Summary
提示されているのは、高齢のショウジョウバエモデルにおける ショウジョウバエ の睡眠行動をモニタリングすることにより、睡眠を改善するためのハイスループット薬物スクリーニングのプロトコルです。
Abstract
睡眠は、健康と全体的な幸福に不可欠な要素であり、睡眠時間の短縮と断片的なパターンを特徴とする睡眠障害を頻繁に経験する高齢者にとって、しばしば課題となります。これらの睡眠障害は、糖尿病、心血管疾患、精神障害など、高齢者のさまざまな病気のリスクの増加とも相関しています。残念ながら、睡眠障害に対する既存の薬は、認知障害や依存症などの重大な副作用と関連しています。そのため、より安全で効果的な睡眠障害治療薬の開発が急務となっています。しかし、現在の薬物スクリーニング法では、コストが高く、実験期間が長いため、依然として制限要因となっています。
このプロトコルは、哺乳類と比較して高度に保存された睡眠調節メカニズムを持つ種である ショウジョウバエのメラノガスターを利用する費用対効果の高いハイスループットスクリーニング方法を記述しており、高齢者の睡眠障害を研究するための理想的なモデルとなっています。老化したハエに様々な微量化合物を投与することで、睡眠障害に対する効果を評価することができます。これらのハエの睡眠行動は、赤外線モニタリングデバイスを使用して記録され、オープンソースのデータパッケージであるSleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)で分析されます。このプロトコルは、睡眠調節のための低コストで再現性のある効率的なスクリーニングアプローチを提供します。ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く、飼育コストが低く、取り扱いが容易なため、この方法の優れた被験者として機能します。一例として、試験薬の1つであるレセルピンは、高齢のハエの睡眠時間を促進する能力を実証し、このプロトコルの有効性を強調しています。
Introduction
睡眠は、人間の生存に必要な必須行動の1つであり、急速眼球運動(REM)睡眠と非急速眼球運動(ノンレム)睡眠の2つの主要な状態によって特徴付けられます1。ノンレム睡眠は、N1(覚醒から睡眠への移行)、N2(浅い睡眠)、N3(深い睡眠、徐波睡眠)の3段階からなり、覚醒から深い睡眠への進行を表しています1。睡眠は心身の健康に重要な役割を果たします2.しかし、加齢により、成人の総睡眠時間、睡眠効率、徐波睡眠率、レム睡眠率が低下します3。高齢者は、徐波睡眠に比べて浅い睡眠により多くの時間を費やす傾向があり、夜間の覚醒に敏感になります。覚醒回数が増えると、平均睡眠時間が短くなり、その結果、高齢者の睡眠パターンが断片化され、マウスのHcrtニューロンの過度の興奮と関連している可能性があります4。さらに、加齢に伴う概日リズムのメカニズムの低下は、睡眠時間の早期シフトに寄与します5,6。これらの要因は、身体的疾患、心理的ストレス、環境要因、および薬物使用と組み合わさって、不眠症、レム睡眠行動障害、ナルコレプシー、周期的な脚の動き、むずむず脚症候群、睡眠呼吸障害などの睡眠障害の影響を受けやすくなります7,8。
疫学研究により、睡眠障害は、うつ病10、心血管疾患11、認知症12などの高齢者の慢性疾患9と密接に関連していることが示されています。睡眠障害への対処は、慢性疾患の改善と治療、および高齢者の生活の質の向上において重要な役割を果たします。現在、患者は主にベンゾジアゼピン、非ベンゾジアゼピン、メラトニン受容体作動薬などの薬剤に頼って睡眠の質を高めています13。しかし、ベンゾジアゼピンは、長期使用後に受容体のダウンレギュレーションと依存を引き起こし、中止時に重度の離脱症状を引き起こす可能性があります14,15。非ベンゾジアゼピン系薬剤は、認知症16、骨折17、がん18などのリスクも伴います。一般的に使用されるメラトニン受容体作動薬であるラメルテオンは、睡眠潜伏期間を短縮しますが、睡眠時間を増加させず、広範な初回通過排泄のために肝機能関連の懸念があります19。メラトニン受容体作動薬およびセロトニン受容体拮抗薬であるアゴメラチンは、うつ病関連の不眠症を改善するが、肝障害のリスクももたらす20。そのため、睡眠障害の治療や緩和のために、より安全な薬剤が急務となっています。しかし、分子実験や細胞実験、自動システム、コンピューター解析を組み合わせた現在の薬物スクリーニング戦略は、高価で時間がかかります21。受容体の構造と特性に依存する構造ベースの創薬戦略は、受容体の3次元構造を明確に理解する必要があり、薬物効果の予測能力に欠けています22。
2000年、1984年にキャンベルとトブラーが提唱した睡眠基準に基づいて23、研究者は睡眠24を研究するための単純な動物モデルを確立し、その中には睡眠のような状態を示すショウジョウバエ25,26も含まれていた。ショウジョウバエとヒトの解剖学的違いにもかかわらず、ショウジョウバエの睡眠を調節する多くの神経化学的要素とシグナル伝達経路は哺乳類の睡眠に保存されており、ヒトの神経疾患の研究を容易にしています27,28。ショウジョウバエは、ハエと哺乳類のコア振動子の違いにもかかわらず、概日リズムの研究にも広く使用されています29,30,31。したがって、ショウジョウバエは、睡眠行動の研究や睡眠関連の薬物スクリーニングを行うための貴重なモデル生物として機能します。
