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Behavior

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Apresenta-se um protocolo de triagem de drogas de alto rendimento para melhorar o sono por meio do monitoramento do comportamento do sono de moscas-das-frutas em um modelo idoso de Drosophila .

Abstract

O sono, um componente essencial da saúde e do bem-estar geral, frequentemente apresenta desafios para indivíduos mais velhos que frequentemente experimentam distúrbios do sono caracterizados por duração do sono encurtada e padrões fragmentados. Essas interrupções do sono também se correlacionam com um aumento do risco de várias doenças em idosos, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e distúrbios psicológicos. Infelizmente, as drogas existentes para distúrbios do sono estão associadas a efeitos colaterais significativos, como comprometimento cognitivo e dependência. Consequentemente, o desenvolvimento de medicamentos novos, mais seguros e mais eficazes para distúrbios do sono é urgentemente necessário. No entanto, o alto custo e a longa duração experimental dos métodos atuais de triagem de drogas permanecem como fatores limitantes.

Este protocolo descreve um método de triagem custo-efetivo e de alto rendimento que utiliza Drosophila melanogaster, uma espécie com um mecanismo de regulação do sono altamente conservado em comparação com mamíferos, tornando-se um modelo ideal para o estudo de distúrbios do sono em idosos. Ao administrar vários pequenos compostos a moscas envelhecidas, podemos avaliar seus efeitos sobre os distúrbios do sono. Os comportamentos de sono dessas moscas são registrados usando um dispositivo de monitoramento infravermelho e analisados com o pacote de dados de código aberto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Esse protocolo oferece uma abordagem de rastreamento eficiente e de baixo custo, reprodutível e eficiente para a regulação do sono. As moscas-das-frutas, devido ao seu curto ciclo de vida, baixo custo de criação e facilidade de manuseio, servem como excelentes objetos para este método. A título de ilustração, a Reserpina, uma das drogas testadas, demonstrou a capacidade de promover a duração do sono em moscas idosas, destacando a eficácia desse protocolo.

Introduction

O sono, um dos comportamentos essenciais necessários para a sobrevivência humana, é caracterizado por dois estados principais: sono de movimento rápido dos olhos (REM) e sono NREM (non-rapid eye movement)1. O sono NREM é composto por três estágios: N1 (transição entre vigília e sono), N2 (sono leve) e N3 (sono profundo, sono de ondas lentas), representando a progressão da vigília para o sono profundo1. O sono desempenha um papel crucial na saúde física e mental2. No entanto, o envelhecimento reduz a duração total do sono, a eficiência do sono, a porcentagem de sono de ondas lentas e a porcentagem de sono REM em adultos3. Indivíduos mais velhos tendem a passar mais tempo em sono leve em comparação com o sono de ondas lentas, tornando-os mais sensíveis a despertares noturnos. À medida que o número de despertares aumenta, o tempo médio de sono diminui, resultando em um padrão de sono fragmentado nos idosos, o que pode estar associado à excitação excessiva dos neurônios Hcrt em camundongos4. Além disso, declínios nos mecanismos circadianos relacionados à idade contribuem para uma mudança mais precoce na duração do sono 5,6. Esses fatores, associados a doenças físicas, estresse psicológico, fatores ambientais e uso de medicamentos, tornam os idosos mais suscetíveis a distúrbios do sono, como insônia, distúrbio comportamental do sono REM, narcolepsia, movimentos periódicos das pernas, síndrome das pernas inquietas e distúrbios respiratórios do sono 7,8.

