Summary
Çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda folikül stimüle edici hormon (FSH) birçok hastalığın patogenezi ile ilişkilidir. Yumurtalıklı ve FSH ile tedavi edilmiş fare modeli (OVF), FSH'nin ekstragonadal etkilerini araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Üreme aşamasından üreme dışı aşamaya (menopoz) geçiş sırasında, birçok kadın azalmış kemik kütlesi, artmış kan lipitleri ve artmış viseral yağlanma dahil olmak üzere önemli fizyolojik ve patolojik değişiklikler yaşar. Menopoz geçişi sırasında folikül uyarıcı hormon (FSH) seviyeleri yükselir. Birçok çalışma, çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda FSH'nin çoklu hastalıkların patogenezi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, FSH'nin in vivo bağımsız etkilerini incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak özellikle önemlidir. Bu çalışmada, hipotalamik-hipofiz-gonadal eksenin etkisini ortadan kaldırmak için C57BL/6 dişi fareler yumurtalıktan çıkarıldı ve estradiol valerat (OVX + E2) ile desteklendi. OVX + E2 fareleri, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri ile karakterize edilen bir fare modeli (OVF) oluşturmak için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla çözücü (NS) veya farklı dozlarda rekombinant FSH aldı. Bu nedenle, yüksek serum FSH seviyeleri ile karakterize edilen menopoz geçişinin erken aşamasını taklit etmek için deneysel bir fare modelini başarıyla oluşturduk. OVF modeli, FSH'nin ekstragonadal etkilerini keşfetmeye yönelik çalışmalar için uygun olan kararlı, düşük maliyetli ve kullanımı kolay olma avantajlarına sahiptir. Burada, fare OVF modeli için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz.
Introduction
Menopoz geçişi sırasında folikül uyarıcı hormon (FSH) düzeyleri yükselir (menopozal geçiş terimi 2011 yılında üreme yaşlanması evrelerinde tanımlanmıştır atölye (STRAW) + 10 sistemi)1. Yükselen FSH seviyeleri ve nispeten stabil östrojen1 ile karakterize edilen bir dönem olan menopoz geçişi sırasında, kadınlar adet döngüsü değişiklikleri ve çeşitli hücre ve dokuları içeren önemli fizyolojik değişiklikler yaşarlar. Bu değişiklikler kadınların yaşam kalitesini ve sağlığını ciddi şekilde etkileyebilir. FSH'nin etkilerini araştırmak, kadınların yaşam kalitesini ve sağlığını iyileştirebilir.
FSH, ön hipofizdeki gonadotrop hücrelerinden salgılanır ve gonadal fonksiyon ve üremenin kontrolünde kritik öneme sahiptir2. FSH'nin işlevine, G proteinine bağlı reseptöre (GPCR) ait olan FSH reseptörü (FSHR) aracılık eder.3. FSHR genellikle gonadlarda, yani yumurtalık ve testiste ifade edilir. FSHR'nin karaciğer4, hipokampus5, osteoklastlar6, adipositler7 ve endotel hücreleri8 dahil olmak üzere çoklu ekstragonadal hücre ve dokularda evrensel olarak eksprese edildiği kanıtlanmıştır. Ortaya çıkan çalışmalar, FSH'nin ekstra gonadal etkilerini ve dislipidemi4, Alzheimer hastalığı5, osteoporoz 9,10, ateroskleroz11, obezite9 ve kanser12'deki potansiyel klinik önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, FSH'nin bağımsız etkilerini in vivo olarak incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak, tek başına FSH'nin etkilerini araştırmak için özellikle önemlidir.
Protokolde, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri13 ile bir fare modeli oluşturma prosedürünü tanıttık. Fare modeli, yumurtalık cerrahisi ile menopoz geçişini taklit eder ve daha sonra estradiol valerat ve rekombinant FSH ile desteklenir. Yumurtalıklı fareler, sahte olarak çalıştırılan farelerle benzer östrojen seviyelerini korumak için eksojen östrojen ile desteklendiğinden, hipofiz bezindeki östrojen geri bildirimi nedeniyle endojen FSH seviyeleri stabildi. Bu durumda, östrojen seviyelerini değiştirmeden eksojen FSH uygulayarak FSH seviyelerini kontrol edebilir. Böylece, OVF fare modeli östrojenin etkisini dışlayabilir ve FSH'nin ekstragonadal fizyolojik ve patolojik etkilerini gözlemleyebilir. Ayrıntılı ve görselleştirilmiş prosedürün, araştırmacıların laboratuvarlarında OVF fare modelini oluşturmaları ve gerektiğinde menopoz geçişi sırasındaki fizyolojik ve patolojik değişiklikleri araştırmak için uygulamaları için yararlı olduğuna inanıyoruz.
