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Behavior

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Vorgestellt wird ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening zur Verbesserung des Schlafes durch Überwachung des Schlafverhaltens von Fruchtfliegen in einem älteren Drosophila-Modell .

Abstract

Schlaf, ein wesentlicher Bestandteil der Gesundheit und des allgemeinen Wohlbefindens, stellt ältere Menschen, die häufig unter Schlafstörungen leiden, die durch eine verkürzte Schlafdauer und fragmentierte Muster gekennzeichnet sind, oft vor Herausforderungen. Diese Schlafstörungen korrelieren auch mit einem erhöhten Risiko für verschiedene Krankheiten bei älteren Menschen, darunter Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische Störungen. Leider sind bestehende Medikamente gegen Schlafstörungen mit erheblichen Nebenwirkungen wie kognitiven Beeinträchtigungen und Sucht verbunden. Folglich ist die Entwicklung neuer, sichererer und wirksamerer Medikamente gegen Schlafstörungen dringend erforderlich. Die hohen Kosten und die lange Versuchsdauer der derzeitigen Drogenscreening-Methoden bleiben jedoch limitierende Faktoren.

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige und durchsatzfähige Screening-Methode, die Drosophila melanogaster verwendet, eine Spezies mit einem im Vergleich zu Säugetieren hochkonservierten Schlafregulationsmechanismus, was sie zu einem idealen Modell für die Untersuchung von Schlafstörungen bei älteren Menschen macht. Durch die Verabreichung verschiedener kleiner Substanzen an gealterte Fliegen können wir deren Auswirkungen auf Schlafstörungen beurteilen. Das Schlafverhalten dieser Fliegen wird mit einem Infrarot-Monitoring-Gerät aufgezeichnet und mit dem Open-Source-Datenpaket Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020) analysiert. Dieses Protokoll bietet einen kostengünstigen, reproduzierbaren und effizienten Screening-Ansatz für die Schlafregulation. Fruchtfliegen eignen sich aufgrund ihres kurzen Lebenszyklus, ihrer geringen Haltungskosten und ihrer einfachen Handhabung hervorragend für diese Methode. Zur Veranschaulichung zeigte Reserpin, eines der getesteten Medikamente, die Fähigkeit, die Schlafdauer bei älteren Fliegen zu verlängern, was die Wirksamkeit dieses Protokolls unterstreicht.

Introduction

Schlaf, eines der wesentlichen Verhaltensweisen, die für das menschliche Überleben notwendig sind, ist durch zwei Hauptzustände gekennzeichnet: REM-Schlaf (Rapid Eye Movement) und NREM-Schlaf (Non-Rapid Eye Movement)1. Der NREM-Schlaf besteht aus drei Phasen: N1 (der Übergang zwischen Wachheit und Schlaf), N2 (leichter Schlaf) und N3 (Tiefschlaf, langsamer Wellenschlaf), die den Übergang vom Wachschlaf zum Tiefschlaf darstellen1. Schlaf spielt eine entscheidende Rolle für die körperliche und geistige Gesundheit2. Das Altern reduziert jedoch die Gesamtschlafdauer, die Schlafeffizienz, den Prozentsatz des Slow-Wave-Schlafs und den Prozentsatz des REM-Schlafs bei Erwachsenen3. Ältere Menschen neigen dazu, mehr Zeit im leichten Schlaf zu verbringen als im Slow-Wave-Schlaf, was sie empfindlicher auf nächtliches Erwachen macht. Mit zunehmender Anzahl des Erwachens nimmt die durchschnittliche Schlafzeit ab, was bei älteren Menschen zu einem fragmentierten Schlafmuster führt, das bei Mäusen mit einer übermäßigen Erregung von Hcrt-Neuronen verbunden sein kann4. Darüber hinaus trägt ein altersbedingter Rückgang der zirkadianen Mechanismen zu einer früheren Verschiebung der Schlafdauer bei 5,6. In Kombination mit körperlichen Erkrankungen, psychischem Stress, Umweltfaktoren und Medikamenteneinnahme machen diese Faktoren ältere Erwachsene anfälliger für Schlafstörungen wie Schlaflosigkeit, REM-Schlaf-Verhaltensstörung, Narkolepsie, periodische Beinbewegungen, Restless-Legs-Syndrom und schlafbezogene Atmungsstörungen 7,8.

Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Schlafstörungen eng mit chronischen Krankheiten bei älteren Menschen verbunden sind9, darunter Depressionen10, Herz-Kreislauf-Erkrankungen 11 und Demenz12. Die Behandlung von Schlafstörungen spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung und Behandlung chronischer Krankheiten und der Verbesserung der Lebensqualität älterer Erwachsener. Derzeit verlassen sich Patienten hauptsächlich auf Medikamente wie Benzodiazepine, Nicht-Benzodiazepine und Melatoninrezeptoragonisten, um die Schlafqualität zu verbessern13. Benzodiazepine können jedoch nach langfristiger Anwendung zu einer Herunterregulierung der Rezeptoren und einer Abhängigkeit führen, was nach Absetzen zu schweren Entzugserscheinungen führt14,15. Nicht-Benzodiazepin-Medikamente bergen ebenfalls Risiken, darunter Demenz 16, Frakturen17 und Krebs18. Der häufig verwendete Melatoninrezeptor-Agonist Ramelteon reduziert die Schlaflatenz, verlängert aber nicht die Schlafdauer und hat aufgrund der umfangreichen First-Pass-Eliminierung Bedenken hinsichtlich der Leberfunktion19. Agomelatin, ein Melatoninrezeptor-Agonist und Serotoninrezeptor-Antagonist, verbessert depressionsbedingte Schlaflosigkeit, birgt aber auch das Risiko von Leberschäden20. Folglich besteht ein dringender Bedarf an sichereren Medikamenten zur Behandlung oder Linderung von Schlafstörungen. Derzeitige Strategien zur Überprüfung von Arzneimitteln, die auf molekularen und zellulären Experimenten in Kombination mit automatisierten Systemen und Computeranalysen basieren, sind jedoch teuer und zeitaufwändig21. Strukturbasierte Strategien zur Entwicklung von Arzneimitteln, die sich auf die Struktur und die Eigenschaften von Rezeptoren stützen, erfordern ein klares Verständnis der dreidimensionalen Struktur von Rezeptoren und verfügen nicht über Vorhersagefähigkeiten für Arzneimittelwirkungen22.

Im Jahr 2000 etablierten Forscher auf der Grundlage der von Campbell und Tobler 1984 vorgeschlagenen Schlafkriterien23 einfache Tiermodelle, um den Schlaf zu untersuchen 24, darunter Drosophila melanogaster, das schlafähnliche Zustände aufwies25,26. Trotz der anatomischen Unterschiede zwischen Drosophila und dem Menschen sind viele neurochemische Komponenten und Signalwege, die den Schlaf in Drosophila regulieren, im Schlaf von Säugetieren konserviert, was die Untersuchung menschlicher neurologischer Erkrankungen erleichtert27,28. Drosophila wird auch in großem Umfang in zirkadianen Rhythmusstudien verwendet, trotz der Unterschiede in den Kernoszillatoren zwischen Fliegen und Säugetieren 29,30,31. Daher dient Drosophila als wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung des Schlafverhaltens und die Durchführung schlafbezogener Wirkstoffscreenings.

Diese Studie schlägt einen kostengünstigen und einfachen phänotypbasierten Ansatz für das Screening von niedermolekularen Medikamenten zur Behandlung von Schlafstörungen mit gealterten Fliegen vor. Die Schlafregulation in Drosophila ist hochkonserviert25, und die mit zunehmendem Alter beobachtete Abnahme des Schlafes kann durch die Verabreichung von Medikamenten reversibel sein. Somit kann diese auf Schlafphänotyp basierende Screening-Methode intuitiv die Wirksamkeit von Medikamenten widerspiegeln. Wir füttern die Fliegen mit einer Mischung aus dem zu untersuchenden Medikament und Futter, überwachen und zeichnen das Schlafverhalten mit dem Drosophila Activity Monitor (DAM)32 auf und analysieren die gewonnenen Daten mit dem Open-Source-Datenpaket SCAMP2020 in MATLAB (Abbildung 1). Die statistische Analyse wird mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle). Als Beispiel demonstrieren wir die Wirksamkeit dieses Protokolls, indem wir experimentelle Daten zu Reserpin präsentieren, einem niedermolekularen Inhibitor des vesikulären Monoamintransporters, von dem berichtet wird, dass er den Schlaf erhöht33. Dieses Protokoll bietet einen wertvollen Ansatz zur Identifizierung von Medikamenten zur Behandlung altersbedingter Schlafprobleme.

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Protocol

Dieses Protokoll verwendet die 30 Tage alten w1118 Fliegen aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, siehe Materialtabelle).