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que os distúrbios do sono estão intimamente ligados a doenças crônicas em idosos9, incluindo depressão 10, doenças cardiovasculares11 e demência12. A abordagem dos distúrbios do sono desempenha um papel crucial na melhoria e tratamento de doenças crônicas e na melhoria da qualidade de vida dos idosos. Atualmente, os pacientes dependem principalmente de drogas como benzodiazepínicos, não-benzodiazepínicos e agonistas dos receptores de melatonina para melhorar a qualidade do sono13. No entanto, os benzodiazepínicos podem levar à diminuição dos receptores e dependência após o uso prolongado, causando sintomas graves de abstinência após a descontinuação14,15. Drogas não benzodiazepínicas também apresentam riscos, incluindo demência16, fraturas17 e câncer18. O agonista comumente usado do receptor de melatonina, o ramelteon, reduz a latência do sono, mas não aumenta a duração do sono e tem preocupações relacionadas à função hepática devido à extensa eliminação de primeira passagem19. A agomelatina, um agonista do receptor de melatonina e antagonista do receptor de serotonina, melhora a insônia relacionada à depressão, mas também representa um risco de dano hepático20. Consequentemente, há uma necessidade urgente de medicamentos mais seguros para tratar ou aliviar distúrbios do sono. No entanto, as estratégias atuais de triagem de fármacos, baseadas em experimentos moleculares e celulares combinados com sistemas automatizados e análises computacionais, são caras e demoradas21. Estratégias de planejamento de fármacos baseadas na estrutura, baseadas na estrutura e propriedades do receptor, requerem uma compreensão clara da estrutura tridimensional do receptor e carecem de capacidade preditiva para os efeitos do fármaco22.

Em 2000, com base nos critérios de sono propostos por Campbell e Tobler em 198423, pesquisadores estabeleceram modelos animais simples para estudar o sono 24, incluindo Drosophila melanogaster, que exibia estados semelhantes aos do sono25,26. Apesar das diferenças anatômicas entre Drosophila e humanos, muitos componentes neuroquímicos e vias de sinalização que regulam o sono em Drosophila são conservados no sono de mamíferos, facilitando o estudo de doenças neurológicas humanas27,28. Drosophila também é extensivamente utilizada em estudos do ritmo circadiano, apesar das diferenças nos osciladores centrais entre moscas e mamíferos 29,30,31. Portanto, Drosophila serve como um organismo modelo valioso para estudar o comportamento do sono e conduzir a triagem de drogas relacionadas ao sono.

Este estudo propõe uma abordagem baseada em fenótipo simples e custo-efetiva para a triagem de drogas de pequenas moléculas para tratar distúrbios do sono usando moscas envelhecidas. A regulação do sono em Drosophila é altamente conservada25, e o declínio do sono observado com a idade pode ser reversível através da administração de medicamentos. Assim, esse método de rastreamento baseado no fenótipo do sono pode refletir intuitivamente a eficácia da droga. Alimentamos as moscas com uma mistura do fármaco investigado com a alimentação, monitoramos e registramos o comportamento do sono usando o Drosophila Activity Monitor (DAM)32 e analisamos os dados adquiridos usando o pacote de dados de SCAMP2020 de código aberto no MATLAB (Figura 1). A análise estatística é realizada por meio de softwares estatísticos e gráficos (ver Tabela de Materiais). Como exemplo, demonstramos a efetividade desse protocolo apresentando dados experimentais sobre a Reserpina, uma pequena molécula inibidora do transportador vesicular de monoamina que aumenta o sono33. Este protocolo fornece uma abordagem valiosa para identificar medicamentos para o tratamento de problemas de sono relacionados à idade.

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Protocol

Este protocolo usa as moscas w1118 de 30 dias do Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, ver Tabela de Materiais).

1. Preparação das moscas-das-frutas envelhecidas

  1. Preparo de alimentos
    1. Prepare o meio de cultura padrão de amido de milho misturando 50 g/L de flocos de milho, 110 g/L de açúcar, 5 g/L de ágar e 25 g/L de levedura. Aqueça os flocos de milho e o fermento com água para gelatinizar e, em seguida, dissolva totalmente todas as substâncias.
    2. Quando o meio arrefecer a 50-60 °C, adicionar 6 mL/L de ácido propiônico e embalá-los imediatamente em frascos de cultura.
  2. Criação de moscas e preparação de moscas envelhecidas
    1. Criar a mosca cepa w1118em frascos contendo um meio de cultura padrão de amido de milho e colocar os frascos em uma incubadora de temperatura constante a 25° C, 68% de umidade relativa, condições de iluminação de 500-1000 lux e um ciclo claro: escuro de 12 h:12 h.
    2. Transfira as moscas para um novo frasco a cada 7 dias de acordo com o ciclo de crescimento das moscas, mantendo a idade dos indivíduos no mesmo frasco consistente.
    3. Recolha o novo lote de moscas que eclodem da garrafa original 3 dias depois de transferi-las e coloque-as em uma nova garrafa. Seguindo o princípio de trocar o frasco a cada 7 dias, eles serão cultivados até por volta dos 30 dias de idade.