Protocol
Aşağıdaki protokol, araştırma hayvanlarının kullanımına ilişkin tüm kurumsal etik yönergelere uygundur ve Çin'deki Shandong İl Hastanesi'ndeki Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi manipülasyonlar derin anestezi altında yapıldı ve hayvanlar işlem sırasında hiçbir aşamada ağrı hissetmedi.
1. Operasyon öncesi hazırlık
- Alet sterilizasyonu
- Ameliyattan önce cerrahi aletleri bir otoklavda (15 dakika boyunca 121 ° C) buharla sterilize edin. Yeterli miktarda tek kullanımlık dikiş ve iğne hazırlayın.
- Ameliyat platformu kurulumu
- Ameliyatı cerrahi prosedürlere ayrılmış bir odada gerçekleştirin. İşlem için en az 60 cm x 60 cm'lik bir tezgah alanı atayın. Alanın yüzeyini %75 alkol ile temizleyin ve tek kullanımlık bir tıbbi havlu ile örtün ve ardından 30 dakika önceden ultraviyole radyasyonla dezenfekte edin (Şekil 1A).
- Hayvan hazırlama
- Tüm hayvanları sıcaklık kontrollü bir odada (20-25 °C) 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık döngüde barındırın. 8 haftalık dişi C57BL/6 fareleri ameliyattan önce 1 hafta boyunca barınma tesisine alıştırmak.
- Ameliyattan önce fareleri tartın. İşlem sırasında herhangi bir aşamada ağrısızlık elde etmek için 9 haftalık tüm dişi fareleri intraperitoneal Tribromoetanol (280 mg / kg) enjeksiyonu ile genel anestezi ile uygulayın. Ağrıyı hafifletmek için ameliyattan yaklaşık 1 saat önce deri altına meloksikam (2 mg / kg) enjekte edin.
- Ameliyat sırasında kornea kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.
- Temiz bir pamuklu çubuk kullanarak sırtınıza epilasyon losyonu uygulayın. Losyonu 3-5 dakika farenin üzerinde bekletin, ardından gazlı bez ve pamuklu çubuklarla tüyleri alın. Farenin arkasındaki tüm tüyler alınana kadar bu adımı tekrarlayın.
- Cildi% 75 alkolle temizlemek için gazlı bez ve pamuklu çubuk kullanın. Fareyi lastik bir şerit veya pamuk ip kullanarak ameliyat platformuna sabitleyin (Şekil 1B) ve sırtını temizlemek için iyodofor solüsyonu uygulayın.
NOT: Ovariektomiden önce anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma ile onaylayın.
2. Yumurtalık ameliyatı
NOT: Tribromoetanol yaklaşık 30 dakika muhafaza edilerek ameliyatın mümkün olduğunca tamamlanması sağlanabilir.
- Tek kullanımlık bir neşter kullanarak uyluk tabanından yukarıya doğru uzunlamasına ~1.0 cm'lik bir dorsal kesi yapın, sadece cilt ve deri altı fasyanın kesildiğinden emin olun ve bu sırada posterior peritonu kesmekten kaçının.
- Kesi sola doğru çekildiğinde beyaz bir yağ yastığı görülebilir. Mikro forseps ve makas kullanarak intraperitoneal boşluğu ortaya çıkarmak için beyaz yağ yastığı boyunca ~ 0.5 cm kesin.
- Posterior peritonu kestikten sonra, beyaz yağ yastığını mikro forseps ile intraperitoneal boşluktan yavaşça ve nazikçe çıkarın. Beyaz yağ dokusunu hemen ıslatılmış gazlı bezin dışında% 0.9 steril salin ile nemlendirin. Karın boşluğunun dışındayken açıkta kalan dokuyu daima nemli tutun.
- Beyaz yağ yastığının alt kısmına pembe granüler bir madde yani yumurtalık eklenir (Şekil 2A). Yumurtalıklar ince bir kanala yani rahime bağlıdır. Uterusun yumurtalık ucunu bağlamak ve sol yumurtalığı çıkarmak için 5-0 emilebilir sütürler kullanın (Şekil 2B).
- Bir yumurtalığı çıkarırken, çevredeki yağ dokusunu mümkün olduğunca koruyun. Cerrahi aletler ve yumurtalıklar arasında doğrudan temastan kaçının ve yumurtalık dokusunun intraperitoneal implantasyonunu önleyin.
- Beyaz yağ yastığını dikkatlice intraperitoneal boşluğa geri yerleştirin. Posterior peritonda 5-0 emilebilir sütür ile basit bir aralıklı sütür uygulayın (Şekil 2C). Dikiş tamamlandıktan sonra, kanamaları %0,9 steril tuzlu suya batırılmış gazlı bezle temizleyin.
- Cilt kesisini sağa doğru çekin ve aynı yöntemi kullanarak sağ yumurtalığı çıkarın.
