Summary
Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento para mejorar el sueño mediante el seguimiento del comportamiento del sueño de las moscas de la fruta en un modelo de Drosophila de edad avanzada.
Abstract
El sueño, un componente esencial de la salud y el bienestar general, a menudo presenta desafíos para las personas mayores que experimentan con frecuencia trastornos del sueño caracterizados por una duración del sueño más corta y patrones fragmentados. Estas interrupciones del sueño también se correlacionan con un mayor riesgo de diversas enfermedades en las personas mayores, como diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos psicológicos. Desafortunadamente, los medicamentos existentes para los trastornos del sueño se asocian con efectos secundarios significativos, como deterioro cognitivo y adicción. En consecuencia, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevos medicamentos para los trastornos del sueño, más seguros y más eficaces. Sin embargo, el alto costo y la larga duración experimental de los métodos actuales de detección de drogas siguen siendo factores limitantes.
Este protocolo describe un método de cribado rentable y de alto rendimiento que utiliza Drosophila melanogaster, una especie con un mecanismo de regulación del sueño altamente conservado en comparación con los mamíferos, lo que lo convierte en un modelo ideal para estudiar los trastornos del sueño en los ancianos. Al administrar varios compuestos pequeños a moscas envejecidas, podemos evaluar sus efectos sobre los trastornos del sueño. Los comportamientos de sueño de estas moscas se registran mediante un dispositivo de monitorización infrarroja y se analizan con el paquete de datos de código abierto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Este protocolo ofrece un enfoque de detección de bajo costo, reproducible y eficiente para la regulación del sueño. Las moscas de la fruta, debido a su corto ciclo de vida, bajo costo de cría y facilidad de manejo, sirven como excelentes sujetos para este método. A modo de ilustración, la reserpina, uno de los fármacos probados, demostró la capacidad de promover la duración del sueño en moscas ancianas, destacando la eficacia de este protocolo.
Introduction
El sueño, uno de los comportamientos esenciales necesarios para la supervivencia humana, se caracteriza por dos estados principales: el sueño de movimientos oculares rápidos (REM) yel sueño de movimientos oculares no rápidos (NREM). El sueño NREM comprende tres etapas: N1 (la transición entre la vigilia y el sueño), N2 (sueño ligero) y N3 (sueño profundo, sueño de ondas lentas), que representan la progresión de la vigilia al sueño profundo1. El sueño juega un papel crucial tanto en la salud física como en la mental2. Sin embargo, el envejecimiento reduce la duración total del sueño, la eficiencia del sueño, el porcentaje de sueño de ondas lentas y el porcentaje de sueño REM en adultos3. Las personas mayores tienden a pasar más tiempo en sueño ligero en comparación con el sueño de ondas lentas, lo que los hace más sensibles a los despertares nocturnos. A medida que aumenta el número de despertares, el tiempo medio de sueño disminuye, lo que da lugar a un patrón de sueño fragmentado en los ancianos, que puede estar asociado a una excitación excesiva de las neuronas Hcrt en ratones4. Además, las disminuciones relacionadas con la edad en los mecanismos circadianos contribuyen a un cambio más temprano en la duración del sueño 5,6. En combinación con las enfermedades físicas, el estrés psicológico, los factores ambientales y el uso de medicamentos, estos factores hacen que los adultos mayores sean más susceptibles a los trastornos del sueño, como el insomnio, el trastorno del comportamiento del sueño REM, la narcolepsia, los movimientos periódicos de las piernas, el síndrome de piernas inquietas y los trastornos respiratorios del sueño 7,8.
