Summary
L’hormone folliculo-stimulante (FSH) dans divers tissus et organes extragonadiques est associée à la pathogenèse de multiples maladies. Le modèle de souris ovariectomisé et traité à la FSH (OVF) peut être utilisé pour explorer les actions extragonadiques de la FSH.
Abstract
Au cours de la transition d’une phase reproductrice à une phase non reproductive (ménopause), de nombreuses femmes subissent des changements physiologiques et pathologiques importants, notamment une diminution de la masse osseuse, une augmentation des lipides sanguins et une augmentation de l’adiposité viscérale. Les niveaux d’hormone folliculo-stimulante (FSH) augmentent pendant la transition ménopausique. De nombreuses études ont montré que la FSH dans divers tissus et organes extragonadiques est associée à la pathogenèse de multiples maladies. Ainsi, la construction d’un modèle animal qui peut aider à étudier les effets indépendants de la FSH in vivo est particulièrement importante. Dans cette étude, des souris femelles C57BL/6 ont été ovariectomisées et complétées par du valérate d’estradiol (OVX + E2) pour éliminer l’effet de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Les souris OVX + E2 ont reçu du solvant (N.S.) ou différentes doses de FSH recombinante par injection intrapéritonéale pour créer un modèle murin (OVF) caractérisé par des niveaux relativement stables d’œstrogènes et une augmentation des niveaux de FSH. Ainsi, nous avons réussi à générer un modèle murin expérimental pour imiter le stade précoce de la transition de la ménopause, caractérisé par des taux sériques élevés de FSH. Le modèle OVF présente les avantages d’être stable, peu coûteux et facile à utiliser, ce qui convient aux études visant à explorer les actions extragonadiques de la FSH. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour le modèle OVF de la souris.
Introduction
Les niveaux d’hormone folliculo-stimulante (FSH) augmentent pendant la transition ménopausique (le terme transition ménopausique a été défini en 2011 aux stades de l’atelier sur le vieillissement reproductif (STRAW) + 10 système)1. C’est au cours de la transition ménopausique, une période caractérisée par une augmentation des taux de FSH et d’œstrogène1 relativement stable, que les femmes subissent des changements du cycle menstruel et des changements physiologiques importants impliquant diverses cellules et tissus. Ces changements peuvent avoir de graves répercussions sur la qualité de vie et la santé des femmes. L’étude des effets de la FSH peut améliorer la qualité de vie et la santé des femmes.
La FSH est sécrétée par les cellules gonadotropes de l’hypophyse antérieure et est essentielle au contrôle de la fonction gonadique et de la reproduction2. La fonction de la FSH est médiée par le récepteur FSH (FSHR), qui appartient au récepteur couplé aux protéines G (RCPG)3. La FSHR est généralement exprimée dans les gonades, à savoir l’ovaire et le testicule. Il a été prouvé que la FSHR est universellement exprimée dans de multiples cellules et tissus extragonadiques, y compris le foie4, l’hippocampe5, les ostéoclastes6, les adipocytes7 et les cellules endothéliales8. De nouvelles études ont révélé des actions extragonadiques de la FSH et sa pertinence clinique potentielle dans la dyslipidémie4, la maladie d’Alzheimer5, l’ostéoporose 9,10, l’athérosclérose11, l’obésité9 et le cancer12. Ainsi, la construction d’un modèle animal qui peut aider à étudier les effets indépendants de la FSH in vivo est particulièrement importante pour explorer les actions de la FSH seule.
Dans le protocole, nous avons introduit la procédure d’établissement d’un modèle murin avec des œstrogènes relativement stables et des niveaux de FSH en hausse13. Le modèle murin imite la transition de la ménopause par chirurgie ovariectomisée, puis complétée par du valérate d’estradiol et de la FSH recombinante. Comme les souris ovariectomisées ont été complétées avec des œstrogènes exogènes pour maintenir des niveaux d’œstrogènes similaires à ceux des souris opérées par simulacre, les niveaux de FSH endogène étaient stables en raison de la rétroaction des œstrogènes au niveau de l’hypophyse. Dans cette condition, il pourrait contrôler les niveaux de FSH en administrant de la FSH exogène sans modifier les niveaux d’œstrogènes. Ainsi, le modèle murin OVF permet d’exclure l’influence des œstrogènes et d’observer les effets physiologiques et pathologiques extragonadiques de la FSH. Nous pensons que la procédure détaillée et visualisée est utile aux chercheurs pour établir le modèle murin OVF dans leur laboratoire et l’appliquer pour étudier les changements physiologiques et pathologiques pendant la transition de la ménopause, au besoin.
