Summary
Follikelstimulerande hormon (FSH) i olika extragonadala vävnader och organ är associerat med patogenesen av flera sjukdomar. Den ovariektomerade och FSH-behandlade musmodellen (OVF) kan användas för att utforska de extragonadala effekterna av FSH.
Abstract
Under övergången från en reproduktiv till en icke-reproduktiv fas (klimakteriet) upplever många kvinnor betydande fysiologiska och patologiska förändringar, inklusive minskad benmassa, ökade blodfetter och ökad visceral fetma. Nivåerna av follikelstimulerande hormon (FSH) stiger under klimakteriet. Många studier har visat att FSH i olika extragonadala vävnader och organ är associerat med patogenesen av flera sjukdomar. Därför är det särskilt viktigt att bygga en djurmodell som kan hjälpa till att studera de oberoende effekterna av FSH in vivo . I denna studie ovariektomerades C57BL/6-honmöss och kompletterades med östradiolvalerat (OVX + E2) för att eliminera effekten av hypotalamus-hypofys-gonadaxeln. OVX + E2-mössen fick lösningsmedel (NS) eller olika doser av rekombinant FSH via intraperitoneal injektion för att skapa en musmodell (OVF) som kännetecknas av relativt stabilt östrogen och stigande FSH-nivåer. Således genererade vi framgångsrikt en experimentell musmodell för att efterlikna det tidiga skedet av klimakterieövergången, kännetecknad av förhöjda serumnivåer av FSH. OVF-modellen har fördelarna med att vara stabil, billig och lätt att använda, vilket är lämpligt för studier för att utforska de extragonadala effekterna av FSH. Här beskriver vi detaljerade protokoll för musens OVF-modell.
Introduction
Nivåerna av follikelstimulerande hormon (FSH) stiger under klimakteriet (termen klimakterieövergång definierades 2011 i stadierna av reproduktivt åldrande (STRAW) + 10-systemet)1. Det är under klimakteriet, en period som kännetecknas av stigande FSH-nivåer och relativt stabilt östrogen1, som kvinnor upplever förändringar i menstruationscykeln och betydande fysiologiska förändringar som involverar olika celler och vävnader. Dessa förändringar kan allvarligt påverka kvinnors livskvalitet och hälsa. Att utforska effekterna av FSH kan förbättra kvinnors livskvalitet och hälsa.
FSH utsöndras från gonadotropa celler i den främre hypofysen och är avgörande för att kontrollera gonadfunktion och reproduktion2. FSH:s funktion medieras genom FSH-receptorn (FSHR), som tillhör den G-proteinkopplade receptorn (GPCR)3. FSHR uttrycks i allmänhet i könskörtlar, nämligen äggstocken och testiklarna. Det har bevisats att FSHR uttrycks universellt i flera extragonadala celler och vävnader, inklusive lever4, hippocampus5, osteoklaster6, adipocyter7 och endotelceller8. Nya studier har avslöjat extra gonadala effekter av FSH och dess potentiella kliniska relevans vid dyslipidemi4, Alzheimers sjukdom5, osteoporos 9,10, åderförkalkning11, fetma9 och cancer12. Att bygga en djurmodell som kan hjälpa till att studera de oberoende effekterna av FSH in vivo är därför särskilt viktigt för att utforska effekterna av FSH enbart.
I protokollet introducerade vi proceduren för att etablera en musmodell med relativt stabilt östrogen och stigande FSH-nivåer13. Musmodellen efterliknar klimakterieövergången genom ovariektomerad kirurgi och sedan kompletterad med östradiolvalerat och rekombinant FSH. Eftersom de ovariektomerade mössen kompletterades med exogent östrogen för att upprätthålla liknande östrogennivåer som de skenopererade mössen, var nivåerna av endogent FSH stabila på grund av östrogenåterkoppling vid hypofysen. I detta tillstånd kan det kontrollera FSH-nivåerna genom att administrera exogent FSH utan att ändra östrogennivåerna. Således kan OVF-musmodellen utesluta påverkan av östrogen och observera de extragonadala fysiologiska och patologiska effekterna av FSH. Vi tror att den detaljerade och visualiserade proceduren är användbar för forskare att etablera OVF-musmodellen i sitt laboratorium och tillämpa den för att undersöka fysiologiska och patologiska förändringar under klimakteriet vid behov.