この研究は、高齢のハエを使用して睡眠障害を治療するための低分子薬をスクリーニングするための費用対効果の高いシンプルな表現型ベースのアプローチを提案しています。 ショウジョウバエ の睡眠調節は高度に保存されており25、加齢とともに観察される睡眠の減少は、薬物投与によって可逆的である可能性がある。したがって、この睡眠表現型に基づくスクリーニング法は、薬効を直感的に反映することができます。ハエに調査中の薬剤と餌の混合物を与え、ショウ ジョウバエ 活動モニター(DAM)32を使用して睡眠行動を監視および記録し、取得したデータをMATLABのオープンソースSCAMP2020データパッケージを使用して解析します(図1)。統計解析は、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して実行されます( 材料表を参照)。一例として、睡眠を増加させると報告された小胞モノアミントランスポーターの低分子阻害剤であるレセルピンに関する実験データを提示することにより、このプロトコルの有効性を実証します33。このプロトコルは、加齢に伴う睡眠障害を治療するための薬剤を特定するための貴重なアプローチを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC_3605、材料表を参照)から30日齢のw1118ハエを使用します。
1.熟成したショウジョウバエの準備
- 食品の準備
- 50 g/Lのコーンフレーク、110 g/Lの砂糖、5 g/Lの寒天、および25 g/Lの酵母を混合して、標準的なコーンスターチ培地を調製します。コーンフレークと酵母を水で加熱して糊化し、すべての物質を完全に溶かします。
- 培地が50〜60°Cに冷えたら、6 mL/Lのプロピオン酸を加え、速やかに培養ボトルに詰めます。
- ハエの飼育と老化したハエの準備
- 標準的なコーンスターチ培地を含むボトルでハエ株 w1118を繁殖させ、ボトルを25°C、相対湿度68%、照明条件500〜1000ルクス、および12時間:12時間の明暗サイクルの恒温インキュベーターに入れます。
- ハエの成長サイクルに応じて7日ごとにハエを新しいボトルに移し、同じボトル内の個体の年齢を一定に保ちます。
- 元のボトルから孵化したハエを移してから3日後に集め、新しいボトルに入れます。7日ごとにボトルを交換するという原則に従い、生後30日頃まで培養します。
2.モニタリング用の薬用食品とガラス管の調製
注:ガラス管調製の手順は、Jinらの研究に変更を加えた34に従ったものである。
- ガラス管の洗浄・乾燥
- ガラス管(直径5mm×長さ65mm、 材料表参照)を大きめのビーカーに入れて浸し、二重蒸留水で20分間沸騰させます。これを3回繰り返します。
- ガラス管を取り外して束ね、内部を二重蒸留水で3〜5回すすぎ、オーブンに入れて乾燥させます。
- 簡易培地(100mL)の調製
- 寒天1.5gとショ糖5gを二重蒸留水に溶解し、加熱し、100mLまで濃縮します。
- 培地が約70°Cに冷えたらプロピオン酸600μLを加え、恒温水浴で固化を防ぎます。
- 薬物が20 μMまたは50 μMに達するまで、約4 mLの単用培地とレセルピン( 材料表を参照)を10 mLの小さなビーカーに加えます。 ジメチルスルホキシド(DMSO)をネガティブコントロールグループの濃度0.2%に添加します。
- 薬品を含有するガラス管の調製
- 培地の流れを促進するために、適切な長さのガラス管を小さなビーカーに慎重に挿入します。媒体は大気圧により自然にガラス管に入ります。
- 培養液が完全に固まったらガラス管を引き出し、外壁を拭き取ると、一端に薬剤を含む培養液が入ったモニタリングガラス管が得られます。
- 固体パラフィンをビーカーで70°Cで溶けるまで加熱し、ガラス管の端を食品に近づけてパラフィン液に約5mm入れ、すばやく取り出します。パラフィンが固まるのを待って、ガラス管の食品端を密封します。
3. 実験計画とハエ処理
- 表1に従ってハエ処理の実験を計画します。
4. ショウジョウバエ の集合と睡眠モニタリング
注:ショウ ジョウバエ の組み立ての手順は、Jinらの研究に変更を加えて34 に従います。
- ハエをCO2 ガスで麻酔し、パラフィンで密封されたガラス管(チューブごとに1本)に入れ、吸収性の綿球で非食品の端を塞いで、ハエの逃げを防ぎ、空気の循環を確保します。
- 赤外線モニターにチューブをロードして監視します。
- ハエの入ったガラス管を赤外線モニターに同じ方向に組み立て、各薬剤に対応するモニター番号と穴番号を記録します。
- 各チューブのアライメントを調整し、赤外線がハエの活動範囲の中心を垂直に通過するようにします。
- 指定された設定に従って、フライスリープ暗室にある25°Cのインキュベーター内にモニターを配置します:25°C温度、Zeitgeber 12(ZT12)(現地時間08:00に相当)、およびZT24(現地時間08:00に相当)。このセットアップにより、ハエは12時間の明暗の周期を交互に経験します。
注意: モニタリング中にインキュベーター内の安定した環境を維持するために、モニタリングデータの収集が完了するまでドアを開けないようにしてください。 - DAM2システムを使用して監視を開始します( 材料表を参照)。
- 監視が完了したら、収集したデータを.txt形式でシステムからダウンロードします。