Protocol
Le protocole suivant était conforme à toutes les directives éthiques de l’établissement concernant l’utilisation d’animaux de recherche et a été approuvé par le Comité d’éthique animale de l’hôpital provincial du Shandong, en Chine. Toutes les manipulations chirurgicales ont été effectuées sous anesthésie profonde, et les animaux n’ont ressenti aucune douleur à aucun moment de la procédure.
1. Préparation pré-opératoire
- Stérilisation des instruments
- Stériliser les instruments chirurgicaux à la vapeur dans un autoclave (121 °C pendant 15 min) avant l’opération. Préparez suffisamment de sutures et d’aiguilles jetables.
- Mise en place d’une plate-forme chirurgicale
- Effectuez l’intervention chirurgicale dans une salle dédiée aux interventions chirurgicales. Attribuez une surface de banc d’au moins 60 cm x 60 cm pour l’opération. Nettoyez la surface de la zone avec de l’alcool à 75 % et couvrez-la d’une serviette médicale jetable, puis désinfectez-la avec un rayonnement ultraviolet 30 minutes à l’avance (Figure 1A).
- Préparation des animaux
- Hébergez tous les animaux dans une pièce à température contrôlée (20-25 °C) avec un cycle de lumière de 12 h et un cycle d’obscurité de 12 h. Acclimater les souris femelles C57BL/6 âgées de 8 semaines à l’installation d’hébergement pendant 1 semaine avant la chirurgie.
- Pesez les souris avant la chirurgie. Administrer toutes les souris femelles de 9 semaines sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (280 mg/kg), pour obtenir une absence de douleur à n’importe quel stade de la procédure. Injecter du méloxicam (2 mg/kg) par voie sous-cutanée, environ 1 h avant une intervention pour soulager la douleur.
- Appliquez une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse cornéenne pendant la chirurgie.
- Appliquez la lotion dépilatoire sur le dos à l’aide d’un coton-tige propre. Laissez la lotion reposer sur une souris pendant 3 à 5 minutes, puis retirez les poils à l’aide de gaze et de cotons-tiges. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les poils aient été retirés de l’arrière de la souris.
- Utilisez de la gaze et des cotons-tiges pour nettoyer la peau avec de l’alcool à 75 %. Fixez la souris sur la plate-forme chirurgicale à l’aide d’une bande de caoutchouc ou d’une corde de coton (Figure 1B) et appliquez une solution d’iodophore pour nettoyer le dos.
REMARQUE : Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement des orteils avant l’ovavariectomie.
2. Ovariectomie
REMARQUE : Le tribromoéthanol peut être maintenu pendant environ 30 minutes, en veillant à ce que la chirurgie soit terminée autant que possible.
- Faites une incision dorsale de ~1,0 cm longitudinalement de la base de la cuisse vers le haut à l’aide d’un scalpel jetable, en veillant à ce que seules la peau et le fascia sous-cutané soient incisés et en évitant de couper dans le péritoine postérieur à ce moment-là.
- Tirez l’incision vers la gauche et un coussinet adipeux blanc peut être vu. Coupez ~0,5 cm le long du coussinet adipeux blanc pour exposer la cavité intrapéritonéale à l’aide de micro-pinces et de ciseaux.
- Après avoir coupé le péritoine postérieur, retirez lentement et délicatement le coussinet adipeux blanc de la cavité intrapéritonéale à l’aide d’une micro-pince. Humidifiez immédiatement le tissu adipeux blanc avec 0,9% de solution saline stérile à l’extérieur de la gaze imbibée. Gardez les tissus exposés toujours humidifiés à l’extérieur de la cavité abdominale.
- Une substance granuleuse rose, à savoir l’ovaire, est attachée à la partie inférieure du coussinet adipeux blanc (Figure 2A). Les ovaires sont reliés à un canal mince, à savoir l’utérus. Utilisez des sutures résorbables 5-0 pour ligaturer l’extrémité ovarienne de l’utérus et retirer l’ovaire gauche (Figure 2B).
- Lors de l’ablation d’un ovaire, préservez autant que possible le tissu adipeux environnant. Éviter le contact direct entre les instruments chirurgicaux et les ovaires et empêcher l’implantation intrapéritonéale du tissu ovarien.
- Replacez soigneusement le coussinet adipeux blanc dans la cavité intrapéritonéale. Effectuer une suture intermittente simple sur le péritoine postérieur avec une suture résorbable 5-0 (Figure 2C). Une fois la suture terminée, nettoyez tout saignement avec de la gaze stérile imbibée de solution saline à 0,9 %.
- Tirez l’incision cutanée vers la droite et retirez l’ovaire droit en utilisant la même méthode.
- Effectuez une suture intermittente avec des sutures non résorbables 4-0 et nettoyez tout saignement avec de la gaze stérile imbibée de solution saline à 0,9 % (Figure 2D).