Los estudios epidemiológicos han demostrado que los trastornos del sueño están estrechamente relacionados con las enfermedades crónicas en los ancianos9, incluyendo la depresión 10, las enfermedades cardiovasculares11 y la demencia12. Abordar los trastornos del sueño desempeña un papel crucial en la mejora y el tratamiento de las enfermedades crónicas y en la mejora de la calidad de vida de los adultos mayores. En la actualidad, los pacientes recurren principalmente a fármacos como las benzodiacepinas, las no benzodiacepinas y los agonistas de los receptores de melatonina para mejorar la calidad del sueño13. Sin embargo, las benzodiacepinas pueden conducir a una regulación negativa de los receptores y a la dependencia después de un uso prolongado, causando síntomas graves de abstinencia tras la interrupción14,15. Los medicamentos no benzodiacepinas también conllevan riesgos, como demencia16, fracturas17 y cáncer18. El agonista del receptor de melatonina de uso común, el ramelteón, reduce la latencia del sueño, pero no aumenta la duración del sueño y tiene problemas relacionados con la función hepática debido a la extensa eliminación del primer paso19. La agomelatina, un agonista de los receptores de melatonina y antagonista de los receptores de serotonina, mejora el insomnio relacionado con la depresión, pero también presenta un riesgo de daño hepático20. En consecuencia, existe una necesidad urgente de medicamentos más seguros para tratar o aliviar los trastornos del sueño. Sin embargo, las estrategias actuales de cribado de fármacos, basadas en experimentos moleculares y celulares combinados con sistemas automatizados y análisis informáticos, son costosas y requieren mucho tiempo21. Las estrategias de diseño de fármacos basadas en la estructura, que se basan en la estructura y las propiedades de los receptores, requieren una comprensión clara de la estructura tridimensional de los receptores y carecen de capacidades predictivas de los efectos de los fármacos22.
En el año 2000, con base en los criterios de sueño propuestos por Campbell y Tobler en 1984 23, los investigadores establecieron modelos animales simples para estudiar el sueño 24, incluyendo Drosophila melanogaster, que exhibía estados similares al sueño25,26. A pesar de las diferencias anatómicas entre Drosophila y los humanos, muchos componentes neuroquímicos y vías de señalización que regulan el sueño en Drosophila se conservan en el sueño de los mamíferos, facilitando el estudio de las enfermedades neurológicas humanas27,28. Drosophila también se utiliza ampliamente en los estudios del ritmo circadiano, a pesar de las diferencias en los osciladores centrales entre moscas y mamíferos 29,30,31. Por lo tanto, Drosophila sirve como un valioso organismo modelo para estudiar el comportamiento del sueño y realizar pruebas de detección de drogas relacionadas con el sueño.
Este estudio propone un enfoque rentable y sencillo basado en el fenotipo para el cribado de fármacos de moléculas pequeñas para tratar los trastornos del sueño utilizando moscas envejecidas. La regulación del sueño en Drosophila está altamente conservada25, y la disminución del sueño observada con la edad puede ser reversible mediante la administración de fármacos. Por lo tanto, este método de detección basado en el fenotipo del sueño puede reflejar intuitivamente la eficacia del fármaco. Alimentamos a las moscas con una mezcla del fármaco investigado y la comida, monitorizamos y registramos el comportamiento del sueño utilizando el Drosophila Activity Monitor (DAM)32 y analizamos los datos adquiridos utilizando el paquete de datos SCAMP2020 de código abierto de MATLAB (Figura 1). El análisis estadístico se realiza mediante estadísticas y software de gráficos (ver Tabla de Materiales). A modo de ejemplo, demostramos la efectividad de este protocolo mediante la presentación de datos experimentales sobre la reserpina, un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas que se ha reportado que aumenta el sueño33. Este protocolo proporciona un enfoque valioso para identificar medicamentos para tratar los problemas de sueño relacionados con la edad.
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Protocol
Este protocolo utiliza las moscas w1118 de 30 días de edad del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de las moscas de la fruta envejecidas
- Preparación de alimentos
- Prepare un medio de cultivo estándar de almidón de maíz mezclando 50 g/L de copos de maíz, 110 g/L de azúcar, 5 g/L de agar y 25 g/L de levadura. Calentar los copos de maíz y la levadura con agua para gelatinizar, y luego disolver completamente todas las sustancias.
- Cuando el medio se enfríe a 50-60 °C, agregue 6 ml/l de ácido propiónico y envase rápidamente en frascos de cultivo.
- Cría de moscas y preparación de moscas envejecidas
- Criar la cepa de mosca w1118en frascos que contengan un medio de cultivo estándar de almidón de maíz y colocar los frascos en una incubadora de temperatura constante a 25 ° C, 68% de humedad relativa, condiciones de iluminación de 500-1000 lux y un ciclo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h.
- Transfiera las moscas a una nueva botella cada 7 días de acuerdo con el ciclo de crecimiento de las moscas, manteniendo constante la edad de los individuos en la misma botella.
- Recoja el nuevo lote de moscas que eclosionan de la botella original 3 días después de transferirlas y colóquelas en una botella nueva. Siguiendo el principio de cambiar el frasco cada 7 días, se cultivarán hasta alrededor de los 30 días de edad.