Protocol
Följande protokoll uppfyllde alla institutionella etiska riktlinjer för användning av försöksdjur och godkändes av djurförsöksetiska kommittén vid Shandong Provincial Hospital, Kina. Alla kirurgiska manipulationer utfördes under djup narkos och djuren upplevde ingen smärta i något skede av ingreppet.
1. Förberedelse före operation
- Sterilisering av instrument
- Ångsterilisera kirurgiska instrument i en autoklav (121 °C i 15 minuter) före operationen. Förbered tillräckligt med engångssuturer och nålar.
- Inställning av kirurgiplattform
- Utför operationen i ett rum som är avsett för kirurgiska ingrepp. Tilldela en bänkyta på minst 60 cm x 60 cm för operationen. Rengör ytan på området med 75 % alkohol och täck med en medicinsk engångshandduk och desinficera den sedan med ultraviolett strålning 30 minuter i förväg (Figur 1A).
- Beredning av djur
- Håll alla djur i ett temperaturkontrollerat rum (20-25 °C) med en 12 timmars ljus, 12 timmars mörkercykel. Acklimatisera 8 veckor gamla C57BL/6-möss till boendet i 1 vecka före operationen.
- Väg möss före operationen. Administrera alla 9 veckor gamla honmöss med generell anestesi genom intraperitoneal injektion av tribromoetanol (280 mg/kg), för att uppnå smärtfrihet i alla skeden av proceduren. Injicera meloxikam (2 mg/kg) subkutant, ca 1 timme före en smärtlindrande operation.
- Applicera ögonsalva för att förhindra torrhet i hornhinnan under operationen.
- Applicera hårborttagningslotion på baksidan med en ren bomullspinne. Låt lotionen sitta på en mus i 3-5 minuter och ta sedan bort håret med gasbinda och bomullspinnar. Upprepa detta steg tills allt hår har tagits bort från baksidan av musen.
- Använd gasbinda och bomullspinnar för att rengöra huden med 75 % alkohol. Fäst musen på operationsplattformen igen med en gummilist eller bomullsrep (Figur 1B) och applicera jodoforlösning för att rengöra baksidan.
OBS: Bekräfta anestesidjupet via en tånyp före ovariektomi.
2. Ovariektomi
OBS: Tribrometanol kan bibehållas i cirka 30 minuter, vilket säkerställer att operationen slutförs så mycket som möjligt.
- Gör ett ~1,0 cm dorsalt snitt längsgående från lårbasen och uppåt med hjälp av en engångsskalpell, se till att endast huden och den subkutana fascian skärs in och undvik att skära in i den bakre bukhinnan vid denna tidpunkt.
- Dra snittet åt vänster så syns en vit fettkudde. Klipp ~0,5 cm längs den vita fettkudden för att exponera den intraperitoneala håligheten med hjälp av en mikropincett och sax.
- Efter att ha skurit av den bakre bukhinnan, ta långsamt och försiktigt bort den vita fettkudden från den intraperitoneala håligheten med en mikropincett. Fukta omedelbart den vita fettvävnaden med 0,9 % steril koksaltlösning utanför den blötlagda gasbindan. Håll exponerad vävnad alltid fuktad när du befinner dig utanför bukhålan.
- En rosa granulär substans, nämligen äggstocken, är fäst vid den nedre delen av den vita fettkudden (figur 2A). Äggstockarna är anslutna till en smal kanal, nämligen livmodern. Använd 5-0 absorberbara suturer för att ligera äggstocksänden av livmodern och ta bort den vänstra äggstocken (Figur 2B).
- När du tar bort en äggstock, bevara den omgivande fettvävnaden så mycket som möjligt. Undvik direktkontakt mellan kirurgiska instrument och äggstockarna och förhindra intraperitoneal implantation av äggstocksvävnad.
- Sätt försiktigt tillbaka den vita fettkudden i den intraperitoneala håligheten. Utför en enkel intermittent sutur på den bakre bukhinnan med en 5-0 absorberbar sutur (Figur 2C). När suturen är klar, rengör eventuell blödning med 0,9 % steril koksaltindränkt gasbinda.
- Dra hudsnittet åt höger och ta bort den högra äggstocken med samma metod.