2. Preparação de alimentos medicinais e tubos de vidro para monitorização

OBS: O procedimento de confecção do tubo de vidro segue o trabalho de Jin et al., com modificações34.

  1. Limpeza e secagem de tubos de vidro
    1. Coloque o tubo de vidro (5 mm de diâmetro x 65 mm de comprimento, ver Tabela de Materiais) em um copo grande, mergulhe-o e ferva-o com água destilada dupla por 20 min. Repita 3 vezes.
    2. Retire e embrulhe o tubo de vidro, lave o interior com água bidestilada 3-5 vezes e coloque-o em um forno para secagem.
  2. Preparo de meio de cultura simples (100 mL)
    1. Dissolva 1,5 g de ágar e 5 g de sacarose em água bidestilada, aqueça e concentre até 100 mL.
    2. Adicionar 600 μL de ácido propiónico quando o meio arrefecer a cerca de 70 °C, evitando que se solidifique em banho-maria a temperatura constante.
    3. Adicionar aproximadamente 4 mL de meio simples e Reserpina (ver Tabela de Materiais) em um copo pequeno de 10 mL até que o medicamento atinja 20 μM ou 50 μM. Adicionar dimetilsulfóxido (DMSO) à concentração de 0,2% no grupo controle negativo.
  3. Preparação dos tubos de vidro contendo medicamento
    1. Para facilitar o fluxo do meio, insira cuidadosamente um comprimento adequado de tubo de vidro em um copo pequeno. O meio entrará naturalmente no tubo de vidro devido à pressão atmosférica.
    2. Puxe o tubo de vidro quando o meio de cultura estiver completamente solidificado e limpe a parede externa para obter um tubo de vidro de monitoramento com um meio de cultura contendo drogas em uma extremidade.
    3. Aqueça a parafina sólida em um copo até derreter a 70 °C, coloque a extremidade do tubo de vidro perto do alimento no líquido de parafina por cerca de 5 mm e remova-o rapidamente. Espere a parafina solidificar para selar a extremidade alimentar do tubo de vidro.

3. Planejamento experimental e tratamento de moscas

  1. Planejar o experimento para o tratamento com moscas segue a Tabela 1.

4. Montagem de Drosophila e monitoramento do sono

OBS: O procedimento para montagem de Drosophila segue o trabalho de Jin et al.34 com modificações.

  1. Anestesiar as moscas com gás CO2 , colocá-las em tubos de vidro selados em parafina (um por tubo) e bloquear a extremidade não alimentar com uma bola de algodão absorvente para evitar que as moscas escapem e garantir a circulação de ar.
  2. Carregue tubos no monitor infravermelho para monitorá-los.
    1. Monte os tubos de vidro contendo moscas em um monitor infravermelho na mesma direção e registre o número do monitor e o número do orifício correspondente a cada droga.
    2. Ajuste o alinhamento de cada tubo e faça com que os raios infravermelhos passem verticalmente pelo centro da faixa de atividade da mosca.
    3. Coloque o monitor dentro de uma incubadora de 25 °C localizada na câmara escura de sono de mosca, seguindo as configurações especificadas: temperatura de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente à hora local 08:00) e ZT24 (equivalente à hora local 08:00). Essa configuração garante que as moscas experimentem períodos alternados de 12 h de luz e escuridão.
      NOTA: Tente não abrir a porta até que a coleta de dados de monitoramento esteja concluída para manter um ambiente estável na incubadora durante o monitoramento.
    4. Inicie o monitoramento usando o sistema DAM2 (consulte a Tabela de Materiais).
    5. Uma vez concluído o monitoramento, baixe os dados coletados em formato .txt do sistema.

5. Processamento de dados

NOTA: O processamento dos dados utilizando o sistema DAM, DAMFileScan107 e SCAMP foi realizado de acordo com as instruções em seus sites oficiais (ver Tabela de Materiais).