2. Preparación de alimentos medicinales y tubos de vidrio para monitoreo
NOTA: El procedimiento para la preparación de tubos de vidrio sigue el trabajo de Jin et al. con modificaciones34.
- Limpieza y secado de tubos de vidrio
- Coloque el tubo de vidrio (5 mm de diámetro x 65 mm de largo, consulte la tabla de materiales) en un vaso de precipitados grande, sumérjalo y hiérvalo con agua destilada doble durante 20 minutos. Repita 3 veces.
- Retire y agrupe el tubo de vidrio, enjuague el interior con agua destilada doble de 3 a 5 veces y colóquelo en un horno para que se seque.
- Preparación del medio de cultivo simple (100 mL)
- Disuelva 1,5 g de agar y 5 g de sacarosa en agua bidestilada, caliente y concentre hasta 100 ml.
- Añadir 600 μL de ácido propiónico cuando el medio se enfríe a unos 70 °C, evitando que se solidifique con un baño de agua a temperatura constante.
- Agregue aproximadamente 4 ml de medio simple y reserpina (ver Tabla de materiales) en un vaso de precipitados pequeño de 10 ml hasta que el fármaco alcance 20 μM o 50 μM. Agregue dimetilsulfóxido (DMSO) a la concentración de 0.2% en el grupo de control negativo.
- Preparación de los tubos de vidrio que contienen medicamentos
- Para facilitar el flujo del medio, inserte con cuidado una longitud adecuada de tubo de vidrio en un vaso de precipitados pequeño. El medio entrará naturalmente en el tubo de vidrio debido a la presión atmosférica.
- Saque el tubo de vidrio cuando el medio de cultivo esté completamente solidificado y limpie la pared exterior para obtener un tubo de vidrio de monitoreo con un medio de cultivo que contenga medicamentos en un extremo.
- Calentar la parafina sólida en un vaso de precipitados hasta que se derrita a 70 °C, acercar el extremo del tubo de vidrio a los alimentos en el líquido de parafina durante unos 5 mm y retirarlo rápidamente. Espere a que la parafina se solidifique para sellar el extremo alimenticio del tubo de vidrio.
3. Diseño experimental y tratamiento de moscas
- Diseñar el experimento para el tratamiento con mosca siguiendo la Tabla 1.
4. Montaje de Drosophila y monitorización del sueño
NOTA: El procedimiento para el ensamblaje de Drosophila sigue el trabajo de Jin et al.34 con modificaciones.
- Anestesiar las moscas con gas CO2 , colocarlas en tubos de vidrio sellados con parafina (uno por tubo) y bloquear el extremo no alimentario con una bola de algodón absorbente para evitar que las moscas se escapen y asegurar la circulación del aire.
- Cargue los tubos en el monitor infrarrojo para monitorearlos.
- Ensamble los tubos de vidrio que contienen moscas en un monitor infrarrojo en la misma dirección y registre el número de monitor y el número de orificio correspondiente a cada medicamento.
- Ajusta la alineación de cada tubo y haz que los rayos infrarrojos pasen verticalmente por el centro del rango de actividad de la mosca.
- Coloque el monitor dentro de una incubadora a 25 °C ubicada en el cuarto oscuro del sueño de moscas, siguiendo la configuración especificada: temperatura de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente a la hora local de las 08:00 p.m.) y ZT24 (equivalente a la hora local de las 08:00 a.m.). Esta configuración asegura que las moscas experimenten períodos alternos de 12 h de luz y oscuridad.
NOTA: Trate de no abrir la puerta hasta que se complete la recopilación de datos de monitoreo para mantener un ambiente estable en la incubadora durante el monitoreo. - Inicie la supervisión utilizando el sistema DAM2 (consulte la Tabla de materiales).
- Una vez que se complete el monitoreo, descargue los datos recopilados en formato .txt del sistema.
5. Tratamiento de datos
NOTA: El procesamiento de datos utilizando el sistema DAM, DAMFileScan107 y SCAMP se realizó de acuerdo con las instrucciones de sus sitios web oficiales (ver Tabla de Materiales).
- Importe el archivo txt anterior al software DAMFileScan107 para escanearlo y divídalo según sea necesario para obtener los datos de sueño.
- Establezca la hora de inicio de los datos de segmentación en 8:01 (segmentación de 1 minuto) u 8:00 (segmentación de 30 minutos) de la tercera mañana después de iniciar los monitores, y la hora de finalización es a las 8:00 a.m. tres días después de la hora de inicio (Figura 2A1).
