见 图 4A）。
- 为了将穿着夹克的老鼠连接到铁棍上，请使用 S 形钩（直径 11 厘米）。将钩子的一端缠绕在夹克上的带子上，另一端挂在铁棍上。使用两个 S 形钩子将老鼠固定在棍子上。整体结构请参考图 1D 和 图4B 。
图2：大鼠体型和匹配大鼠外套尺寸的对应图。 在图中，参数 a 表示上肢与大鼠躯干之间关节后部的横向距离。该值用作大鼠夹克上肢穿透孔之间的间距测量值。同样，参数b表示大鼠双下肢与躯干连接的背部横向距离。该测量确定大鼠夹克下肢穿孔的间距。参数c表示大鼠腹部最厚部分的周长，可用作大鼠夹克面料的宽度测量值。参数d表示从大鼠腋窝到髂骨前部的距离，确定夹克上孔和下孔之间的纵向距离。参数e对应于从大鼠鼻尖到尾巴根部的纵向距离，作为大鼠外套布的长度测量值。参数f表示连接上肢和大鼠躯干的关节的周长，作为上肢通过的孔的周长。参数g表示连接下肢和大鼠躯干的关节的周长，决定了下肢通过的孔的周长。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 体重 （g） | 体型参数（cm） | ||||||
| 一个 | b | c | d | e | f | g | |
| 220 | 6.0 | 7.0 | 15.0 | 8.0 | 19.0 | 5.0 | 7.0 |
| 300 | 7.0 | 7.5 | 17.0 | 10.0 | 21.0 | 6.0 | 8.0 |
| 400 | 8.0 | 8.5 | 19.0 | 11.5 | 23.0 | 6.5 | 9.0 |
| 520 | 8.0 | 10.0 | 20.0 | 12.5 | 26.0 | 7.0 | 9.5 |
表 1. 不同体重大鼠体型参数的测量结果。
图 3：描述老鼠夹克的物理外观和用途的图表。 （A） 老鼠夹克的平面外视图。老鼠夹克的形状类似于直角梯形，左右两侧有单独的开口，供老鼠的上肢和下肢通过。（B） 大鼠夹克的展开外景。头带的闭合形成了一个半封闭的空腔，这是引诱老鼠进入的关键部件。（C） 一只穿着夹克的老鼠的侧视图。一旦老鼠的四肢穿过衣服的开口，带子就会交叉在躯干的腹面上，并以适当的张力牢固地固定在背部。这确保了大鼠相对固定。（D）穿着老鼠夹克的大鼠的腹部视图。夹克的腹面暴露了大鼠的腹部皮肤，便于在腹侧穴位进行针灸。请点击这里查看此图的较大版本.
视频1：穿上老鼠夹克。 该视频显示了给老鼠穿上夹克的典型过程。 请按此下载此影片。
图 4：高架固定架的物理外观和用途图。（A） 高架固定架。该架子主要由焊接在每个托盘上的两根垂直铁柱（长 60 厘米）以及一根平行于地面放置的长水平铁棒（长 145 厘米）组成。螺钉用于将水平杆固定在与垂直立柱相同的高度。（B） 固定架上的大鼠悬浮液。穿着大鼠夹克的大鼠使用每只大鼠的两个S形钩子牢固地固定在固定架上。（C）多只大鼠同时进行电针治疗。为了防止尾巴运动引起的任何潜在干扰，有必要在大鼠之间保持适当的间距，相当于大鼠尾巴的长度。请点击这里查看此图的较大版本.