5. データ処理
注:DAMシステム、DAMFileScan107、およびSCAMPを使用したデータ処理は、公式Webサイトの指示に従って実行されました( 資料表を参照)。
- 上記のtxtファイルをDAMFileScan107ソフトウェアにインポートしてスキャンし、必要に応じて分割して睡眠データを取得します。
- セグメンテーションデータの開始時刻を、モニター起動後3日目の8:01(1分セグメンテーション)または8:00(30分セグメンテーション)とし、開始時刻の3日後の午前8:00を終了時刻とする(図2A1)。
注:ハエは少なくとも1日は監視環境に適応する必要があります。したがって、分割データの開始時刻を、モニター開始から 3 日目の午前 8 時に設定できます。 - 1 分間隔と 30 分間隔でデータを分割します。オプション「ビンの長さ」を1分に変更し、オプション「出力ファイルタイプ」をチャネルファイルに変更し、名前を変更して出力します。30分間のデータセグメンテーション方法は上記と同じです(図2A2-5)。
注: 1 分間隔と 30 分間隔でデータ セグメンテーションを実行する場合、2 つのファイルの最終的な名前変更は一貫している必要があります。そうしないと、後続の MATLAB 処理中に読み取れなくなる可能性があります。必要に応じて、出力後にファイル名を変更して、区別を容易にすることができます。
- セグメンテーションデータの開始時刻を、モニター起動後3日目の8:01(1分セグメンテーション)または8:00(30分セグメンテーション)とし、開始時刻の3日後の午前8:00を終了時刻とする(図2A1)。
- SCAMP2020を使用したデータ処理
- MatlabでプログラムパッケージSCAMP2020を開き、Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)をダブルクリックします(図2B)。
- そのサブフォルダ「Vecsey SCAMP Scripts」をパスに追加し、そのフォルダで「scamp.m」ファイルを見つけて実行します。次のポップアップウィンドウで、プロセス1分と30分のフォルダを順番に選択します(図2C、D)。
- モニターを選択し、 Load individual See Plots to preview(図3A1)をクリックして、表示される画像を確認します。死んだハエの対応するチャネルのチェックを外します(図3A2、 図3B)。
- 上記の手順を繰り返して、すべてのモニターを確認します。
- 各モニターの各チャンネルの名前を、テストする薬剤に基づいて変更し(図3A3)、すべてのモニターを選択して、分析のために選択したデータの分析をクリックします(図3A4)。
- 選択したオプションをデフォルトとし、[Analyze for Chosen Bin]をクリックし、[ Export Data]をオンにして、最後に[ Graph 30 min Data Types for All Days for Selected Groups]と[EXPORT All Data ]をクリックして結果を出力します(図3C)。
- CSVファイルからs30というファイルを選択し、各モニターの対応する平均値と標準誤差データを見つけ、Excelにバックアップして修正・調整し、GraphPad Prism(材料表参照)に貼り付けてスリープ状態図を描きます(図4A,B)。
- 「stdur」という名前のファイルを見つけて、3日以内の各ハエの昼間、夜間、総睡眠の平均値を計算します(図4A、C)。データをPrismソフトウェアに貼り付けて差分検定を完了し、グラフを描きます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
レセルピンは小胞性モノアミントランスポーター(VMAT)の低分子阻害剤であり、シナプス前小胞へのモノアミンの再取り込みを阻害し、睡眠時間の増加をもたらす33。レセルピンの睡眠促進効果は、30日齢のハエで調べられ、対照群には溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)のみが与えられました。レセルピン群では、高齢のハエはDMSO群と比較して、昼夜ともに有意に増加した睡眠を示した。図5A、Eは、3日間連続したレセルピンとDMSOの睡眠パターンを示し、図5B-Dと図5F-Hは、睡眠データに対する差動試験の結果を示しています。薬物が1つの性別にのみ作用する可能性を排除するために、オスのハエを使用して実験が繰り返されました。異なる濃度のレセルピン、20 μM、および50 μMを投与し、レセルピン濃度と睡眠促進との間に正の相関関係があることを示しました。
