Summary
Follikelstimulerende hormon (FSH) i forskellige ekstragonadale væv og organer er forbundet med patogenesen af flere sygdomme. Den ovariectomized og FSH-behandlede musemodel (OVF) kan bruges til at udforske FSH's ekstragonadale handlinger.
Abstract
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalderen) oplever mange kvinder betydelige fysiologiske og patologiske ændringer, herunder nedsat knoglemasse, øgede blodlipider og øget visceral fedme. Niveauer af follikelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen. Mange undersøgelser har vist, at FSH i forskellige ekstragonadale væv og organer er forbundet med patogenesen af flere sygdomme. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo . I denne undersøgelse blev C57BL/6 hunmus ovariektomiseret og suppleret med østradiolvalerat (OVX + E2) for at eliminere effekten af hypothalamus-hypofyse-gonadale aksen. OVX + E2-musene modtog opløsningsmiddel (N.S.) eller forskellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injektion for at skabe en musemodel (OVF) kendetegnet ved relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer. Således genererede vi med succes en eksperimentel musemodel til at efterligne det tidlige stadium af overgangsalderen, kendetegnet ved forhøjede serum-FSH-niveauer. OVF-modellen har fordelene ved at være stabil, billig og nem at betjene, hvilket er velegnet til undersøgelser for at udforske FSH's ekstragonadale handlinger. Her beskriver vi detaljerede protokoller til musens OVF-model.
Introduction
Niveauerne af follikelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen (udtrykket menopausal overgang blev defineret i 2011 på stadier af reproduktiv aldringsworkshop (STRAW) + 10-system)1. Det er under overgangsalderen, en periode præget af stigende FSH-niveauer og relativt stabilt østrogen1, at kvinder oplever menstruationscyklusændringer og betydelige fysiologiske ændringer, der involverer forskellige celler og væv. Disse ændringer kan i alvorlig grad påvirke kvinders livskvalitet og sundhed. Undersøgelse af virkningerne af FSH kan forbedre kvinders livskvalitet og sundhed.
FSH udskilles fra gonadotropceller i den forreste hypofyse og er afgørende for at kontrollere gonadefunktion og reproduktion2. FSH's funktion medieres gennem FSH-receptoren (FSHR), som tilhører G-proteinkoblet receptor (GPCR)3. FSHR udtrykkes generelt i gonader, nemlig æggestokken og testiklerne. Det er bevist, at FSHR udtrykkes universelt i flere ekstragonadale celler og væv, herunder lever4, hippocampus5, osteoklaster6, adipocytter7 og endotelceller8. Nye undersøgelser har afsløret ekstra gonadale virkninger af FSH og dets potentielle kliniske relevans i dyslipidæmi4, Alzheimers sygdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kræft12. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo, for at udforske FSH's handlinger alene.
I protokollen introducerede vi proceduren for etablering af en musemodel med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer13. Musemodellen efterligner overgangsalderen ved ovariektomiseret kirurgi og suppleres derefter med østradiolvalerat og rekombinant FSH. Da de ovariektomiserede mus blev suppleret med eksogent østrogen for at opretholde lignende østrogenniveauer med de skamopererede mus, var niveauerne af endogen FSH stabile på grund af østrogenfeedback ved hypofysen. I denne tilstand kunne det kontrollere FSH-niveauerne ved at administrere eksogent FSH uden at ændre østrogenniveauerne. Således kan OVF-musemodellen udelukke indflydelsen af østrogen og observere de ekstragonadale fysiologiske og patologiske virkninger af FSH. Vi mener, at den detaljerede og visualiserede procedure er nyttig for forskere til at etablere OVF-musemodellen i deres laboratorium og anvende den til at undersøge fysiologiske og patologiske ændringer under overgangsalderen efter behov.
Protocol
Følgende protokol overholdt alle institutionelle etiske retningslinjer vedrørende brugen af forsøgsdyr og blev godkendt af Animal Ethics Committee på Shandong Provincial Hospital, Kina. Alle kirurgiske manipulationer blev udført under dyb anæstesi, og dyrene oplevede ikke smerte på noget tidspunkt under proceduren.