NOTA: Las moscas deben adaptarse al entorno de monitoreo durante al menos un día. Por lo tanto, se puede establecer la hora de inicio de los datos divididos a las 8 a.m. del tercer día después de que comience el monitor. - Divida los datos a intervalos de 1 min y 30 min. Cambie la opción "Longitud del contenedor" a 1 minuto, cambie la opción "Tipo de archivo de salida" a Archivos de canal, cambie el nombre y la salida. El método de segmentación de datos de 30 minutos es el mismo que el anterior (Figura 2A2-5).
NOTA: Al realizar la segmentación de datos a intervalos de 1 minuto y 30 minutos, el cambio de nombre final de los dos archivos debe ser coherente; de lo contrario, puede ser ilegible durante el procesamiento posterior de Matlab. Si es necesario, el nombre del archivo se puede cambiar después de la salida para facilitar la diferenciación.
- Establezca la hora de inicio de los datos de segmentación en 8:01 (segmentación de 1 minuto) u 8:00 (segmentación de 30 minutos) de la tercera mañana después de iniciar los monitores, y la hora de finalización es a las 8:00 a.m. tres días después de la hora de inicio (Figura 2A1).
- Tratamiento de datos mediante SCAMP2020
- Abra el paquete del programa SCAMP2020 en Matlab y haga doble clic en Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).
- Agregue su subcarpeta "Vecsey SCAMP Scripts" a la ruta, busque el archivo "scamp.m" en esa carpeta y ejecútelo. En la siguiente ventana emergente, seleccione las carpetas de proceso de 1 minuto y 30 minutos en secuencia (Figura 2C, D).
- Seleccione un monitor, haga clic en Cargar gráficos de visualización individuales para obtener una vista previa (Figura 3A1) y verifique la imagen que aparece. Desmarque el canal correspondiente de moscas muertas (Figura 3A2, Figura 3B).
- Repita los pasos anteriores para comprobar todos los monitores.
- Cambie el nombre de cada canal de cada monitor en función del fármaco correspondiente que se va a probar (Figura 3A3), seleccione todos los monitores y haga clic en ANALIZAR datos seleccionados para el análisis (Figura 3A4).
- De forma predeterminada en la opción seleccionada, haga clic en Analizar para la ubicación elegida, marque Exportar datos y, finalmente, haga clic en GRÁFICO 30 minutos Tipos de datos para todos los días para grupos seleccionados y EXPORTAR todos los datos para generar los resultados (Figura 3C).
- Seleccione el archivo denominado s30 del archivo CSV, busque el valor medio correspondiente y los datos de error estándar para cada monitor, haga una copia de seguridad en Excel para modificarlo y ajustarlo, y péguelo en GraphPad Prism (consulte la Tabla de materiales) para dibujar un diagrama de estado de suspensión (Figura 4A, B).
- Busque el archivo llamado "stdur" y calcule los valores promedio de sueño diurno, nocturno y total para cada mosca dentro de los tres días (Figura 4A, C). Pegue los datos en el software Prism para completar la prueba de diferencia y dibuje un gráfico.
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Representative Results
La reserpina es un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas (VMAT), que inhibe la recaptación de monoaminas en las vesículas presinápticas, lo que conduce a un aumento del sueño33. Se examinaron los efectos de la reserpina como promotores del sueño en moscas de 30 días de edad, y el grupo de control se alimentó únicamente con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). En el grupo de Reserpina, las moscas más viejas mostraron un aumento significativo del sueño tanto durante el día como durante la noche en comparación con el grupo de DMSO. La Figura 5A, E ilustra los patrones de sueño de las moscas Reserpina y DMSO durante tres días consecutivos, mientras que la Figura 5B-D y la Figura 5F-H muestran los resultados de la prueba diferencial en los datos de sueño. Para eliminar la posibilidad de que el fármaco actuara exclusivamente sobre un sexo, los experimentos se repitieron con moscas macho. Se administraron diferentes concentraciones de reserpina, 20 μM y 50 μM, demostrando una correlación positiva entre la concentración de reserpina y la promoción del sueño.