- Nettoyez la plaie avec une solution d’iodophore après avoir terminé les deux sutures. Injecter par voie intrapéritonéale des antibiotiques à large spectre.
3. Observation post-opératoire
- Déplacez les souris dans une couverture à température constante de 37 °C après l’opération. Jusqu’à ce que les souris puissent se déplacer librement, gardez-les dans leur cage individuelle. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir sa position couchée sternale.
- Injecter du méloxicam (2 mg/kg) par voie sous-cutanée 24 h après l’opération pour soulager la douleur.
- Surveillez les souris quotidiennement pour vous assurer que la plaie chirurgicale cicatrise correctement sans aucun signe de complication (déhiscence).
4. Supplémentation en œstradiol
- Préparez des aliments complétés par du valérate d’estradiol. Utiliser 2,6 mg de bêta-estradiol 17-valérate complété par 1 kg d’aliment.
- 3 jours après la fin de la chirurgie, nourrissez les souris avec du valérate d’estradiol.
5. Injection de FSH
- Préparer une solution de FSH humaine recombinante. Dissoudre la poudre de FSH humaine recombinante pour injection avec une solution saline stérile à 0,9 % à 100 UI/mL.
- Regrouper les souris selon les plans expérimentaux et leur administrer du solvant ou différentes doses de FSH recombinante par injection intrapéritonéale pendant 2 semaines. En fonction de l’activité biologique de la FSH recombinante, utiliser la dose injectable de FSH chez la souris équivalente au taux sérique de FSH chez la femme pendant la période de transition ménopausique.
REMARQUE : Sur la base de différents traitements, les souris ovariectomisées supplémentées en œstrogènes ont été divisées au hasard en trois groupes, le groupe solvant (N.S.) recevant 100 μL/jour de solvant, le groupe à faible dose de FSH (L-FSH) recevant 15 UI/kg de poids corporel par jour et le groupe à forte dose de FSH (H-FSH) recevant 30 UI/kg de poids corporel par jour.
Representative Results
Le modèle murin OVF imite le stade précoce de la transition vers la ménopause avec des œstrogènes relativement stables et des niveaux de FSH en hausse13. Tout d’abord, pour la chirurgie d’ablation des ovaires, des souris femelles C57BL/6 âgées de 9 semaines ont reçu une anesthésie générale et ont été soumises à une opération fictive (Sham) ou à une ovariectomie bilatérale (OVX). Comme les images de frottis des cellules colorées par Papanicolaou ont clairement identifié les stades de l’œstrus, de l’œstrus, du métesterus et du diestrus du cycle œstral, les souris OVX ont perdu le cycle œstral (Figure 3A) et la méthode ELISA a montré une diminution significative des taux sériques d’œstradiol (E2) (Figure 3B). Deuxièmement, les souris OVX ont été supplémentées avec du bêta-estradiol 17-valérate (OVX + E2) pour maintenir l’œstrogène sérique au même niveau que le groupe Sham. Troisièmement, les souris OVX + E2 ont reçu du solvant (NS) ou différentes doses de FSH recombinante par injection intrapéritonéale pour créer un modèle murin (OVF) caractérisé par des taux d’œstrogènes relativement stables et une augmentation des taux de FSH (Figure 4).