- Utför en intermittent sutur med 4-0 icke-absorberbara suturer och rengör eventuell blödning med 0,9 % steril koksaltindränkt gasväv (Figur 2D).
- Rengör såret med en jodforlösning efter att båda suturerna har slutförts. Intraperitonealt injicera bredspektrumantibiotika.
3. Observation efter operation
- Flytta mössen till en filt med konstant temperatur på 37 °C efter operationen. Tills mössen kan röra sig fritt, håll djuren i sina individuella burar. Lämna inte djuret utan uppsikt förrän det har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande.
- Injicera meloxikam (2 mg/kg) subkutant 24 timmar efter operationen för att lindra smärtan.
- Övervaka mössen dagligen för att säkerställa att operationssåret läker ordentligt utan några tecken på komplikationer (dehiscence).
4. Östradiol tillskott
- Förbered foder som kompletterats med östradiolvalerat. Använd 2,6 mg beta-östradiol 17-valerat som tillskott per 1 kg foder.
- 3 dagar efter avslutad operation, mata mössen med östradiolvalerat.
5. FSH-injektion
- Bered rekombinant human FSH-lösning. Lös upp rekombinant humant FSH-pulver för injektion med 0,9 % steril koksaltlösning till 100 IE/ml.
- Gruppera möss enligt försöksplaner och ge spädningsvätska eller olika doser av rekombinant FSH via intraperitoneal injektion under 2 veckor. Beroende på den biologiska aktiviteten hos rekombinant FSH används injektionsdosen av FSH hos möss motsvarande serumnivån av FSH hos kvinnor under den menopausala övergångsperioden.
OBS: Baserat på olika behandlingar delades ovariektomerade östrogentillskottsmöss slumpmässigt in i tre grupper, där gruppen som fick 100 μL/dag med vätska, lågdos FSH (L-FSH) gruppen som fick 15 IE/kg kroppsvikt per dag och högdos FSH (H-FSH) gruppen som fick 30 IE/kg kroppsvikt per dag.
Representative Results
OVF-musmodellen efterliknar det tidiga stadiet av klimakteriet med relativt stabilt östrogen och stigande FSH-nivåer13. För första gången administrerades 9 veckor gamla C57BL/6-möss av honkön narkos och utsattes för antingen en skenoperation (Sham) eller bilateral ovariektomi (OVX). Eftersom utstryksbilder av Papanicolaou-färgade celler tydligt identifierade proestrus-, estrus-, metestrus- och diestrusstadierna i brunstcykeln, förlorade OVX-mössen brunstcykeln (Figur 3A), och ELISA-metoden visade en signifikant minskning av serumnivåerna av östradiol (E2) (Figur 3B). För det andra kompletterades OVX-mössen med beta-östradiol 17-valerat (OVX + E2) för att hålla serumöstrogen på samma nivå som Sham-gruppen. För det tredje fick OVX + E2-mössen lösningsmedel (NS) eller olika doser av rekombinant FSH via intraperitoneal injektion för att skapa en musmodell (OVF) som kännetecknas av relativt stabilt östrogen och stigande FSH-nivåer (Figur 4).