Figura 1: Proceso experimental de cribado de fármacos de moléculas pequeñas para trastornos del sueño relacionados con la edad. Las moscas ancianas se colocaron en un pequeño tubo de vidrio con alimentos que contenían los medicamentos que se iban a analizar. Los patrones de sueño se monitorizaron de forma continua durante tres días utilizando el sistema DAM. Los datos adquiridos se importaron a una computadora para su procesamiento, visualización y análisis, lo que llevó a conclusiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Escaneo y división de datos. (A) Selección y escaneo de datos, seguido de segmentación temporal secuencial. (B) Ubicación de la carpeta "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Adición de la subcarpeta "Vecsey SCAMP Scripts" a la ruta. (D) Ubicación del archivo "scamp.m". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Selección y procesamiento de los datos de sueño. (A) Vista previa de las condiciones de sueño de las moscas, desmarcando el canal en busca de moscas muertas y agrupando y analizando los datos seleccionados. (B) Vista previa del sueño de Drosophila, donde un rectángulo azul uniforme indica un sueño activo, mientras que un cierto momento de un rectángulo azul uniforme sugiere que la mosca está muerta. Las moscas muertas están marcadas con rectángulos rojos. (C) Análisis y salida de datos seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados del análisis de los datos de sueño . (A) Selección de los archivos s30 y stdur del archivo CSV. (B) El valor promedio y el error estándar de la media (SEM) de sueño para cada grupo en "s30.csv". (C) Valores de sueño diurno (Bin1, Bin3, Bin5), nocturno (Bin2, Bin4, Bin6) y total para cada mosca dentro de los tres días en "stdur.csv". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Condiciones de sueño de moscas envejecidas tratadas con reserpina. (A) Representación esquemática del tiempo de sueño dentro de los 3 días en hembras envejecidas alimentadas con 0,2% de DMSO, 20 μM de reserpina y 50 μM de reserpina. (B-D) Análisis cuantitativo del tiempo promedio de sueño diurno, nocturno y total dentro de los 3 días con o sin medicamentos. Los resultados demuestran un aumento significativo en el tiempo de sueño en las hembras ancianas alimentadas con reserpina. N = 8 para cada grupo, ANOVA de un factor, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Representación esquemática del tiempo de sueño dentro de los 3 días en hombres de edad alimentados con 0,2% de DMSO, 20 μM de reserpina y 50 μM de reserpina. (F-H) Análisis cuantitativo del tiempo promedio de sueño diurno, nocturno y total dentro de los 3 días con o sin medicamentos. Los resultados indican que el tiempo de sueño aumentó en los machos alimentados con Reserpina. n = 16 para cada grupo, ANOVA de un factor, *p < 0,05, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Comparación de la duración del sueño entre moscas jóvenes y viejas. (A) Diagrama esquemático que ilustra el seguimiento de la duración del sueño durante 3 días en machos jóvenes y viejos. (B-D) El análisis cuantitativo del tiempo promedio de sueño diurno, nocturno y total durante 3 días en hombres jóvenes y ancianos no reveló diferencias significativas. n = 32 para cada grupo, prueba t no apareada, n.s., no significativo. (E) Monitorización esquemática de la duración del sueño durante 3 días en hembras jóvenes y mayores. (F-H) El análisis cuantitativo del tiempo promedio de sueño diurno, nocturno y total durante 3 días en mujeres jóvenes y ancianas demostró una disminución significativa en el tiempo de sueño diurno, nocturno y total en mujeres viejas en comparación con mujeres jóvenes. n = 32 para cada grupo, prueba t no apareada, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo | Comisión de estudio | Tratamiento | Edad y sexo de las moscas | Número de moscas | |||||
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Controles normales | Medio de cultivo simple de 4 ml con DMSO al 0,2 % durante 4 días | 30 días machos/hembras | 16 moscas por grupo | |||||
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Prueba de drogas de dosis baja |
Medio de cultivo simple de 4 ml con 20 μM de reserpina durante 4 días | Hembras de 30 días | 16 moscas por grupo | |||||
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Prueba de drogas de dosis alta |
Medio de cultivo simple de 4 ml con 50 μM de reserpina durante 4 días | Hembras de 30 días | 16 moscas por grupo | |||||
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Prueba de drogas de dosis baja |
Medio de cultivo simple de 4 ml con 20 μM de reserpina durante 4 días | Machos de 30 días | 16 moscas por grupo | |||||
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Prueba de drogas de dosis alta |
Medio de cultivo simple de 4 ml con 50 μM de reserpina durante 4 días | Machos de 30 días | 16 moscas por grupo | |||||
Tabla 1: Diseño experimental para el tratamiento de moscas.