1. Zubereitung der gereiften Fruchtfliegen

  1. Zubereitung von Speisen
    1. Bereiten Sie Standard-Maisstärke-Nährmedium vor, indem Sie 50 g/l Cornflakes, 110 g/l Zucker, 5 g/l Agar und 25 g/l Hefe mischen. Die Cornflakes und die Hefe mit Wasser erhitzen, um sie zu verkleistern, und dann alle Substanzen vollständig auflösen.
    2. Wenn das Medium auf 50-60 °C abgekühlt ist, fügen Sie 6 ml/l Propionsäure hinzu und verpacken Sie sie sofort in Kulturflaschen.
  2. Fliegenaufzucht und Vorbereitung von gealterten Fliegen
    1. Züchten Sie den Fliegenstamm w1118in Flaschen, die ein Standard-Maisstärke-Nährmedium enthalten, und legen Sie die Flaschen in einen Inkubator mit konstanter Temperatur bei 25° C, 68% relativer Luftfeuchtigkeit, 500-1000 Lux Lichtverhältnissen und einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
    2. Setzen Sie die Fliegen alle 7 Tage entsprechend dem Wachstumszyklus der Fliegen in eine neue Flasche um, um das Alter der Individuen in derselben Flasche konstant zu halten.
    3. Sammeln Sie die neue Ladung Fliegen, die 3 Tage nach dem Umfüllen aus der ursprünglichen Flasche schlüpfen, und legen Sie sie in eine neue Flasche. Nach dem Prinzip, die Flasche alle 7 Tage zu wechseln, werden sie kultiviert, bis sie etwa 30 Tage alt sind.

2. Zubereitung von Arzneinahrung und Glasröhrchen für die Überwachung

ANMERKUNG: Das Verfahren zur Herstellung von Glasröhrchen folgt der Arbeit von Jin et al. mit Modifikationen34.

  1. Reinigung und Trocknung von Glasrohren
    1. Das Glasröhrchen (5 mm Durchmesser x 65 mm Länge, siehe Materialtabelle) in ein großes Becherglas geben, einweichen und mit doppelt destilliertem Wasser 20 Minuten kochen. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
    2. Entfernen und bündeln Sie das Glasröhrchen, spülen Sie das Innere 3-5 Mal mit doppelt destilliertem Wasser ab und legen Sie es zum Trocknen in einen Ofen.
  2. Herstellung eines einfachen Nährmediums (100 ml)
    1. 1,5 g Agar und 5 g Saccharose in doppelt destilliertem Wasser auflösen, erhitzen und auf 100 ml konzentrieren.
    2. Wenn das Medium auf ca. 70 °C abgekühlt ist, werden 600 μl Propionsäure zugegeben, um ein Erstarren durch ein Wasserbad mit konstanter Temperatur zu verhindern.
    3. Geben Sie ca. 4 ml einfaches Medium und Reserpin (siehe Materialtabelle) in ein kleines 10-ml-Becherglas, bis das Arzneimittel 20 μM oder 50 μM erreicht.
  3. Herstellung der Glasröhrchen mit dem Medikament
    1. Um das Fließen des Mediums zu erleichtern, führen Sie vorsichtig ein geeignetes Stück Glasröhrchen in ein kleines Becherglas ein. Das Medium gelangt aufgrund des atmosphärischen Drucks auf natürliche Weise in die Glasröhre.
    2. Ziehen Sie das Glasröhrchen heraus, wenn das Nährmedium vollständig erstarrt ist, und wischen Sie die Außenwand ab, um ein Überwachungsglasröhrchen mit einem Nährmedium zu erhalten, das an einem Ende Arzneimittel enthält.
    3. Das feste Paraffin in einem Becherglas erhitzen, bis es bei 70 °C schmilzt, das Ende des Glasröhrchens in der Nähe des Lebensmittels ca. 5 mm in die Paraffinflüssigkeit stecken und schnell entfernen. Warten Sie, bis das Paraffin erstarrt ist, um das Ende des Glasröhrchens zu versiegeln.

3. Versuchsplanung und Fliegenbehandlung

  1. Entwerfen Sie das Experiment für die Fliegenbehandlung gemäß Tabelle 1.

4. Drosophila-Assemblierung und Schlafüberwachung

ANMERKUNG: Das Verfahren für die Drosophila-Assemblierung folgt der Arbeit von Jin et al.34 mit Modifikationen.