  1. Importe o arquivo txt acima para o software DAMFileScan107 para digitalização e divida conforme necessário para obter dados de suspensão.
    1. Defina a hora de início dos dados de segmentação para 8:01 (1 min de segmentação) ou 8:00 (30 min de segmentação) na terceira manhã após o início dos monitores, e a hora de término é de 8:00 a.m. três dias após a hora de início (Figura 2A1).
      NOTA: As moscas devem adaptar-se ao ambiente de monitorização durante, pelo menos, um dia. Assim, pode-se definir a hora de início dos dados divididos para 8h no terceiro dia após o início do monitor.
    2. Divida os dados em intervalos de 1 min e 30 min. Altere a opção "Bin Length" para 1 minuto, altere a opção "Output File Type" para Channel files, renomear e saída. O método de segmentação de dados de 30 min é o mesmo acima (Figura 2A2-5).
      Observação : ao executar a segmentação de dados em intervalos de 1 min e 30 min, a renomeação final dos dois arquivos deve ser consistente; caso contrário, ele pode ser ilegível durante o processamento subsequente do Matlab. Se necessário, o nome do arquivo pode ser alterado após a saída para facilitar a diferenciação.
  2. Processamento de dados usando SCAMP2020
    1. Abra o SCAMP2020 do pacote do programa no Matlab e clique duas vezes em Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).
    2. Adicione sua subpasta "Vecsey SCAMP Scripts" ao caminho, localize o arquivo "scamp.m" nessa pasta e execute-o. Na janela pop-up a seguir, selecione as pastas de processo de 1 min e 30 min em sequência (Figura 2C,D).
    3. Selecione um monitor, clique em Load individual See Plots to preview (Figura 3A1) e verifique a imagem exibida. Desmarque o canal correspondente de moscas mortas (Figura 3A2, Figura 3B).
    4. Repita as etapas acima para verificar todos os monitores.
    5. Renomeie cada canal em cada monitor com base no medicamento correspondente a ser testado (Figura 3A3), selecione todos os monitores e clique em ANALISAR Dados Selecionados para análise (Figura 3A4).
    6. Padrão para a opção selecionada, clique em Analisar para Lixeira Escolhida, marque Exportar Dados e, finalmente, clique em GRÁFICO 30 min Tipos de Dados para Todos os Dias para Grupos Selecionados e EXPORTAR Todos os Dados para gerar os resultados (Figura 3C).
  3. Selecione o arquivo chamado s30 no arquivo CSV, localize o valor médio correspondente e os dados de erro padrão para cada monitor, faça backup no Excel para modificação e ajuste e cole-o no GraphPad Prism (consulte Tabela de Materiais) para desenhar um diagrama de status de suspensão (Figura 4A,B).
  4. Encontre o arquivo chamado "stdur" e calcule os valores médios de sono diurno, noturno e total para cada mosca dentro de três dias (Figura 4A,C). Cole os dados no software Prism para concluir o teste de diferença e desenhe um gráfico.

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Representative Results

A reserpina é um inibidor de pequenas moléculas do transportador vesicular de monoamina (VMAT), que inibe a recaptação de monoaminas em vesículas pré-sinápticas, levando ao aumento do sono33. Os efeitos promotores do sono da Reserpina foram examinados em moscas com 30 dias de idade, com o grupo controle sendo alimentado apenas com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). No grupo Reserpina, as moscas mais velhas exibiram um sono significativamente aumentado durante o dia e a noite em comparação com o grupo DMSO. As Figuras 5A,E ilustram os padrões de sono das moscas Reserpine e DMSO durante três dias consecutivos, enquanto as Figuras 5B-D e 5F-H mostram os resultados do teste diferencial nos dados de sono. Para eliminar a possibilidade de a droga agir exclusivamente em um sexo, os experimentos foram repetidos usando moscas machos. Diferentes concentrações de Reserpina, 20 μM, e 50 μM, foram administradas, demonstrando uma correlação positiva entre a concentração de Reserpina e a promoção do sono.