1. Forberedelse før operationen
- Sterilisering af instrumenter
- Dampsteriliser kirurgiske instrumenter i en autoklave (121 ° C i 15 min) før operationen. Forbered tilstrækkelige engangssuturer og nåle.
- Opsætning af operationsplatform
- Udfør operationen i et rum dedikeret til kirurgiske procedurer. Tildel et bænkareal på mindst 60 cm x 60 cm til operationen. Rengør overfladen af området med 75% alkohol og dæk med et engangshåndklæde, og desinficer det derefter med ultraviolet stråling 30 minutter i forvejen (figur 1A).
- Forberedelse af dyr
- Opstald alle dyr i et temperaturstyret rum (20-25 °C) med en 12 timers lys, 12 timers mørk cyklus. Acclimate 8 uger gamle kvindelige C57BL/6 mus til staldanlægget i 1 uge før operationen.
- Væg mus før operationen. Administrer alle 9 uger gamle hunmus med generel anæstesi ved intraperitoneal injektion af Tribromoethanol (280 mg / kg) for at opnå smertefrihed på ethvert tidspunkt under proceduren. Meloxicam (2 mg/kg) injiceres subkutant ca. 1 time før en operation for at lindre smerter.
- Påfør øjensalve for at forhindre hornhinde tørhed under operationen.
- Påfør hårfjerningslotion på bagsiden ved hjælp af en ren vatpind. Lad lotionen sidde på en mus i 3-5 min, og fjern derefter håret ved hjælp af gasbind og vatpinde. Gentag dette trin, indtil alt hår er fjernet fra bagsiden af musen.
- Brug gasbind og vatpinde til at rense huden med 75% alkohol. Fastgør musen på operationsplatformen igen ved hjælp af en gummistrimmel eller bomuldsreb (figur 1B), og påfør iodoforopløsning til at rengøre ryggen.
BEMÆRK: Bekræft dybden af anæstesi via en tåklemme før ovariektomi.
2. Ovariektomi
BEMÆRK: Tribromethanol kan opretholdes i ca. 30 minutter, hvilket sikrer, at operationen afsluttes så meget som muligt.
- Lav et ~ 1,0 cm dorsalt snit i længderetningen fra lårbasen opad ved hjælp af en engangsskalpel, og sørg for, at kun huden og subkutan fascia skæres og undgå at skære ind i det bageste peritoneum på dette tidspunkt.
- Træk snittet til venstre, og en hvid fedtpude kan ses. Skær ~ 0,5 cm langs den hvide fedtpude for at udsætte det intraperitoneale hulrum ved hjælp af mikrotang og saks.
- Efter skæring af det bageste peritoneum skal du langsomt og forsigtigt fjerne den hvide fedtpude fra det intraperitoneale hulrum med mikrotang. Fugt straks det hvide fedtvæv med 0,9% sterilt saltvand uden for den gennemblødte gasbind. Hold udsat væv altid fugtet, mens du er uden for bughulen.
- Et lyserødt granulært stof, nemlig æggestokken, er fastgjort til den nederste del af den hvide fedtpude (figur 2A). Æggestokkene er forbundet med en slank kanal, nemlig livmoderen. Brug 5-0 absorberbare suturer til at ligere æggestokkens ende af livmoderen og fjerne venstre æggestok (figur 2B).
- Når du fjerner en æggestok, skal du bevare det omgivende fedtvæv så meget som muligt. Undgå direkte kontakt mellem kirurgiske instrumenter og æggestokkene og forhindre intraperitoneal implantation af ovarievæv.
- Placer forsigtigt den hvide fedtpude tilbage i det intraperitoneale hulrum. Udfør en simpel intermitterende sutur på det bageste peritoneum med en 5-0 absorberbar sutur (figur 2C). Når suturen er færdig, skal du rengøre enhver blødning med 0,9% sterilt saltvandsgennemblødt gasbind.
- Træk hudsnittet til højre og fjern den rigtige æggestok ved hjælp af samme metode.
- Udfør en intermitterende sutur med 4-0 ikke-absorberbare suturer og rengør enhver blødning med 0,9% sterilt saltvandsgennemblødt gasbind (figur 2D).