2. 电针灸程序
- 常规准备
- 将固定架放在水平桌面或地面上。
- 在针刺程序之前，使用电动剃须刀去除穴位周围的毛发，以确保完全暴露。当待穿刺的穴位位于大鼠腹部时，如观源（CV4，肚脐下方约25mm），适当缩短大鼠衣物的宽度，露出腹部穴位。
- 从腹部中线未被大鼠夹克覆盖的间隙中找到穴位（见 图3D），然后注射针头。
- 当要穿刺的穴位在大鼠头部时，如百慧（GV20，位于顶骨中间），在头部相应位置做一个小切口，使GV20周围的皮肤完全暴露（见 图1C）。
- 在大鼠四肢穴位上针灸穴位时，如上肢的内关（PC6，在前肢内侧，距腕关节约3mm的桡骨缝合线和尺骨缝合线之间）或下肢的Zusanli（ST36，在膝关节后外侧，腓骨头下方约2mm）， 由于穴位明显外露，用一只手辅助固定肢体，另一只手可直接进行针灸手术。
- 当穴位位于大鼠的背部或腰部时，如神树（BL23，第2腰椎下方，距背部中线6毫米），在大鼠外套中央切开一个约2厘米宽的开口，以充分暴露相应部位的皮肤（见 图1C）。
- 给老鼠穿上夹克。用酒精棉签对穴位局部皮肤进行消毒后，开始针灸程序。
- 针刺技术：准确定位穴位。将无菌一次性针灸针（0.16 mm x 7 mm）插入大鼠穴中适当深度。
- 电针手术
- 将电极丝缠绕在水平铁棒上。此步骤可降低由于作用在电针夹上的重力而导致针头脱落的风险。然后，将电极丝的末端牢固地连接到针柄上。
- 打开电源并选择适当的频率、电流和时间参数。在本实验中，参数设置为 2 Hz、1 mA 和 15 min。调整参数后，开始电针治疗过程（见视频 2 和 视频 3）。
- 大鼠同时电针：治疗过程中，用S形钩将同一组的大鼠一起悬挂在铁棒上，让它们同时进行电针干预。
- 注意：铁棒不仅要坚固，而且要足够长，可以同时治疗一群老鼠。在该实验中，在确保适当的间距和大鼠之间没有干扰的同时，可以同时处理3-4只大鼠（见 图4C）。
- 电针治疗期间大鼠反应的观察：根据完成手术所需的人员数量、固定大鼠所需的时间、电针治疗过程中大鼠的反应、手术过程中掉落的针头数量以及手术过程中可能发生的任何意外死亡等因素，评估该固定方法对大鼠电针的适用性。
- 拔除针头
- 一旦预设时间完成，电针仪将自动关闭。取下连接到针柄的小夹子，小心地从大鼠皮肤下取出针灸针，从而结束电针治疗过程。
- 松开带子，掀起老鼠夹克的头罩，将老鼠放在笼子上方。然后，老鼠可以自由地从夹克中释放出来，独立地进入笼子（见 视频4）。
视频 2.腰部针刺穴位。 该视频演示了全面而连贯的过程，包括将老鼠穿上夹克，将针灸针插入腰部的穴位，以及随后连接电针灸设备。 请按此下载此影片。
视频 3.腹部和下肢的针刺穴位。 该视频演示了全面而连贯的过程，包括将大鼠穿上夹克，将针灸针插入位于腹部和下肢的穴位，以及随后连接电针灸装置。 请按此下载此影片。
视频 4.取下老鼠夹克。 该视频展示了从老鼠身上脱下夹克的习惯做法。 请按此下载此影片。
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Representative Results
本实验共选取12只大鼠进行电针治疗，观察其固定法下的反应（ 如表2所示）。在12只大鼠中，只有1只大鼠在15 min电针停留期间表现出剧烈的挣扎。由于其剧烈的运动，针头中途脱落，占大鼠总数的8.33%。这一结果表明，所使用的固定方法通常表现出显着的稳定性和可靠性。尽管一只大鼠表现出挣扎，但该组中的大多数大鼠在整个治疗过程中都保持了适当的针头固定。此外，在采用该方法固定大鼠进行电针治疗的2个月实验期间，没有记录到大鼠死亡的实例，表明该固定方法对大鼠的安全性。