図1:加齢性睡眠障害に対する低分子薬物スクリーニングの実験プロセス。 高齢のハエは、試験する薬を含む餌と一緒に小さなガラス管に入れられました。睡眠パターンは、DAMシステムを使用して3日間継続的に監視されました。取得したデータをコンピュータに取り込み、処理、可視化、分析を行い、結論を導き出しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:データのスキャンと分割 。 (A)データの選択とスキャン、それに続く順次時間セグメンテーション。(B) 「Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)」フォルダの場所。(C) サブフォルダ「Vecsey SCAMP Scripts」をパスに追加します。(D)ファイル「scamp.m」の場所。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:睡眠データの選択と処理 。 (A)ハエの睡眠状態のプレビュー、死んだハエのチャネルのチェックを外し、選択したデータをグループ化して分析します。(B)ショウジョウバエの睡眠のプレビューでは、一様な青い長方形は活発な睡眠を示し、一様な青い長方形のある瞬間はハエが死んでいることを示唆しています。死んだハエは赤い長方形でマークされています。(C)選択したデータの分析と出力。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:睡眠データの分析結果 。 (A) CSVファイルから s30 ファイルと stdur ファイルを選択します。(B)「s30.csv」における各群の睡眠の平均値と標準誤差。(C)「stdur.csv」の3日以内の各ハエの昼間(Bin1、Bin3、Bin5)、夜間(Bin2、Bin4、Bin6)、および総睡眠の値。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:レセルピンで処理した老齢ハエの睡眠状態。 (A)0.2%DMSO、20μMレセルピン、および50μMレセルピンを給餌した高齢女性における3日以内の睡眠時間の概略図。(B-D)薬物の有無にかかわらず、3日以内の平均日中、夜間、および総睡眠時間の定量分析。結果は、レセルピンを投与された高齢女性の睡眠時間の有意な増加を示しています。N = 8 (各グループ)、一元配置分散分析、**p < 0.01、***p < 0.001。(E)0.2%DMSO、20μMレセルピン、および50μMレセルピンを投与された高齢男性の3日以内の睡眠時間の概略図。(F-H)薬物の有無にかかわらず、3日以内の平均日中、夜間、および総睡眠時間の定量分析。結果は、レセルピンを投与された男性で睡眠時間が増加したことを示しています。n = 16 (各グループ)、一元配置分散分析、*p < 0.05、**p < 0.01。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:若いハエと年老いたハエの睡眠時間の比較。 (A)老若男女の3日間の睡眠時間のモニタリングを示す模式図。(B-D)若年男性と高齢男性の3日間にわたる平均昼間、夜間、総睡眠時間を定量的に分析したところ、有意差は認められなかった。n = 32 各グループ、対応のない t 検定、n.s.、有意ではありません。(E)若年女性と高齢女性における3日間の睡眠時間の概略モニタリング。(F-H)若年女性と高齢女性の3日間にわたる平均昼間、夜間、総睡眠時間を定量的に分析したところ、高齢女性の昼間、夜間、総睡眠時間が若い女性と比較して有意に減少することが示されました。n = 32 各グループ、対応のない t 検定、****p < 0.0001。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 群 | 研究会 | 処遇 | ハエの年齢と性別 | ハエの数 | |||||
 |
通常のコントロール | 4 mL の単純培地と 0.2% DMSO を 4 日間 | 30日間の男性/女性 | グループあたり16匹のハエ | |||||
 |
低用量薬物検査 |
4 mL の単純培養培地と 20 μM のレセルピンを 4 日間 | 30日女性 | グループあたり16匹のハエ | |||||
 |
大量薬物検査 |
4 mL の単培養培地と 50 μM のレセルピンを 4 日間 | 30日女性 | グループあたり16匹のハエ | |||||
 |
低用量薬物検査 |
4 mL の単純培養培地と 20 μM のレセルピンを 4 日間 | 30日男性 | グループあたり16匹のハエ | |||||
 |
大量薬物検査 |
4 mL の単培養培地と 50 μM のレセルピンを 4 日間 | 30日男性 | グループあたり16匹のハエ | |||||
表1:ハエ処理の実験計画。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
記載された方法は、中小規模の睡眠薬を迅速にスクリーニングするのに適している。現在、主流のハイスループット薬物スクリーニング法のほとんどは、生化学的および細胞レベルに基づいています。例えば、受容体の構造および特性は、それに結合することができる特異的リガンドを探索するために検査される22。別のアプローチでは、質量分析による核磁気共鳴(NMR)を用いて、選択した薬物の分子断片の結合様式と強度を分析する35。しかし、これらの方法はスクリーニングの誤り率が比較的高いことが多く、動物実験や臨床実験で選択された薬剤は効果を示さないことが多い。体内での薬物の効能は、薬物の吸収、分布、代謝、排泄など様々な要因に影響され、誤検の割合が高くなっています。これに対し、提案法はハイスループット法に比べてスクリーニングスケールが小さいものの、表現型に対する薬剤効果を直接観察することで、より簡便で費用対効果の高いアプローチを提供します。これは、ショウ ジョウバエ モデルを効果的な薬物スクリーニングと薬物標的の同定に用いる可能性を示しています。