Figur 1. Kirurgisk miljö och mushållning. A) En bänkyta på minst 60 cm x 60 cm för arbetet. Rengör ytan på området med 75 % alkohol och täck den med en medicinsk engångshandduk och desinficera sedan med ultraviolett strålning 30 minuter i förväg. (B) Fäst musen på operationsplattformen igen med en gummilist eller bomullsrep. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Viktiga steg i den kirurgiska operationen. (A) äggstocksposition, (B) ovariektomi, (C) suturperitoneum och (D) suturhudsnitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Vaginal cytologi. Vaginal cytologi representerar stadier av brunstcykeln och endogent östrogen hos de ovariektomerade mössen (OVX) och de skenopererade (Sham; n = 12 för Sham-gruppen; n = 10 per OVX-grupper). (A) Vaginal cytologi representerar stadier i brunstcykeln beroende på den relativa närvaron av leukocyter, förhornade epitelceller och kärnepitelceller. Stadier av brunsten inkluderar proestrus, dominansen av kärnförsedda epitelceller; brunst, dominansen av enukleerade förhornade celler; metestrus, närvaron av leukocyter och förhornade och kärnförsedda epitelceller; diestrus, dominansen av leukocyter. Skalstapel = 100 μm. (B) Endogent östrogen hos de ovariektomerade mössen (OVX) och de skenopererade (Sham). Data visas som medelvärdet ± SEM. Studentens t-test används för statistisk analys. s< 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. OVF-modell och serumhormonnivåer. (A) OVF-modell för flödesschema. B) ELISA-analys av koncentrationerna av östrogen (E2) och FSH i serum. Data representeras som medelvärdet ± SEM. Envägs ANOVA användes för statistisk analys. * p< 0,05 och ** p< 0,01. Denna siffra har ändrats från4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Under övergången från en reproduktiv till en icke-reproduktiv fas (klimakteriet) upplever många kvinnor betydande fysiologiska och patologiska förändringar. Nivåerna av FSH stiger under klimakteriet1. Nya studier har visat att FSH i olika extragonadala vävnader och organ är avgörande för patogenesen av flera sjukdomar, inklusive dyslipidemi4, Alzheimers sjukdom5, osteoporos 9,10, åderförkalkning11, fetma9 och cancer12. Därför är det särskilt viktigt att bygga en djurmodell som kan hjälpa till att studera de oberoende effekterna av FSH in vivo. OVF-musmodellen efterliknar det tidiga skedet av klimakteriet med relativt stabilt östrogen och stigande FSH-nivåer och är särskilt lämplig för studier för att utforska de extragonadala effekterna av FSH.
I denna metod gjordes ovariektomi med hjälp av ett enda dorsalt ryggsnitt, cirka 1 cm från lårbasen och uppåt (Figur 1B). Huden klipptes nästan ihop med ryggmusklerna med en vass dissekerande sax, och på så sätt kom man åt bukhålan. Efter operationen behövde muskelsnittet ingen suturering och hudsåret stängdes bilateralt med en katgutsutur (Figur 2). Operationen är tekniskt enklare, mindre tidskrävande och mindre skadlig för honmöss jämfört med andra metoder som används.
Några detaljer som bör uppmärksammas under operationen. För det första bör alla kirurgiska ingrepp hållas rena och så sterila som möjligt för att minska risken för postoperativ infektion. För det andra, eftersom äggstocksvävnaden är mycket ömtålig, kan kirurgiska instrument inte komma i direkt kontakt med äggstockarna under ovariektomi, för att undvika intraperitoneal implantation. För det tredje, efter operationen, flyttades mössen till en filt med konstant temperatur på 37 °C under återhämtningen för att förhindra postoperativ hypotermi som ledde till döden.
En tidigare studie har visat att endogent östrogen syntetiseras i äggstockarnas theca-celler hos premenopausala kvinnor eller fettstromaceller i bröstet hos postmenopausala kvinnor och i mindre mängder i perifer vävnad14. Serumöstrogenet sjönk kraftigt för ovariektomerade möss men kan inte elimineras (Figur 3B). Endogent östrogen syntetiserat i extragonadvävnad påverkar dock inte stabiliteten hos östrogennivåerna i OVF-modellen (Figur 4B).
Det finns vissa begränsningar i OVF-modellen. När den kirurgiska operationen inte är försiktig och leder till intraperitoneal implantation av äggstockarna kan det leda till modellfel. I detta fall sjunker inte serumöstrogenet kraftigt och fluktuerar under olika stadier av brunstcykeln. Efter exogen administrering av östrogen och FSH tar det cirka 1 vecka för kroppen att nå jämvikt. Således kan patologiska förändringar av OVF-modellen som inträffar inom 1 vecka inte indikera effekterna av FSH.
Sammanfattningsvis har OVF-modellen fördelarna med att vara stabil, billig och lätt att använda. De systemiska effekterna av hög nivå av FSH kan observeras efter intraperitoneal injektion av FSH; det vill säga, OVF-modellen är lämplig för studier som utforskar de extragonadala effekterna av FSH. Kraven på modellkirurgi och intraperitoneala injektionsprocedurer är dock ganska höga. Om finansieringen är tillräcklig är specifika knockout-modeller det bästa valet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka djurlaboratoriet på Shandong Provincial Hospital för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC 82101645), Natural Science Foundation of Shandong-provinsen, Kina (ZR2020QH088) och Science and Technology Support Plan for Youth Innovation of Colleges in Shandong-provinsen (2021KJ051).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