- 4-0 emilmeyen dikişlerle aralıklı dikiş atın ve kanamaları %0.9 steril tuzlu suya batırılmış gazlı bezle temizleyin (Şekil 2D).
- Her iki dikişi de tamamladıktan sonra yarayı bir iyodofor solüsyonu ile temizleyin. İntraperitoneal olarak geniş spektrumlu antibiyotikler enjekte edilir.
3. Operasyon sonrası gözlem
- Ameliyattan sonra fareleri 37 °C sabit sıcaklıktaki bir battaniyeye taşıyın. Fareler serbestçe hareket edene kadar, hayvanları kendi kafeslerinde tutun. Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
- Ağrıyı hafifletmek için ameliyattan 24 saat sonra deri altına meloksikam (2 mg/kg) enjekte edin.
- Cerrahi yaranın herhangi bir komplikasyon belirtisi (ayrışma) olmadan düzgün bir şekilde iyileştiğinden emin olmak için fareleri günlük olarak izleyin.
4. Estradiol takviyesi
- Estradiol valerat ile desteklenmiş yem hazırlayın. 1 kg yem başına takviye edilmiş 2.6 mg beta-estradiol 17-valerat kullanın.
- Ameliyatın tamamlanmasından 3 gün sonra, fareleri estradiol valerat ile besleyin.
5. FSH enjeksiyonu
- Rekombinant insan FSH çözeltisi hazırlayın. Enjeksiyon için rekombinant insan FSH tozunu 100 IU / mL'ye kadar% 0.9 steril salin ile çözün.
- Fareleri deney planlarına göre gruplandırın ve 2 hafta boyunca intraperitoneal enjeksiyon yoluyla çözücü veya farklı dozlarda rekombinant FSH verin. Rekombinant FSH'nin biyolojik aktivitesine göre, menopoz geçiş döneminde kadınlarda serum FSH seviyesine eşdeğer farelerde FSH enjeksiyon dozunu kullanın.
NOT: Farklı tedavilere dayanarak, yumurtalıklı östrojen takviyeli fareler rastgele üç gruba ayrıldı, 100 μL / gün çözücü alan çözücü (NS) grubu, günde 15 IU / kg vücut ağırlığı alan düşük doz FSH (L-FSH) grubu ve günde 30 IU / kg vücut ağırlığı alan yüksek doz FSH (H-FSH) grubu.
Representative Results
OVF fare modeli, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri13 ile menopoz geçişinin erken aşamasını taklit eder. İlk olarak, yumurtalık çıkarma ameliyatı için 9 haftalık dişi C57BL / 6 farelerine genel anestezi uygulandı ve sahte bir operasyona (Sham) veya bilateral overektomiye (OVX) tabi tutuldu. Papanicolaou boyalı hücrelerin smear görüntüleri, östrus döngüsünün proöstrus, östrus, metestus ve diestrus aşamalarını açıkça tanımladığından, OVX fareleri östrus döngüsünü kaybetti (Şekil 3A) ve ELISA yöntemi serum estradiol (E2) seviyelerinde önemli bir azalma gösterdi (Şekil 3B). İkincisi, OVX fareleri, serum östrojenini Sham grubuyla aynı seviyede tutmak için beta-estradiol 17-valerat (OVX + E2) ile desteklendi. Üçüncüsü, OVX + E2 fareleri, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri ile karakterize edilen bir fare modeli (OVF) oluşturmak için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla çözücü (NS) veya farklı dozlarda rekombinant FSH aldı (Şekil 4).