  1. Betäuben Sie Fliegen mit CO 2 -Gas, geben Sie sie in paraffinversiegelte Glasröhrchen (eines pro Röhrchen) und blockieren Sie dasNon-Food-Ende mit einem saugfähigen Wattebausch, um das Entweichen von Fliegen zu verhindern und die Luftzirkulation zu gewährleisten.
  2. Laden Sie Röhrchen auf den Infrarot-Monitor, um sie zu überwachen.
    1. Montieren Sie die Glasröhrchen mit den Fliegen auf einem Infrarotmonitor in der gleichen Richtung und notieren Sie die Monitornummer und die Lochnummer, die jedem Medikament entsprechen.
    2. Passen Sie die Ausrichtung jedes Tubus an und lassen Sie die Infrarotstrahlen vertikal durch die Mitte des Aktivitätsbereichs der Fliege gehen.
    3. Stellen Sie den Monitor in einen 25 °C warmen Inkubator in der Fliegenschlaf-Dunkelkammer und befolgen Sie die angegebenen Einstellungen: 25 °C Temperatur, Zeitgeber 12 (ZT12) (entspricht Ortszeit 20:00 Uhr) und ZT24 (entspricht Ortszeit 08:00 Uhr). Dieser Aufbau sorgt dafür, dass die Fliegen abwechselnd 12 Stunden Licht und Dunkelheit erleben.
      HINWEIS: Versuchen Sie, die Tür erst zu öffnen, wenn die Erfassung der Überwachungsdaten abgeschlossen ist, um während der Überwachung eine stabile Umgebung im Inkubator aufrechtzuerhalten.
    4. Starten Sie die Überwachung mit dem DAM2-System (siehe Materialtabelle).
    5. Sobald die Überwachung abgeschlossen ist, laden Sie die gesammelten Daten im .txt-Format aus dem System herunter.

5. Datenverarbeitung

HINWEIS: Die Datenverarbeitung mit dem DAM-System, DAMFileScan107 und SCAMP erfolgte gemäß den Anweisungen auf deren offiziellen Websites (siehe Materialtabelle).

  1. Importieren Sie die obige txt-Datei zum Scannen in die DAMFileScan107-Software und teilen Sie sie nach Bedarf auf, um Schlafdaten zu erhalten.
    1. Stellen Sie die Startzeit der Segmentierungsdaten auf 8:01 Uhr (1-minütige Segmentierung) oder 8:00 Uhr (30-minütige Segmentierung) am dritten Morgen nach dem Start der Monitore ein, und die Beendigungszeit ist 8:00 Uhr drei Tage nach der Startzeit (Abbildung 2A1).
      HINWEIS: Fliegen müssen sich mindestens einen Tag lang an die Überwachungsumgebung anpassen. So kann man die Startzeit der geteilten Daten am dritten Tag nach Beginn des Monitors auf 8 Uhr morgens einstellen.
    2. Teilen Sie die Daten in Intervallen von 1 Minute und 30 Minuten auf. Ändern Sie die Option "Papierkorblänge" auf 1 Minute, ändern Sie die Option "Ausgabedateityp" in Kanaldateien, benennen Sie sie um und geben Sie sie aus. Die 30-minütige Datensegmentierungsmethode ist die gleiche wie oben (Abbildung 2A2-5).
      HINWEIS: Wenn Sie die Datensegmentierung in Intervallen von 1 Minute und 30 Minuten durchführen, sollte die endgültige Umbenennung der beiden Dateien konsistent sein. Andernfalls kann es bei der nachfolgenden Matlab-Verarbeitung unlesbar sein. Bei Bedarf kann der Dateiname nach der Ausgabe geändert werden, um die Unterscheidung zu erleichtern.
  2. Datenverarbeitung mittels SCAMP2020
    1. Öffnen Sie das Programmpaket SCAMP2020 in Matlab, und doppelklicken Sie auf Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Abbildung 2B).
    2. Fügen Sie dem Pfad den Unterordner "Vecsey SCAMP Scripts" hinzu, suchen Sie die Datei "scamp.m" in diesem Ordner und führen Sie sie aus. Wählen Sie im folgenden Popup-Fenster nacheinander die Prozessordner 1 min und 30 min aus (Abbildung 2C,D).
    3. Wählen Sie einen Monitor aus, klicken Sie auf Einzelne anzeigen Siehe Plots zur Vorschau (Abbildung 3A1) und überprüfen Sie das angezeigte Bild. Deaktivieren Sie den entsprechenden Kanal für tote Fliegen (Abbildung 3A2, Abbildung 3B).
    4. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um alle Monitore zu überprüfen.
    5. Benennen Sie jeden Kanal in jedem Monitor basierend auf dem entsprechenden zu testenden Medikament um (Abbildung 3A3), wählen Sie alle Monitore aus und klicken Sie auf AUSGEWÄHLTE Daten für die Analyse analysieren (Abbildung 3A4).
    6. Standardmäßig auf die ausgewählte Option klicken, klicken Sie auf Analysieren für ausgewählten Abschnitt, aktivieren Sie Daten exportieren und klicken Sie schließlich auf GRAPH 30 min Datentypen für alle Tage für ausgewählte Gruppen und EXPORT Alle Daten , um die Ergebnisse auszugeben (Abbildung 3C).
  3. Wählen Sie die Datei mit dem Namen s30 aus der CSV-Datei aus, suchen Sie den entsprechenden Mittelwert und die Standardfehlerdaten für jeden Monitor, sichern Sie sie zur Änderung und Anpassung in Excel und fügen Sie sie in GraphPad Prism ein (siehe Materialtabelle), um ein Schlafstatusdiagramm zu zeichnen (Abbildung 4A,B).
  4. Suchen Sie die Datei mit dem Namen "stdur" und berechnen Sie die Durchschnittswerte für Tag, Nacht und Gesamtschlaf für jede Fliege innerhalb von drei Tagen (Abbildung 4A,C). Fügen Sie die Daten in die Prism-Software ein, um den Differenztest abzuschließen und ein Diagramm zu zeichnen.