ショウジョウバエ は保存された睡眠調節機構を有しており、加齢に伴う睡眠障害を呈する。その結果、30日齢の雌のハエの睡眠時間は7日齢のハエよりも有意に短く、30日齢の雄のハエの睡眠時間は生後7日のハエと有意差がないことが分かりました(図6)。その結果、30日齢の雌のハエを今回の実験に選びました。偶発的な要因干渉を最小限に抑えるために、複数回のスクリーニングプロセスが実施されました。第1ラウンドの薬物濃度は、ハエの死亡率につながる可能性のある有毒な副作用を避けるために20μMに設定されました。2回目のスクリーニングでは、薬物濃度を50μMに上げて、さまざまな濃度での薬物の効果を評価しました。第2ラウンドで選抜した薬剤を雄のハエに20μMと50μMの両方で投与し、薬剤効果の性差を評価した。これにより、睡眠関連効果を一貫して示す薬物をスクリーニングすることができました。例えば、レセルピンは以前に、生後4〜6日の成虫の睡眠を増加させることが示されています31。この結果を、高齢のハエを用いたモデルで再現することに成功し、高齢の雌はレセルピンを投与した後、睡眠の有意な増加を示しました(図5)。
DMSOは薬物の溶解に使用されましたが、その潜在的な毒性を考慮する必要があります。以前の研究では、培地中の0.1%〜0.25%のDMSO濃度は24時間以内にラット有毛細胞に害を及ぼさないことが示されていますが、0.5%〜6%の濃度は細胞死を有意に増加させます36。同様に、DMSO濃度が0.1%以下であっても、ヒト肝細胞における主要な薬物代謝関連酵素やトランスポーターの発現に影響を与えないことがわかっています。それでも、濃度が高くなると、発現の変化が誘発されうる37。しかし、0.1%のDMSOは雌のハエの寿命に有意な影響を与えるが、雄のハエの寿命には影響しないことがわかっていることに注意すべきである38。さらに、15%および20%DMSOの腹腔内投与は、ラットの睡眠を妨げることが示されている39。DMSOの潜在的な毒性を軽減するために、その濃度を0.2%未満に保ちました。
現在、 ショウジョウバエの行動を特徴付けるために使用される2つの主要な方法があります。1つの方法は、フライの位置、速度、体の部分の微妙な動きなど、豊富な行動パラメータを提供するビデオ分析に基づいています。もう1つの方法は、DAMシステムなどの赤外線ビーム破壊に基づいています。40.しかしながら、PySoloのような特定のビデオ分析ツールは、複数の単一居住ハエを研究するために設計されており、カメラの下に配置できるハエの数が制限されていることに注意することが重要である41。C-trax42 や JAABA43 などの他のツールでは、個体群の追跡を実行できますが、計算コストと時間がかかります。ハイスループットスクリーニングでは、通常、ハエの全体的な睡眠時間を捉えるだけで十分であり、正確な動作パラメータは必要ありません。したがって、赤外線ビーム破壊に基づく広く使用され、拡張性の高い方法が好まれます。ただし、この方法にも制限があります。例えば、ハエが赤外線ビームを遮ることなくチューブの一端だけを移動する場合、システムはそれを誤って睡眠として記録し、睡眠を過大評価することにつながる可能性がある44。さらに、意図しない影響を避けるために、スクリーニングに使用する前にハエ株の運動性を慎重にテストすることが重要です。
(1)固化後に小さなビーカーから取り出すときにガラス管に食べ物がくっつかないように、食べ物が固まる前にガラス管を小さなビーカーの底に垂直に挿入してみてください。ガラス管をそっと前後に引っ張り、ビーカーの底を叩いて空気を入れ、ビーカーをゆっくりと回転させてすべての食品とガラス管を取り除き、ガラス管の外壁に残っている食品を慎重に拭き取ると効果的です。(2)ガラス管の食品端をパラフィンフィルムで密封する場合は、ウォーターバスを使用して、パラフィンが溶けるまでフィルムをゆっくりと加熱することをお勧めします。このアプローチは、薬用食品が高温で激しく飛散し、パラフィンフィルムを汚染するという問題を回避するのに役立ちます。または、密封に小さなプラスチックキャップを使用することもできますが、密封中に空気が入り、食品が全体的に押し上げられる可能性があることを確認してください。(3)一部の強力な睡眠促進薬は、最初は実験されたハエを死んだと誤って判断する可能性があることを考慮する価値があります。この課題を克服するには、濃度勾配を設定し、最適な薬物濃度を探索し、実験を繰り返すことが推奨されます。(4)薬剤の臭いは、ハエが消費する餌の量や薬剤の摂取量に影響を与え、実験結果の精度に影響を与える可能性があることを考慮に入れてください。したがって、実験の期間を適切に延長し、ハエができるだけ多くの薬物を消費するのに十分な時間を確保し、薬物の蓄積効果を高めることは有益です。(5)データ処理については、多くの大学や研究機関がMatlabを一般公開で利用できますが、プログラムをまだ購入していない個人や研究機関が利用できる低コストの代替手段があります。推奨されるオプションの1つは、ShinyR-DAM v3.1«Refresh»45です。