Şekil 1. Cerrahi ortam ve fare duruşu. (A) Operasyon için en az 60 cm x 60 cm'lik bir tezgah alanı. Alanın yüzeyini %75 alkol ile temizleyin ve tek kullanımlık tıbbi havlu ile örtün ve ardından 30 dakika önceden ultraviyole radyasyonla dezenfekte edin. (B) Fareyi lastik bir şerit veya pamuk ip kullanarak ameliyat platformuna sabitleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Cerrahi operasyonun temel adımları. (A) Yumurtalık pozisyonu, (B) ovariektomi, (C) sütür peritonu ve (D) sütür cilt kesisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Vajinal sitoloji. Vajinal sitoloji, yumurtalıklı farelerde (OVX) ve sahte olarak işletilenlerde östrus döngüsünün ve endojen östrojenin aşamalarını temsil eder (Sham; Sham grubu için n = 12; OVX grupları başına n = 10). (A) Vajinal sitoloji, lökositlerin, kornifiye epitel hücrelerinin ve çekirdekli epitel hücrelerinin göreceli varlığına göre östrus döngüsünün aşamalarını temsil eder. Kızgınlığın aşamaları arasında proöstrus, çekirdekli epitel hücrelerinin baskınlığı; östrus, enükleasyonlu kornifiye hücrelerin baskınlığı; metestrus, lökositlerin varlığı ve kornifiye ve çekirdekli epitel hücreleri; diestrus, lökositlerin baskınlığı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Yumurtalıklı farelerde (OVX) ve sahte olarak çalıştırılanlarda (Sham) endojen östrojen. Veriler SEM'± ortalaması olarak gösterilir. İstatistiksel analiz için Student t-testi kullanılmıştır. p< 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. OVF modeli ve serum hormon seviyeleri. (A) Akış şeması OVF modeli. (B) Serum östrojen (E2) ve FSH konsantrasyonlarının ELISA analizi. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterildi. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi kullanıldı. * p< 0.05 ve ** p< 0.01. Bu rakam4'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Üreme aşamasından üreme dışı faza (menopoz) geçiş sırasında, birçok kadın önemli fizyolojik ve patolojik değişiklikler yaşar. Menopoz geçişi sırasında FSH seviyeleri yükselir1. Ortaya çıkan çalışmalar, çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda FSH'nin dislipidemi4, Alzheimer hastalığı5, osteoporoz 9,10, ateroskleroz11, obezite9 ve kanser12 dahil olmak üzere birçok hastalığın patogenezinde kritik olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, FSH'nin in vivo bağımsız etkilerini incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak özellikle önemlidir. OVF fare modeli, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri ile menopoz geçişinin erken aşamasını taklit eder ve özellikle FSH'nin ekstragonadal etkilerini keşfetmeye yönelik çalışmalar için uygundur.
Bu yöntemde ovarektomi, uyluk tabanından yukarıya doğru yaklaşık 1 cm olacak şekilde tek bir sırt sırtı kesisi kullanılarak yapıldı (Şekil 1B). Deri, keskin diseksiyon makası kullanılarak dorsal kaslarla neredeyse birlikte kesildi ve böylece periton boşluğuna erişildi. Ameliyat sonrası kas insizyonu dikiş gerektirmedi ve cilt yarası bilateral olarak tek katgüt sütür ile kapatıldı (Şekil 2). Operasyon, kullanılan diğer yöntemlere kıyasla teknik olarak daha kolay, daha az zaman alıcı ve dişi fareler için daha az zararlıdır.
Ameliyat işlemi sırasında dikkat edilmesi gereken bazı detaylar. İlk olarak, ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için tüm cerrahi prosedürler temiz ve mümkün olduğunca steril tutulmalıdır. İkincisi, yumurtalık dokusu çok kırılgan olduğundan, intraperitoneal implantasyonu önlemek için cerrahi aletler yumurtalıklara doğrudan temas edemez. Üçüncüsü, ameliyattan sonra, postoperatif hipoterminin ölüme yol açmasını önlemek için fareler iyileşme sırasında 37 °C sabit sıcaklıktaki bir battaniyeye taşındı.
Daha önceki bir çalışma, endojen östrojenin premenopozal kadınların yumurtalık teka hücrelerinde veya postmenopozal kadınların memenin adipoz stromal hücrelerinde ve periferik dokuda küçük miktarlarda sentezlendiğini kanıtlamıştır14. Serum östrojeni, yumurtalıklı fareler için keskin bir şekilde düştü, ancak elimine edilemez (Şekil 3B). Bununla birlikte, ekstragonadal dokuda sentezlenen endojen östrojen, OVF modelinde östrojen seviyelerinin stabilitesini etkilemez (Şekil 4B).
OVF modelinde bazı sınırlamalar vardır. Cerrahi operasyon dikkatli olmadığında ve yumurtalık intraperitoneal implantasyonuna yol açtığında, model başarısızlığına yol açabilir. Bu durumda, serum östrojeni keskin bir şekilde düşmez ve östrus döngüsünün farklı aşamalarında dalgalanır. Östrojen ve FSH'nin eksojen uygulamasından sonra vücudun dengeye ulaşması yaklaşık 1 hafta sürer. Bu nedenle, 1 hafta içinde meydana gelen OVF modelinin patolojik değişiklikleri FSH'nin etkilerini gösteremez.
Sonuç olarak, OVF modeli istikrarlı, düşük maliyetli ve kullanımı kolay olma avantajlarına sahiptir. Yüksek seviyeli FSH'nin sistemik etkileri, FSH'nin intraperitoneal enjeksiyonundan sonra gözlenebilir; yani, OVF modeli, FSH'nin ekstragonadal etkilerini araştıran çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, model cerrahi ve intraperitoneal enjeksiyon prosedürleri için gereksinimler oldukça yüksektir. Finansman yeterliyse, belirli nakavt modelleri en iyi seçimdir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Teknik destek için Shandong İl Hastanesi hayvan laboratuvarına teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 82101645), Çin'in Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2020QH088) ve Shandong Eyaletindeki Kolejlerin Gençlik İnovasyonu için Bilim ve Teknoloji Destek Planı (2021KJ051) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