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Representative Results

Reserpin ist ein niedermolekularer Inhibitor des vesikulären Monoamintransporters (VMAT), der die Wiederaufnahme von Monoaminen in präsynaptische Vesikel hemmt, was zu einem erhöhten Schlaf führt33. Die schlaffördernde Wirkung von Reserpin wurde an 30 Tage alten Fliegen untersucht, wobei die Kontrollgruppe ausschließlich mit dem Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. In der Reserpin-Gruppe zeigten ältere Fliegen im Vergleich zur DMSO-Gruppe signifikant mehr Schlaf sowohl tagsüber als auch nachts. Die Abbildungen 5A,E zeigen die Schlafmuster der Reserpin- und DMSO-Fliegen an drei aufeinanderfolgenden Tagen, während die Abbildungen 5B-D und 5F-H die Ergebnisse des Differentialtests der Schlafdaten zeigen. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das Medikament ausschließlich auf ein Geschlecht wirkt, wurden die Experimente mit männlichen Fliegen wiederholt. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Reserpin, 20 μM und 50 μM, verabreicht, was eine positive Korrelation zwischen der Reserpin-Konzentration und der Förderung des Schlafes zeigte.

Figure 1
Abbildung 1: Experimenteller Prozess des kleinmolekularen Wirkstoffscreenings für altersbedingte Schlafstörungen. Ältere Fliegen wurden in ein kleines Glasröhrchen mit Futter gesetzt, das die zu testenden Medikamente enthielt. Die Schlafmuster wurden drei Tage lang kontinuierlich mit dem DAM-System überwacht. Die erfassten Daten wurden zur Verarbeitung, Visualisierung und Analyse in einen Computer importiert, was zu Schlussfolgerungen führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Scannen und Teilen von Daten . (A) Datenauswahl und -scannen, gefolgt von einer sequenziellen zeitlichen Segmentierung. (B) Speicherort des Ordners "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Hinzufügen des Unterordners "Vecsey SCAMP Scripts" zum Pfad. (D) Speicherort der Datei "scamp.m". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswahl und Verarbeitung von Schlafdaten . (A) Vorschau der Schlafbedingungen der Fliege, Deaktivieren des Kanals für tote Fliegen und Gruppieren und Analysieren ausgewählter Daten. (B) Vorschau des Drosophila-Schlafs, wobei ein einheitliches blaues Rechteck einen aktiven Schlaf anzeigt, während ein bestimmter Moment eines einheitlichen blauen Rechtecks darauf hinweist, dass die Fliege tot ist. Tote Fliegen sind mit roten Rechtecken markiert. (C) Analyse und Ausgabe ausgewählter Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Ergebnisse der Schlafdatenanalyse . (A) Auswahl der s30 - und stdur-Dateien aus der CSV-Datei. (B) Der Durchschnittswert und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) des Schlafs für jede Gruppe in "s30.csv". (C) Werte für Tag (Bin1, Bin3, Bin5), Nacht (Bin2, Bin4, Bin6) und Gesamtschlaf für jede Fliege innerhalb von drei Tagen in "stdur.csv". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schlafbedingungen von gealterten Fliegen, die mit Reserpin behandelt wurden. (A) Schematische Darstellung der Schlafzeit innerhalb von 3 Tagen bei älteren Frauen, die mit 0,2 % DMSO, 20 μM Reserpin und 50 μM Reserpin gefüttert wurden. (B-D) Quantitative Analyse der durchschnittlichen Tages-, Nacht- und Gesamtschlafzeit innerhalb von 3 Tagen mit oder ohne Medikamente. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Verlängerung der Schlafzeit bei älteren Frauen, die mit Reserpin gefüttert wurden. N = 8 für jede Gruppe, unidirektionale ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Schematische Darstellung der Schlafzeit innerhalb von 3 Tagen bei älteren Männern, die mit 0,2 % DMSO, 20 μM Reserpin und 50 μM Reserpin gefüttert wurden. (F-H) Quantitative Analyse der durchschnittlichen Tages-, Nacht- und Gesamtschlafzeit innerhalb von 3 Tagen mit oder ohne Medikamente. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Schlafzeit bei Männern, die mit Reserpin gefüttert wurden, zunahm. n = 16 für jede Gruppe, unidirektionale ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Vergleich der Schlafdauer zwischen jungen und alten Fliegen. (A) Schematische Darstellung der Überwachung der Schlafdauer über 3 Tage bei jungen und alten Männchen. (B-D) Die quantitative Analyse der durchschnittlichen Tages-, Nacht- und Gesamtschlafzeit über 3 Tage bei jungen und alten Männern ergab keinen signifikanten Unterschied. n = 32 für jede Gruppe, ungepaarter t-Test, n.s., nicht signifikant. (E) Schematische Überwachung der Schlafdauer über 3 Tage bei jungen und alten Frauen. (F-H) Die quantitative Analyse der durchschnittlichen Tages-, Nacht- und Gesamtschlafzeit über 3 Tage bei jungen und alten Frauen zeigte eine signifikante Abnahme der Tages-, Nacht- und Gesamtschlafzeit bei alten Frauen im Vergleich zu jungen Frauen. n = 32 für jede Gruppe, ungepaarter t-Test, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gruppe Arbeitsgruppe Behandlung Alter und Geschlecht der Fliegen Anzahl der Fliegen
Equation 1 Normale Steuerelemente 4 ml einfaches Nährmedium mit 0,2 % DMSO für 4 Tage 30 Tage Männchen/Weibchen 16 Fliegen pro Gruppe
Equation 2 Niedrig dosierter DrogentestEquation 6 4 mL einfaches Nährmedium mit 20 μM Reserpin für 4 Tage 30 Tage Hündinnen 16 Fliegen pro Gruppe
Equation 3 Hochdosis-DrogentestEquation 6 4 mL einfaches Nährmedium mit 50 μM Reserpin für 4 Tage 30 Tage Hündinnen 16 Fliegen pro Gruppe
Equation 4 Niedrig dosierter DrogentestEquation 7 4 mL einfaches Nährmedium mit 20 μM Reserpin für 4 Tage 30 Tage Rüden 16 Fliegen pro Gruppe
Equation 5 Hochdosis-DrogentestEquation 7 4 mL einfaches Nährmedium mit 50 μM Reserpin für 4 Tage 30 Tage Rüden 16 Fliegen pro Gruppe