- Rens såret med en iodoforopløsning efter afslutning af begge suturer. Intraperitonealt injicere bredspektret antibiotika.
3. Observation efter operationen
- Flyt musene til et 37 °C konstant temperaturtæppe efter operationen. Indtil musene kan bevæge sig frit, skal du holde dyrene i deres individuelle bur. Efterlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
- Meloxicam (2 mg/kg) injiceres subkutant 24 timer efter operationen for at lindre smerter.
- Overvåg musene dagligt for at sikre, at operationssåret heler ordentligt uden tegn på komplikationer (dehiscens) til stede.
4. Tilskud af østradiol
- Forbered foder suppleret med østradiolvalerat. Brug 2,6 mg beta-estradiol 17-valerat suppleret pr. 1 kg foder.
- 3 dage efter afslutningen af operationen skal du fodre musene med østradiolvalerat.
5. FSH injektion
- Forbered rekombinant human FSH-opløsning. Rekombinant humant FSH-pulver opløses til injektion med 0,9 % sterilt saltvand til 100 IE/ml.
- Gruppér mus i henhold til forsøgsplaner og giv opløsningsmiddel eller forskellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injektion i 2 uger. Ifølge den biologiske aktivitet af rekombinant FSH skal injektionsdosis af FSH anvendes til mus svarende til serum-FSH-niveauet hos kvinder i overgangsperioden for overgangsalderen.
BEMÆRK: Baseret på forskellige behandlinger blev ovariectomized østrogen-suppleret mus tilfældigt opdelt i tre grupper, opløsningsmiddelgruppe (NS), der modtog 100 μL / dag opløsningsmiddel, lavdosis FSH (L-FSH) gruppe, der modtog 15 IE / kg legemsvægt pr. Dag og højdosis FSH (H-FSH) gruppe, der modtog 30 IE / kg legemsvægt pr. Dag.
Representative Results
OVF-musemodellen efterligner det tidlige stadium af overgangsalderen med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer13. For det første blev 9 uger gamle kvindelige C57BL/6-mus til ovariefjernelseskirurgi administreret generel anæstesi og udsat for enten en skinoperation (Sham) eller bilateral ovariektomi (OVX). Da udtværingsbilleder af Papanicolaou-farvede celler tydeligt identificerede proestrus-, østrus-, metestrus- og diestrusstadierne i østruscyklussen, mistede OVX-musene østruscyklussen (figur 3A), og ELISA-metoden viste et signifikant fald i serumøstradiolniveauer (E2) (figur 3B). For det andet blev OVX-musene suppleret med beta-estradiol 17-valerat (OVX + E2) for at opretholde serumøstrogen på samme niveau som Sham-gruppen. For det tredje modtog OVX + E2-musene opløsningsmiddel (N.S.) eller forskellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injektion for at skabe en musemodel (OVF) kendetegnet ved relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer (figur 4).
Figur 1. Kirurgisk miljø og musestilling. A) En bænk på mindst 60 cm x 60 cm til operationen. Rengør overfladen af området med 75% alkohol og dæk det med et engangshåndklæde, og desinficer derefter med ultraviolet stråling 30 minutter i forvejen. (B) Fastgør musen på operationsplatformen igen ved hjælp af en gummiliste eller bomuldsreb. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Vigtige trin i kirurgisk operation. (A) Ovarieposition, (B) ovariektomi, (C) sutur peritoneum og (D) sutur hudsnit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Vaginal cytologi. Vaginal cytologi repræsenterer stadier af østruscyklussen og endogent østrogen i de ovariektomiserede mus (OVX) og de skamopererede (Sham; n = 12 for Sham-gruppen; n = 10 pr. OVX-grupper). (A) Vaginal cytologi repræsenterer stadier af østruscyklussen i henhold til den relative tilstedeværelse af leukocytter, cornified epitelceller og nukleerede epitelceller. Stadier af østrus indbefatter proestrus, overvejelsen af nukleerede epitelceller; østrus, overvejelsen af enukleerede cornified celler; metestrus, tilstedeværelsen af leukocytter og cornified og nucleated epitelceller; diestrus, overvejelsen af leukocytter. Skalastang = 100 μm. (B) Endogent østrogen i ovariektomiserede mus (OVX) og de skamopererede (Sham). Data vises som gennemsnittet ± SEM. Elevens t-test bruges til statistisk analyse. s< 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. OVF model og serum hormonniveauer. (A) OVF-model med rutediagram. (B) ELISA-analyse af serumøstrogen (E2) og FSH-koncentrationer. Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. Envejs ANOVA blev brugt til statistisk analyse. * p< 0,05 og ** p< 0,01. Dette tal er ændret fra4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalderen) oplever mange kvinder betydelige fysiologiske og patologiske ændringer. Niveauer af FSH stiger under overgangsalderen1. Nye undersøgelser har afsløret, at FSH i forskellige ekstragonadale væv og organer er kritisk i patogenesen af flere sygdomme, herunder dyslipidæmi4, Alzheimers sygdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kræft12. Derfor er det særligt vigtigt at opbygge en dyremodel, der kan hjælpe med at studere de uafhængige virkninger af FSH in vivo. OVF-musemodellen efterligner det tidlige stadium af overgangsalderen med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-niveauer og er især velegnet til undersøgelser for at udforske FSH's ekstragonadale handlinger.