Figure 1
Figura 1: Triagem molecular de pequenas drogas para o processo experimental de distúrbios do sono relacionados à idade. As moscas idosas foram colocadas em um pequeno tubo de vidro com alimentos contendo os medicamentos a serem testados. O padrão de sono foi monitorado continuamente por três dias utilizando o Sistema DAM. Os dados adquiridos foram importados para um computador para processamento, visualização e análise, levando às conclusões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Digitalização e divisão dos dados . (A) Seleção e digitalização dos dados, seguida de segmentação temporal sequencial. (B) Localização da pasta "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Adição da subpasta "Vecsey SCAMP Scripts" ao caminho. (D) Localização do arquivo "scamp.m". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Seleção e processamento dos dados do sono. (A) Visualização das condições de sono das moscas, desverificação do canal para moscas mortas e agrupamento e análise dos dados selecionados. (B) Visualização do sono de Drosophila, onde um retângulo azul uniforme indica sono ativo, enquanto um certo momento de um retângulo azul uniforme sugere que a mosca está morta. As moscas mortas são marcadas com retângulos vermelhos. (C) Análise e produção dos dados selecionados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados da análise dos dados do sono . (A) Seleção dos arquivos s30 e stdur do arquivo CSV. (B) Valor médio e erro padrão da média (EPM) do sono para cada grupo em "s30.csv". (C) Valores de sono diurno (Bin1, Bin3, Bin5), noturno (Bin2, Bin4, Bin6) e total para cada mosca dentro de três dias em "stdur.csv". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Condições de sono de moscas idosas tratadas com Reserpina. (A) Representação esquemática do tempo de sono em 3 dias em fêmeas idosas alimentadas com DMSO a 0,2%, Reserpina 20 μM e Reserpina 50 μM. (B-D) Análise quantitativa do tempo médio de sono diurno, noturno e total em 3 dias com ou sem medicamentos. Os resultados demonstram um aumento significativo no tempo de sono em fêmeas idosas alimentadas com Reserpina. N = 8 para cada grupo, ANOVA One-way, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Representação esquemática do tempo de sono em 3 dias em homens idosos alimentados com DMSO a 0,2%, Reserpina 20 μM e Reserpina 50 μM. (F-H) Análise quantitativa do tempo médio de sono diurno, noturno e total em 3 dias com ou sem medicamentos. Os resultados indicam que o tempo de sono aumentou em machos alimentados com Reserpine. n = 16 para cada grupo, ANOVA one-way, *p < 0,05, **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Comparação da duração do sono entre moscas jovens e velhas. (A) Diagrama esquemático ilustrando o monitoramento da duração do sono ao longo de 3 dias em jovens e idosos do sexo masculino. (B-D) A análise quantitativa do tempo médio de sono diurno, noturno e total ao longo de 3 dias em homens jovens e idosos não revelou diferença significativa. n = 32 para cada grupo, teste t não pareado, n.s., não significante. (E) Monitoramento esquemático da duração do sono ao longo de 3 dias em mulheres jovens e idosas. (F-H) A análise quantitativa do tempo médio de sono diurno, noturno e total ao longo de 3 dias em mulheres jovens e idosas demonstrou uma diminuição significativa no tempo de sono diurno, noturno e total em mulheres idosas em comparação com mulheres jovens. n = 32 para cada grupo, teste t não pareado, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Grupo Grupo de estudo Tratamento Idade e sexo das moscas Número de moscas
Equation 1 Controles normais 4 mL de meio de cultura simples com DMSO 0,2% por 4 dias 30 dias machos/fêmeas 16 moscas por grupo
Equation 2 Teste de drogas em baixas dosesEquation 6 4 mL de meio de cultura simples com 20 μM de reserpina por 4 dias 30 dias fêmeas 16 moscas por grupo
Equation 3 Teste de drogas em altas dosesEquation 6 4 mL de meio de cultura simples com 50 μM de reserpina por 4 dias 30 dias fêmeas 16 moscas por grupo
Equation 4 Teste de drogas em baixas dosesEquation 7 4 mL de meio de cultura simples com 20 μM de reserpina por 4 dias 30 dias machos 16 moscas por grupo
Equation 5 Teste de drogas em altas dosesEquation 7 4 mL de meio de cultura simples com 50 μM de reserpina por 4 dias 30 dias machos 16 moscas por grupo

Tabela 1: Planejamento experimental para o tratamento da mosca.