Tabelle 1: Versuchsplanung für die Fliegenbehandlung.

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Discussion

Die beschriebene Methode eignet sich für ein schnelles Screening von kleinen und mittelgroßen Schlafmitteln. Derzeit basieren die meisten gängigen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Methoden auf biochemischer und zellulärer Ebene. So werden beispielsweise die Struktur und die Eigenschaften des Rezeptors untersucht, um nach spezifischen Liganden zu suchen, die an ihn binden können22. Ein weiterer Ansatz besteht darin, den Bindungsmodus und die Stärke molekularer Fragmente ausgewählter Wirkstoffe mittels Kernspinresonanz (NMR) mit Massenspektrometriezu analysieren 35. Diese Methoden weisen jedoch oft eine relativ hohe Screening-Fehlerquote auf, und die durch sie ausgewählten Medikamente zeigen im Tier- oder klinischen Versuch oft keine Wirkung. Die Wirksamkeit von Medikamenten im Körper wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, wie z. B. der Absorption, Verteilung, dem Stoffwechsel und der Ausscheidung von Arzneimitteln, was zu einer hohen Rate an Fehlscreenings führt. Im Gegensatz dazu bietet unsere vorgeschlagene Methode, obwohl sie im Vergleich zu Hochdurchsatzmethoden einen kleineren Screening-Maßstab hat, einen einfacheren und kostengünstigeren Ansatz, indem sie die Wirkung von Medikamenten auf Phänotypen direkt beobachtet. Dies zeigt das Potenzial der Verwendung des Drosophila-Modells für ein effektives Wirkstoff-Screening und die Identifizierung von Wirkstoffzielen.