此外，在表 3 中，我们将这种固定方法与文献9、10、13、14 中报道的其他四种方法进行了比较。首先，在稳定性方面，除了第五种方法使用新制作的鼠架固定的稳定性稍差外，其他方法都实现了相对安全的固定。在时间方面，使用这种方法固定一只大鼠所需的平均时间短于大鼠皮毛摆动固定方法。其余方法没有在各自的论文中具体说明固定所需的时间;因此，不提供任何讨论。在固定一只大鼠所需的人员数量方面，该方法和大鼠皮毛摆动悬浮法都只需要一人完成操作，从而提高了实验效率。但是，就暴露穴位范围而言，该协议中专门设计的老鼠外套可以满足暴露身体大部分穴位的要求，而摆动悬挂法中的老鼠外套主要暴露四肢。关于用于固定的材料，这种方法所需的材料在实验室和日常环境中都相对容易获得。此外，就大鼠在固定过程中的位置而言，自然位置显然比强制位置更舒适。总体而言，这种方法类似于大鼠外套摆动悬吊固定方法，但它有针对性地改进了大鼠外套的面料和设计，允许更多地暴露身体穴位。此外，与悬挂在织物带上相比，该协议使用更坚固的钢管，当多只大鼠同时在固定架上接受电针治疗时，减少了个体大鼠剧烈摇晃对其他大鼠造成的不利影响。这保证了实验数据的稳定性和可靠性。
综合考虑上述因素，这种方法对大鼠具有稳定性、效率、可负担性和相对舒适性的好处，使其成为针头插入固定的宝贵选择。
| 固定方法 | 挣扎的老鼠数量 | 挣扎的大鼠百分比（%） | 治疗期间针头掉落的大鼠数量 | 治疗期间针头掉落的大鼠百分比（%） | 手术期间死亡的大鼠数量 | 手术中死亡的大鼠百分比（%） |
| 与护套组绑定的悬架固定 | 1 | 8.33 | 1 | 8.33 | 0 | 0 |
表 2. 固定大鼠在电针治疗期间的反应（n = 12）。
| 序号 | 固定方法 | 大鼠的固定是否稳定和安全 | 修复老鼠所需的时间 | 修复老鼠所需的人员数量 | 可以暴露的穴位的位置和范围 | 固定装置或材料的可及性 | 大鼠固定方法的舒适性：自然或强制姿势 | 参考资料 | |||||||||||||||
| 1 | 在我们的实验中，悬浮固定与护套结合 | √ | 50-63 秒 | 1 | 腹部、头部、背部和腰部、四肢 | 随时可用 | 自然体位 | ||||||||||||||||
| 2 | 舒沐穴位组合针灸固定架（将报警点与后转点相结合的穴位选择） | √ | / | / | 头部、四肢、背部和腰部 | 固定架需要定制 | 强制位置 | 9 | |||||||||||||||
| 3 | 一种被毛捆绑的摆动大鼠的固定方法 | √ | 85-93 秒 | 1 | 肢体部位 | 随时可用 | 自然体位 | 10 | |||||||||||||||
| 4 | 由旧网状笼盖制成的老鼠固定装置 | √ | / | ≥2 | 穴位范围不受限制 | 随时可用 | 强制位置 | 13 | |||||||||||||||
| 5 | 新制作的老鼠架 | 固定后，大鼠的前后肢仍有一定的活动能力。此外，大鼠颈部固定杆的交点可能过高，从而导致大鼠窒息存在一定的风险。如果太低，大鼠的头部固定可能不稳定。 | / | / | 穴位范围不受限制 | 鼠架需要特殊定制 | 自然体位 | 14 | |||||||||||||||
表 3. 大鼠针灸实验中不同固定方式的比较结果。
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Discussion
电针已被证明对认知障碍 16,17、心肌损伤18、炎症性疼痛19 等多种疾病有良好的治疗效果。为了了解其作用机制，已经进行了主要使用大鼠的动物实验。在手术过程中固定动物对于获得准确的结果至关重要。虽然许多研究在动物麻醉后进行了电针治疗，但这种做法可能会阻碍大脑功能并影响实验的准确性。此外，长期麻醉会延长针刺程序并增加动物的死亡机会。然而，报道的非麻醉固定方法也有局限性，在表 3 中已仔细讨论。
本研究提出了一种新的方案，该方案引入了定制的大鼠夹克和升高的固定架。该协议的关键方面包括根据大鼠的体型制作适当尺寸的大鼠夹克，并根据要针刺的穴位的具体位置进一步定制它们。安装老鼠夹克的一个有用技巧是利用老鼠对黑暗和挖洞的自然倾向来鼓励它进入头饰。一旦固定了大鼠的头部，随后的固定程序就会变得简单得多。
经过适应性训练后，大鼠在使用这种技术时表现出最小的不适感。所需的设备材料，如织物、S形钩、铁棍等材料，易于获取且具有成本效益，从而有助于降低实验费用。另一个优点是，大鼠夹克带的松紧度可以根据大鼠的大小进行调整，使其灵活可控。整个固定操作可由一人独立完成，设备的高架配置使研究人员可以同时治疗一组小动物，从而显着提高实验效率，减少整个实验所花费的时间，并最大限度地减少同一组动物之间的差异。此外，高架平台无需使用桌子，因为它可以直接放置在水平地面上，从而优化了空间利用率。此外，这些设计可以修改和扩展以用于其他实验动物，例如豚鼠，也可以有效地用于艾灸治疗。