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Discussion
El método descrito es adecuado para la detección rápida de medicamentos para dormir pequeños y medianos. En la actualidad, la mayoría de los métodos convencionales de detección de fármacos de alto rendimiento se basan en los niveles bioquímicos y celulares. Por ejemplo, se examina la estructura y las propiedades del receptor para buscar ligandos específicos que puedan unirse a él22. Otro enfoque consiste en analizar el modo de unión y la fuerza de los fragmentos moleculares de fármacos seleccionados mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) con espectrometría de masas35. Sin embargo, estos métodos a menudo tienen una tasa de error de detección relativamente alta, y los medicamentos seleccionados a través de ellos a menudo no muestran ningún efecto en experimentos clínicos o con animales. La eficacia de los medicamentos en el cuerpo está influenciada por varios factores, como la absorción, distribución, metabolismo y excreción de medicamentos, lo que lleva a una alta tasa de detección falsa. Por el contrario, aunque nuestro método propuesto tiene una escala de cribado más pequeña en comparación con los métodos de alto rendimiento, ofrece un enfoque más sencillo y rentable al observar directamente los efectos de los fármacos en los fenotipos. Esto demuestra el potencial del uso del modelo de Drosophila para el cribado eficaz de fármacos y la identificación de dianas farmacológicas.
Drosophila posee un mecanismo de regulación del sueño conservado y exhibe trastornos del sueño asociados con el envejecimiento. Observamos que la duración del sueño de las moscas hembras de 30 días de edad fue significativamente más corta que la de las moscas de 7 días, mientras que la duración del sueño de las moscas macho de 30 días no difirió significativamente de la de las moscas de 7 días (Figura 6). En consecuencia, se seleccionaron moscas hembras de 30 días de edad para los experimentos actuales. El proceso de selección en múltiples rondas se llevó a cabo para minimizar la interferencia accidental de factores. La concentración del fármaco en la primera ronda se fijó en 20 μM para evitar efectos secundarios tóxicos que podrían provocar la mortalidad de las moscas. En la segunda ronda de cribado, la concentración del fármaco se incrementó a 50 μM para evaluar los efectos del fármaco a diferentes concentraciones. Los fármacos seleccionados de la segunda ronda se administraron a moscas macho a 20 μM y 50 μM para evaluar las diferencias sexuales en los efectos de los fármacos. Esto permitió detectar medicamentos que demostraron consistentemente efectos relacionados con el sueño. Por ejemplo, se ha demostrado anteriormente que la reserpina aumenta el sueño en moscas adultas de 4 a 6 días31. Replicamos con éxito este resultado en nuestro modelo utilizando moscas más viejas, donde las hembras mayores mostraron un aumento significativo en el sueño después de que se les administrara reserpina (Figura 5).
Se utilizó DMSO para disolver los fármacos, pero se debe tener en cuenta su posible toxicidad. Estudios previos han demostrado que las concentraciones de 0,1% a 0,25% de DMSO en el medio de cultivo no dañan las células ciliadas de rata dentro de las 24 h, mientras que las concentraciones de 0,5% a 6% aumentan significativamente la muerte celular36. Del mismo modo, se ha encontrado que las concentraciones de DMSO del 0,1% o menos no afectan a la expresión de enzimas o transportadores clave relacionados con el metabolismo de los fármacos en los hepatocitos humanos. Sin embargo, concentraciones más altas pueden inducir cambios en la expresión37. Sin embargo, hay que tener en cuenta que se ha encontrado que el 0,1% de DMSO afecta significativamente la vida útil de las moscas hembras, pero no de los machos38. Además, se ha demostrado que la administración intraperitoneal de DMSO al 15% y al 20% interfiere con el sueño en ratas39. Para mitigar la toxicidad potencial del DMSO, mantuvimos su concentración por debajo del 0,2%.