I denne metode blev ovariektomi lavet ved hjælp af et enkelt dorsalt rygsnit, ca. 1 cm fra lårbasen og opad (figur 1B). Huden blev skåret næsten sammen med rygmusklerne ved hjælp af en skarp dissekerende saks, og bughulen blev således tilgået. Efter operationen krævede muskelsnittet ingen suturering, og hudsåret blev lukket bilateralt med en catgut sutur (figur 2). Operationen er teknisk lettere, mindre tidskrævende og mindre skadelig for hunmus sammenlignet med andre anvendte metoder.
Nogle detaljer, der skal være til stede under operationen. For det første skal alle kirurgiske procedurer holdes rene og så sterile som muligt for at reducere risikoen for postoperativ infektion. For det andet, fordi æggestokkens væv er meget skrøbeligt, kan kirurgiske instrumenter ikke kontakte æggestokkene direkte under ovariektomi for at undgå intraperitoneal implantation. For det tredje blev musene efter operationen flyttet til et konstant temperaturtæppe på 37 °C under genopretning for at forhindre postoperativ hypotermi, der førte til døden.
En tidligere undersøgelse har vist, at endogent østrogen syntetiseres i ovarie theca-celler hos præmenopausale kvinder eller fedtstromale celler i brystet hos postmenopausale kvinder og i mindre mængder i perifert væv14. Serumøstrogenet faldt kraftigt for ovariektomiserede mus, men kan ikke elimineres (figur 3B). Imidlertid påvirker endogent østrogen syntetiseret i ekstragonadale væv ikke stabiliteten af østrogenniveauer i OVF-modellen (figur 4B).
Der er nogle begrænsninger i OVF-modellen. Når den kirurgiske operation ikke er forsigtig og fører til ovarie intraperitoneal implantation, kan det føre til modelfejl. I dette tilfælde falder serumøstrogenet ikke kraftigt og svinger i forskellige stadier af østruscyklussen. Efter eksogen administration af østrogen og FSH tager det ca. 1 uge for kroppen at nå ligevægt. Patologiske ændringer af OVF-modellen, der forekommer inden for 1 uge, kan således ikke indikere virkningerne af FSH.
Afslutningsvis har OVF-modellen fordelene ved at være stabil, billig og nem at betjene. De systemiske virkninger af FSH på højt niveau kan observeres efter intraperitoneal injektion af FSH; det vil sige, at OVF-modellen er velegnet til undersøgelser, der udforsker FSH's ekstragonadale handlinger. Imidlertid er kravene til modelkirurgi og intraperitoneale injektionsprocedurer ret høje. Hvis finansieringen er tilstrækkelig, er specifikke knockout-modeller det bedste valg.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke dyrelaboratoriet på Shandong Provincial Hospital for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC 82101645), Natural Science Foundation of Shandong Province, Kina (ZR2020QH088) og Science and Technology Support Plan for Youth Innovation of Colleges i Shandong-provinsen (2021KJ051).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