Graphique 1. Environnement chirurgical et posture de la souris. (A) Une surface de paillasse d’au moins 60 cm x 60 cm pour l’opération. Nettoyez la surface de la zone avec de l’alcool à 75% et couvrez-la d’une serviette médicale jetable, puis désinfectez-la aux rayons ultraviolets 30 min à l’avance. (B) Fixez la souris sur la plate-forme chirurgicale à l’aide d’une bande de caoutchouc ou d’une corde de coton. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Les étapes clés de l’opération chirurgicale. (A) position ovarienne, (B) ovariectomie, (C) suture péritoine et (D) incision cutanée de suture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Cytologie vaginale. La cytologie vaginale représente les étapes du cycle œstral et de l’œstrogène endogène chez les souris ovariectomisées (OVX) et les souris opérées simulées (Sham ; n = 12 pour le groupe Sham ; n = 10 pour les groupes OVX). (A) La cytologie vaginale représente les étapes du cycle œstral en fonction de la présence relative de leucocytes, de cellules épithéliales cornées et de cellules épithéliales nucléées. Les stades de l’œstrus comprennent l’œstrus, la prédominance des cellules épithéliales nucléées ; œstrus, la prédominance des cellules cornées énucléées ; metestrus, la présence de leucocytes et de cellules épithéliales cornées et nucléées ; diestrus, la prédominance des leucocytes. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Œstrogène endogène chez les souris ovariectomisées (OVX) et les souris opérées simulées (Sham). Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± SEM. Le test t de Student est utilisé pour l’analyse statistique. p< 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Modèle OVF et taux d’hormones sériques. (A) Modèle OVF à organigramme. (B) Analyse ELISA des concentrations sériques d’œstrogènes (E2) et de FSH. Les données sont représentées sous la forme de la moyenne ± MEB. L’ANOVA à un facteur a été utilisée pour l’analyse statistique. * p< 0,05 et ** p< 0,01. Ce chiffre a été modifié de4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Lors de la transition d’une phase reproductive à une phase non reproductive (ménopause), de nombreuses femmes subissent des changements physiologiques et pathologiques importants. Les niveaux de FSH augmentent pendant la transition ménopausique1. De nouvelles études ont révélé que la FSH dans divers tissus et organes extragonadiques est essentielle à la pathogenèse de plusieurs maladies, notamment la dyslipidémie4, la maladie d’Alzheimer5, l’ostéoporose 9,10, l’athérosclérose11, l’obésité9 et le cancer12. Ainsi, la construction d’un modèle animal qui peut aider à étudier les effets indépendants de la FSH in vivo est particulièrement importante. Le modèle murin OVF imite le stade précoce de la transition de la ménopause avec des niveaux d’œstrogènes relativement stables et des niveaux croissants de FSH et est particulièrement adapté aux études visant à explorer les actions extragonadiques de la FSH.
Dans cette méthode, l’ovariectomie a été réalisée à l’aide d’une seule incision dorsale en arrière, à environ 1 cm de la base de la cuisse vers le haut (Figure 1B). La peau a été coupée presque en même temps que les muscles dorsaux à l’aide de ciseaux de dissection tranchants, et la cavité péritonéale a ainsi été accessible. Après l’opération, l’incision musculaire n’a pas nécessité de suture et la plaie cutanée a été fermée bilatéralement avec une suture en boyau de chat (Figure 2). L’opération est techniquement plus facile, prend moins de temps et est moins nocive pour les souris femelles par rapport aux autres méthodes utilisées.
Quelques détails qui doivent être pris en compte lors de la procédure chirurgicale. Tout d’abord, toutes les interventions chirurgicales doivent être maintenues propres et aussi stériles que possible pour réduire le risque d’infection postopératoire. Deuxièmement, parce que le tissu ovarien est très fragile, les instruments chirurgicaux ne peuvent pas entrer en contact direct avec les ovaires pendant l’ovariectomie, afin d’éviter l’implantation intrapéritonéale. Troisièmement, après l’opération, les souris ont été déplacées dans une couverture à température constante de 37 °C pendant la convalescence afin d’éviter une hypothermie postopératoire entraînant la mort.
Une étude antérieure a prouvé que l’œstrogène endogène est synthétisé dans les cellules de la thèque ovarienne des femmes préménopausées ou dans les cellules stromales adipeuses du sein des femmes ménopausées et en quantités mineures dans les tissus périphériques14. L’œstrogène sérique a fortement chuté chez les souris ovariectomisées mais ne peut pas être éliminé (Figure 3B). Cependant, l’œstrogène endogène synthétisé dans le tissu extragonadique n’affecte pas la stabilité des niveaux d’œstrogènes dans le modèle OVF (Figure 4B).
Il y a certaines limitations dans le modèle OVF. Une fois que l’opération chirurgicale n’est pas prudente et conduit à l’implantation intrapéritonéale ovarienne, elle peut conduire à l’échec du modèle. Dans ce cas, l’œstrogène sérique ne chute pas fortement et fluctue au cours des différentes étapes du cycle œstral. Après l’administration exogène d’œstrogènes et de FSH, il faut environ 1 semaine pour que le corps atteigne l’équilibre. Ainsi, les changements pathologiques du modèle OVF qui se produisent dans un délai d’une semaine ne peuvent pas indiquer les effets de la FSH.
En conclusion, le modèle OVF présente les avantages d’être stable, peu coûteux et facile à utiliser. Les effets systémiques d’un taux élevé de FSH peuvent être observés après l’injection intrapéritonéale de FSH ; c’est-à-dire que le modèle OVF convient aux études qui explorent les actions extragonadiques de la FSH. Cependant, les exigences pour la chirurgie modèle et les procédures d’injection intrapéritonéale sont assez élevées. Si le financement est suffisant, des modèles d’élimination spécifiques sont le meilleur choix.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le laboratoire animalier de l’hôpital provincial du Shandong pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 82101645), la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong, Chine (ZR2020QH088), et le Plan de soutien à la science et à la technologie pour l’innovation des jeunes dans les collèges de la province du Shandong (2021KJ051).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
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