結論として、睡眠障害を治療するための薬をスクリーニングするための段階的な手順を開発しました。より短い睡眠時間の表現型を示す古いハエモデルを使用して、高齢の雌のハエの睡眠時間の増加におけるレセルピンの有効性が検証されています。この方法は、大きな応用の可能性を秘めた薬物スクリーニングへの新しいアプローチを提供し、さらなる薬物研究の基盤となります。薬物効果は表現型に基づいて評価されますが、薬物作用の根本的なメカニズムは不明のままです。今後は、睡眠障害の病態や睡眠の分子制御機構を解明し、薬理学的メカニズムを解明する研究を進めます。 ショウジョウバ エの概日機構はヒトの振動子と類似しているが、ヒトとハエの睡眠制御機構の違いも見逃せない。このプロトコルは、睡眠障害の薬物スクリーニングのための基本的なフレームワークを提供します。しかし、今後の研究によって、スクリーニングされた薬剤が臨床治療に利用できるかどうか、また、その作用機序が解明されることが期待されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
Junhai Han教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。この研究は、Y.T.32170970の中国国家自然科学基金会と、江蘇省のZ.C.Z.の「シアニンブループロジェクト」の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
References
- Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
- Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
- Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
- Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
- Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A.
- Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
- Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
- Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
- Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
- Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
- Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
- Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
- Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
- Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
- Lader, M.
- Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
- Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
- Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
- Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
- Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
- Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P.
- Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
- Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
- Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
- Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
- De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
- Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
- Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
- Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
- Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
- Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
- Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
- Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
- Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