En la actualidad, existen dos métodos principales utilizados para caracterizar el comportamiento de Drosophila. Un método se basa en el análisis de video, que proporciona una gran cantidad de parámetros de comportamiento, incluida la posición de la mosca, la velocidad y los movimientos sutiles de las partes del cuerpo. El otro método se basa en la fractura por haz infrarrojo, como el sistema DAM. 40. Sin embargo, es importante señalar que ciertas herramientas de análisis de vídeo, como PySolo, están diseñadas para estudiar múltiples moscas de un solo residente, lo que limita el número de moscas que pueden colocarse debajo de una cámara41. Otras herramientas como C-trax42 y JAABA43 pueden realizar un seguimiento de la población, pero son computacionalmente costosas y requieren mucho tiempo. Para el cribado de alto rendimiento, la captura de la duración total del sueño de las moscas suele ser suficiente, y no son necesarios parámetros de movimiento precisos. Por lo tanto, se prefiere el método ampliamente utilizado y altamente escalable basado en la fractura por haz infrarrojo. Sin embargo, este método también tiene sus limitaciones. Por ejemplo, si las moscas solo se mueven en un extremo del tubo sin interrumpir el haz infrarrojo, el sistema puede registrarlo erróneamente como sueño, lo que lleva a una sobreestimación del sueño44. Además, es importante probar cuidadosamente la motilidad de la cepa de mosca antes de usarla en la detección para evitar influencias no deseadas.
Aquí hay algunos consejos útiles para una configuración exitosa: (1) Para evitar que los alimentos se peguen al tubo de vidrio al sacarlos del vaso de precipitados pequeño después de la solidificación, se puede intentar insertar el tubo de vidrio verticalmente en el fondo del vaso de precipitados pequeño antes de que los alimentos se solidifiquen. Puede ser eficaz tirar suavemente del tubo de vidrio hacia adelante y hacia atrás, golpear la parte inferior del vaso de precipitados para permitir la entrada de aire, girar lentamente el vaso de precipitados para eliminar toda la comida y el tubo de vidrio, y luego limpiar con cuidado cualquier resto de comida en la pared exterior del tubo de vidrio. (2) Al sellar el extremo alimentario del tubo de vidrio con una película de parafina, se recomienda usar un baño de agua para calentar lentamente la película hasta que la parafina se derrita. Este enfoque ayuda a evitar el problema de que el alimento medicinal salpique violentamente a altas temperaturas y contamine la película de parafina. Alternativamente, se pueden usar pequeñas tapas de plástico para sellar, pero asegúrese de que pueda entrar aire durante el sellado, lo que hace que los alimentos se empujen hacia arriba en general. (3) Vale la pena considerar que algunos medicamentos potentes que promueven el sueño pueden conducir inicialmente al juicio incorrecto de que las moscas probadas están muertas. Para superar este problema, se recomienda establecer un gradiente de concentración, lo que permite explorar la concentración óptima del fármaco y repetir el experimento. (4) Tenga en cuenta que el olor de la droga puede influir en la cantidad de alimento consumido por las moscas y su ingesta de la droga, lo que podría afectar la precisión de los resultados experimentales. Por lo tanto, puede ser beneficioso extender la duración del experimento de manera adecuada, asegurando que las moscas tengan tiempo suficiente para consumir la mayor cantidad de droga posible y mejorando el efecto de acumulación de la droga. (5) Para el procesamiento de datos, si bien muchas universidades e institutos tienen acceso a Matlab para uso público, existen alternativas de menor costo disponibles para individuos o instituciones de investigación que aún no han comprado el programa. Una opción recomendada es ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.
En conclusión, hemos desarrollado un procedimiento paso a paso para el cribado de fármacos para tratar los trastornos del sueño. Utilizando un modelo de mosca más viejo que exhibe un fenotipo de menor duración del sueño, se valida la eficacia de la reserpina para aumentar la duración del sueño en moscas hembras más viejas. Este método ofrece un nuevo enfoque para el cribado de fármacos con un importante potencial de aplicación y sirve de base para futuras investigaciones farmacológicas. Si bien los efectos de los medicamentos se evalúan en función de los fenotipos, el mecanismo subyacente de la acción de los medicamentos sigue siendo desconocido. Se llevarán a cabo más estudios para investigar la patología de los trastornos del sueño y la regulación molecular del sueño, arrojando así luz sobre los mecanismos farmacológicos implicados. Aunque la maquinaria circadiana de Drosophila tiene similitudes con los osciladores humanos, no deben pasarse por alto las diferencias en los mecanismos de control del sueño entre humanos y moscas. Este protocolo proporciona un marco básico para la detección de drogas para los trastornos del sueño. Sin embargo, la investigación futura determinará si alguno de los medicamentos seleccionados se puede utilizar para el tratamiento clínico, así como dilucidar sus mecanismos de acción.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Junhai Han por su discusión y comentarios. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 32170970 a Y.T y el "Proyecto Azul de Cianina" de la provincia de Jiangsu a Z.C.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
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