Drosophila besitzt einen konservierten Schlafregulationsmechanismus und zeigt Schlafstörungen, die mit dem Altern verbunden sind. Wir beobachteten, dass die Schlafdauer von 30 Tage alten weiblichen Fliegen signifikant kürzer war als die von 7 Tage alten Fliegen, während sich die Schlafdauer von 30 Tage alten männlichen Fliegen nicht signifikant von der von 7 Tage alten Fliegen unterschied (Abbildung 6). Folglich wurden 30 Tage alte weibliche Fliegen für die aktuellen Experimente ausgewählt. Der Screening-Prozess wurde in mehreren Runden durchgeführt, um zufällige Interferenzen zu minimieren. Die Wirkstoffkonzentration in der ersten Runde wurde auf 20 μM festgelegt, um toxische Nebenwirkungen zu vermeiden, die zum Fliegensterben führen könnten. In der zweiten Screening-Runde wurde die Wirkstoffkonzentration auf 50 μM erhöht, um die Wirkung des Medikaments bei unterschiedlichen Konzentrationen zu beurteilen. Die aus der zweiten Runde ausgewählten Medikamente wurden männlichen Fliegen sowohl bei 20 μM als auch bei 50 μM verabreicht, um die Geschlechtsunterschiede in der Arzneimittelwirkung zu bewerten. Dies ermöglichte es, nach Medikamenten zu suchen, die durchweg schlafbezogene Wirkungen zeigten. Zum Beispiel wurde bereits gezeigt, dass Reserpin den Schlaf bei erwachsenen Fliegen im Alter von 4-6 Tagen erhöht31. Wir haben dieses Ergebnis erfolgreich in unserem Modell mit älteren Fliegen repliziert, bei denen ältere Weibchen nach der Verabreichung von Reserpin eine signifikante Zunahme des Schlafes zeigten (Abbildung 5).

DMSO wurde verwendet, um die Medikamente aufzulösen, aber seine potenzielle Toxizität sollte berücksichtigt werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Konzentrationen von 0,1 % bis 0,25 % DMSO im Nährmedium die Haarzellen von Ratten innerhalb von 24 Stunden nicht schädigen, während Konzentrationen von 0,5 % bis 6 % den Zelltod signifikant erhöhen36. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass DMSO-Konzentrationen von 0,1 % oder weniger die Expression von Schlüsselenzymen oder -transportern, die mit dem Arzneimittelstoffwechsel in Verbindung stehen, in menschlichen Hepatozyten nicht beeinflussen. Dennoch können höhere Konzentrationen Veränderungen in der Expressioninduzieren 37. Es sollte jedoch beachtet werden, dass 0,1 % DMSO die Lebensdauer von weiblichen Fliegen, nicht aber von Männchen signifikant beeinflussen38. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die intraperitoneale Verabreichung von 15 % und 20 % DMSO den Schlaf bei Ratten beeinträchtigt39. Um die potenzielle Toxizität von DMSO zu mindern, haben wir seine Konzentration unter 0,2 % gehalten.

Derzeit gibt es zwei Hauptmethoden, um das Verhalten von Drosophila zu charakterisieren. Eine Methode basiert auf der Videoanalyse, die eine Fülle von Verhaltensparametern liefert, darunter Fliegenposition, Geschwindigkeit und subtile Bewegungen von Körperteilen. Die andere Methode basiert auf der Brechung von Infrarotstrahlen, wie z. B. das DAM-System. 40. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bestimmte Videoanalysewerkzeuge wie PySolo für die Untersuchung mehrerer Fliegen mit einem einzigen Bewohner ausgelegt sind, wodurch die Anzahl der Fliegen, die unter einer Kamera41 platziert werden können, begrenzt wird. Andere Tools wie C-trax42 und JAABA43 können Populationsverfolgung durchführen, sind aber rechenintensiv und zeitaufwändig. Für das Hochdurchsatz-Screening ist es in der Regel ausreichend, die Gesamtschlafdauer der Fliegen zu erfassen, und genaue Bewegungsparameter sind nicht erforderlich. Daher wird das weit verbreitete und hoch skalierbare Verfahren auf Basis der Infrarotstrahlbrechung bevorzugt. Diese Methode hat jedoch auch ihre Grenzen. Wenn sich Fliegen beispielsweise nur an einem Ende der Röhre bewegen, ohne den Infrarotstrahl zu unterbrechen, kann das System dies fälschlicherweise als Schlaf aufzeichnen, was zu einer Überschätzung des Schlafs führt44. Darüber hinaus ist es wichtig, die Beweglichkeit des Fliegenstamms sorgfältig zu testen, bevor er im Screening verwendet wird, um unbeabsichtigte Einflüsse zu vermeiden.