这种方法的一个潜在限制是要求研究人员对该技术具有高度的熟练程度，以及需要根据每只大鼠的体长和肢体间距制作不同尺寸的大鼠夹克。此外，不可避免的是，一些大鼠在初次暴露于大鼠夹克和悬吊固定时可能会感到轻微的不适和压力。因此，对接受电针治疗的大鼠进行适应性训练变得势在必行。此外，在手术过程中必须小心处理这些老鼠，在激动或不遵守的情况下采用轻柔的抚摸来安抚和平静它们。值得注意的是，为尽量减少不可避免的应激对大鼠身体状况和行为实验的影响，对照组（包括空白对照组和模型对照组）也应与电针治疗组同时进行相同量的处理、大鼠外套捆绑、高位固定， 即使他们没有接受电针治疗。
综上所述，这种固定方法为我们提供了方便有效的固定大鼠选择，保证了针灸操作和针刺固定过程的稳定顺利的可靠保障。
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Disclosures
所有作者均未声明存在潜在的利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢 Home for Researchers 的 Figdraw 科研绘图平台提供用于创建本文图 2 的材料，授权许可证 ID：URUUO5699e。这项工作得到了国家自然科学基金（81873380,82074566）、湖北省自然科学基金（2022CFCO43）和国家中医药管理局国家名中医药遗产工作室建设项目（[2022]5号，[2022]75号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75% alcohol | Shandong Lircon medical technology co., ltd | 2002-0059 | Disinfection |
| acupuncture needles | Beijing Luo ya shan chuan medical equipment co., Ltd. | needling | |
| Adult Sprague-Dawley (SD) rats | Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd. | SCXK 2020-0001 | The recipient subjected to fixation |
| an elevated fixation rack | Taizhou shiai instruments and equipments for scientific and teaching research Co., ltd | / | Fix rats |
| Hans electronic acupuncture apparatus | Beijing Huayun Ante Science and Technology Co. Ltd. | HANS-200A | electroacupuncture |
| Medical cotton ball | Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd. | 20172142357 | Disinfection |
| Pet electric clipper | Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory | / | Shave the hair of rats |
| Tweezers | Qingdao Schultz Biotechnology Co., ltd | Pinch cotton balls |
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