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Discussion

O método descrito é adequado para rastrear rapidamente medicamentos para dormir de pequeno e médio porte. Atualmente, a maioria dos principais métodos de triagem de drogas de alto rendimento são baseados em níveis bioquímicos e celulares. Por exemplo, a estrutura e as propriedades do receptor são examinadas em busca de ligantes específicos que possam se ligar a ele22. Outra abordagem envolve a análise do modo de ligação e da força de fragmentos moleculares de fármacos selecionados utilizando Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com espectrometria de massas35. No entanto, esses métodos geralmente têm uma taxa de erro de triagem relativamente alta, e os medicamentos selecionados por meio deles muitas vezes não mostram efeito em experimentos animais ou clínicos. A eficácia das drogas no organismo é influenciada por vários fatores, como absorção, distribuição, metabolismo e excreção de drogas, levando a uma alta taxa de falsos rastreamentos. Em contraste, embora nosso método proposto tenha uma escala de triagem menor em comparação com métodos de alto rendimento, ele oferece uma abordagem mais direta e custo-efetiva ao observar diretamente os efeitos da droga sobre os fenótipos. Isso demonstra o potencial do uso do modelo Drosophila para triagem eficaz de drogas e identificação de alvos de drogas.

Drosophila possui um mecanismo de regulação do sono conservado e exibe distúrbios do sono associados ao envelhecimento. Observamos que a duração do sono das moscas fêmeas com 30 dias de idade foi significativamente menor do que a das moscas com 7 dias de idade, enquanto a duração do sono das moscas machos com 30 dias de idade não diferiu significativamente daquela das moscas com 7 dias de idade (Figura 6). Consequentemente, moscas fêmeas com 30 dias de idade foram selecionadas para os experimentos atuais. O processo de triagem em múltiplas rodadas foi conduzido para minimizar a interferência acidental dos fatores. A concentração da droga na primeira rodada foi fixada em 20 μM para evitar efeitos colaterais tóxicos que poderiam levar à mortalidade por moscas. Na segunda etapa de triagem, a concentração da droga foi aumentada para 50 μM para avaliar os efeitos da droga em diferentes concentrações. As drogas selecionadas da segunda rodada foram administradas a moscas machos a 20 μM e 50 μM para avaliar diferenças sexuais nos efeitos das drogas. Isso permitiu rastrear drogas que demonstraram consistentemente efeitos relacionados ao sono. Por exemplo, Reserpine foi previamente mostrado para aumentar o sono em moscas adultas com idade 4-6 dias31. Replicamos com sucesso esse resultado em nosso modelo usando moscas mais velhas, onde as fêmeas mais velhas mostraram um aumento significativo no sono após a administração de Reserpine (Figura 5).

DMSO foi usado para dissolver as drogas, mas sua toxicidade potencial deve ser considerada. Estudos prévios demonstraram que concentrações de 0,1% a 0,25% de DMSO no meio de cultura não prejudicam células ciliadas de ratos em 24 h, enquanto concentrações de 0,5% a 6% aumentam significativamente a morte celular36. Da mesma forma, verificou-se que concentrações de DMSO de 0,1% ou menos não afetam a expressão de enzimas ou transportadores relacionados ao metabolismo de drogas chave em hepatócitos humanos. Ainda assim, concentrações mais elevadas podem induzir alterações na expressão37. No entanto, deve-se notar que 0,1% de DMSO afeta significativamente a expectativa de vida de moscas fêmeas, mas não de machos38. Além disso, foi demonstrado que a administração intraperitoneal de DMSO a 15% e 20% interfere no sono de ratos39. Para mitigar a toxicidade potencial do DMSO, mantivemos sua concentração abaixo de 0,2%.

Atualmente, existem dois métodos principais utilizados para caracterizar o comportamento de Drosophila. Um método é baseado na análise de vídeo, que fornece uma riqueza de parâmetros comportamentais, incluindo posição da mosca, velocidade e movimentos sutis de partes do corpo. O outro método é baseado na fratura por feixe infravermelho, como o sistema DAM. 40. No entanto, é importante notar que certas ferramentas de análise de vídeo, como o PySolo, são projetadas para estudar várias moscas de um único residente, limitando o número de moscas que podem ser colocadas sob uma câmera41. Outras ferramentas como C-trax42 e JAABA43 podem realizar rastreamento populacional, mas são computacionalmente caras e demoradas. Para triagem de alto rendimento, capturar a duração total do sono das moscas geralmente é suficiente, e parâmetros de movimento precisos não são necessários. Portanto, o método amplamente utilizado e altamente escalável baseado em fratura por feixe infravermelho é preferido. No entanto, esse método também tem suas limitações. Por exemplo, se as moscas se movem apenas em uma extremidade do tubo sem interromper o feixe infravermelho, o sistema pode erroneamente registrá-lo como sono, levando a uma superestimação do sono44. Além disso, é importante testar cuidadosamente a motilidade da cepa da mosca antes de usá-la na triagem para evitar influências não intencionais.