Hier sind einige hilfreiche Tipps für ein erfolgreiches Setup: (1) Um zu verhindern, dass Lebensmittel am Glasröhrchen kleben bleiben, wenn es nach dem Erstarren aus dem kleinen Becherglas entnommen wird, kann man versuchen, das Glasröhrchen senkrecht in den Boden des kleinen Bechers einzuführen, bevor das Lebensmittel erstarrt. Es kann effektiv sein, das Glasröhrchen vorsichtig hin und her zu ziehen, auf den Boden des Becherglases zu klopfen, um Luft eindringen zu lassen, das Becherglas langsam zu drehen, um alle Lebensmittel und das Glasröhrchen zu entfernen, und dann vorsichtig alle verbleibenden Lebensmittel an der Außenwand des Glasröhrchens abzuwischen. (2) Wenn Sie das Lebensmittelende des Glasrohrs mit Paraffinfolie versiegeln, wird empfohlen, die Folie in einem Wasserbad langsam zu erhitzen, bis das Paraffin schmilzt. Auf diese Weise wird vermieden, dass die medizinischen Lebensmittel bei hohen Temperaturen heftig spritzen und den Paraffinfilm verunreinigen. Alternativ kann man kleine Plastikkappen zum Versiegeln verwenden, aber darauf achten, dass beim Versiegeln Luft eindringen kann, wodurch die Lebensmittel insgesamt nach oben gedrückt werden. (3) Es ist zu bedenken, dass einige starke schlaffördernde Medikamente zunächst dazu führen können, dass getestete Fliegen fälschlicherweise als tot beurteilt werden. Um dieses Problem zu lösen, wird empfohlen, einen Konzentrationsgradienten festzulegen, der die Untersuchung der optimalen Wirkstoffkonzentration und die Wiederholung des Experiments ermöglicht. (4) Berücksichtigen Sie, dass der Geruch des Arzneimittels die von den Fliegen aufgenommene Nahrungsmenge und ihre Aufnahme des Arzneimittels beeinflussen kann, was möglicherweise die Genauigkeit der Versuchsergebnisse beeinträchtigt. Daher kann es von Vorteil sein, die Dauer des Experiments angemessen zu verlängern, um sicherzustellen, dass die Fliegen genügend Zeit haben, so viel Medikament wie möglich zu konsumieren, und den Akkumulationseffekt des Medikaments zu verstärken. (5) Für die Datenverarbeitung haben zwar viele Universitäten und Institute Zugang zu Matlab für die öffentliche Nutzung, aber es gibt kostengünstigere Alternativen für Einzelpersonen oder Forschungseinrichtungen, die das Programm noch nicht erworben haben. Eine empfohlene Option ist ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

Abschließend haben wir ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für das Screening von Medikamenten zur Behandlung von Schlafstörungen entwickelt. Anhand eines älteren Fliegenmodells, das einen Phänotyp mit kürzerer Schlafdauer aufweist, wird die Wirksamkeit von Reserpine bei der Verlängerung der Schlafdauer bei älteren weiblichen Fliegen validiert. Diese Methode bietet einen neuen Ansatz für das Wirkstoff-Screening mit erheblichem Anwendungspotenzial und dient als Grundlage für die weitere Wirkstoffforschung. Während Arzneimittelwirkungen auf der Grundlage von Phänotypen beurteilt werden, bleibt der zugrunde liegende Wirkmechanismus des Arzneimittels unbekannt. Weitere Studien werden durchgeführt, um die Pathologie von Schlafstörungen und die molekulare Regulation des Schlafes zu untersuchen und so die pharmakologischen Mechanismen aufzuklären. Obwohl die zirkadiane Maschinerie in Drosophila Ähnlichkeiten mit menschlichen Oszillatoren aufweist, sollten Unterschiede in den Schlafkontrollmechanismen zwischen Menschen und Fliegen nicht übersehen werden. Dieses Protokoll bietet ein grundlegendes Gerüst für das medikamentöse Screening von Schlafstörungen. Zukünftige Forschungen werden jedoch bestimmen, ob eines der untersuchten Medikamente für die klinische Behandlung verwendet werden kann, und ihre Wirkmechanismen aufklären.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Acknowledgments

Wir danken den Labormitgliedern von Prof. Junhai Han für ihre Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China 32170970 an Y.T und dem "Cyanine Blue Project" der Provinz Jiangsu an Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

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Hochdurchsatz niedermolekulares Wirkstoff-Screening altersbedingte Schlafstörungen Drosophila melanogaster Schlafdauer fragmentierte Muster ältere Menschen Krankheiten Diabetes Herz-Kreislauf-Erkrankungen psychische Störungen vorhandene Medikamente Nebenwirkungen kognitive Beeinträchtigung Sucht sicherere Medikamente wirksame Medikamente gegen Schlafstörungen kostengünstige Screening-Methode Schlafregulationsmechanismus Modellorganismus Infrarot-Überwachungsgerät Schlaf- und circadiane Analyse MATLAB-Programm 2020 (SCAMP2020) kostengünstiges Screening-Protokoll
Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit <em>Drosophila melanogaster</em>
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Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

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