Aqui estão algumas dicas úteis para uma configuração bem-sucedida: (1) Para evitar que o alimento grude no tubo de vidro ao removê-lo do copo pequeno após a solidificação, pode-se tentar inserir o tubo de vidro verticalmente no fundo do copo pequeno antes que o alimento se solidifique. Puxar suavemente o tubo de vidro para frente e para trás, bater no fundo do copo para permitir a entrada de ar, girar lentamente o copo para remover todos os alimentos e o tubo de vidro e, em seguida, limpar cuidadosamente qualquer alimento restante na parede externa do tubo de vidro pode ser eficaz. (2) Ao selar a extremidade alimentar do tubo de vidro com filme de parafina, recomenda-se o uso de banho-maria para aquecer lentamente o filme até que a parafina derreta. Essa abordagem ajuda a evitar o problema de o alimento medicinal espirrar violentamente em altas temperaturas e contaminar a película de parafina. Alternativamente, pode-se usar pequenas tampas de plástico para vedação, mas certifique-se de que o ar possa entrar durante a vedação, fazendo com que o alimento empurre para cima. (3) Vale a pena considerar que algumas drogas potentes promotoras do sono podem inicialmente levar ao julgamento incorreto de moscas testadas como mortas. Para superar essa questão, recomenda-se estabelecer um gradiente de concentração, permitindo a exploração da concentração ótima do fármaco e a repetição do experimento. (4) Levar em consideração que o odor da droga pode influenciar a quantidade de alimento consumido pelas moscas e sua ingestão da droga, potencialmente afetando a precisão dos resultados experimentais. Portanto, pode ser benéfico estender a duração do experimento adequadamente, garantindo que as moscas tenham tempo suficiente para consumir o máximo de droga possível e aumentando o efeito de acumulação da droga. (5) Para o processamento de dados, embora muitas universidades e institutos tenham acesso ao Matlab para uso público, existem alternativas de baixo custo disponíveis para indivíduos ou instituições de pesquisa que ainda não adquiriram o programa. Uma opção recomendada é ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

Em conclusão, desenvolvemos um procedimento passo a passo para a triagem de medicamentos para o tratamento de distúrbios do sono. Usando um modelo de mosca mais velha exibindo um fenótipo de menor duração do sono, a eficácia da Reserpine em aumentar a duração do sono em moscas fêmeas mais velhas é validada. Este método oferece uma nova abordagem para a triagem de drogas com potencial de aplicação significativo e serve como base para pesquisas futuras sobre medicamentos. Embora os efeitos da droga sejam avaliados com base nos fenótipos, o mecanismo subjacente de ação da droga permanece desconhecido. Novos estudos serão realizados para investigar a patologia dos distúrbios do sono e a regulação molecular do sono, esclarecendo os mecanismos farmacológicos envolvidos. Embora a maquinaria circadiana em Drosophila tenha semelhanças com osciladores humanos, as diferenças nos mecanismos de controle do sono entre humanos e moscas não devem ser negligenciadas. Esse protocolo fornece uma estrutura básica para a triagem de drogas para distúrbios do sono. No entanto, pesquisas futuras determinarão se algum dos fármacos triados pode ser utilizado para tratamento clínico, bem como elucidar seus mecanismos de ação.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros do laboratório do Prof. Junhai Han por suas discussões e comentários. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 32170970 a Y.T e pelo "Cyanine Blue Project" da Província de Jiangsu a Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

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References

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Rastreamento de drogas de pequenas moléculas distúrbios do sono relacionados à idade Drosophila Melanogaster duração do sono padrões fragmentados idosos doenças diabetes doenças cardiovasculares distúrbios psicológicos drogas existentes efeitos colaterais comprometimento cognitivo dependência medicamentos mais seguros medicamentos eficazes para distúrbios do sono método de triagem custo-efetivo mecanismo de regulação do sono organismo modelo dispositivo de monitoramento infravermelho análise circadiana e do sono Programa MATLAB 2020 (SCAMP2020) Protocolo de Triagem de Baixo Custo
Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando <em>Drosophila melanogaster</em>
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Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

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