Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

מוצג פרוטוקול לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה לשיפור השינה על ידי ניטור התנהגות השינה של זבובי פירות במודל דרוזופילה קשיש.

Abstract

שינה, מרכיב חיוני של בריאות ורווחה כללית, מציבה לעתים קרובות אתגרים לאנשים מבוגרים שחווים לעתים קרובות הפרעות שינה המאופיינות במשך שינה מקוצר ודפוסים מקוטעים. הפרעות שינה אלה קשורות גם לסיכון מוגבר למחלות שונות בקרב קשישים, כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם והפרעות פסיכולוגיות. למרבה הצער, התרופות הקיימות להפרעות שינה קשורות לתופעות לוואי משמעותיות כגון פגיעה קוגניטיבית והתמכרות. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בפיתוח תרופות חדשות, בטוחות ויעילות יותר להפרעות שינה. עם זאת, העלות הגבוהה ומשך הניסוי הממושך של שיטות סינון התרופות הנוכחיות נותרו גורמים מגבילים.

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- Drosophila melanogaster, מין בעל מנגנון ויסות שינה שמור מאוד בהשוואה ליונקים, מה שהופך אותו למודל אידיאלי לחקר הפרעות שינה אצל קשישים. על-ידי מתן תרכובות קטנות שונות לזבובים מזדקנים, אנו יכולים להעריך את השפעתם על הפרעות שינה. התנהגויות השינה של זבובים אלה נרשמות באמצעות מכשיר ניטור אינפרא אדום ומנותחות באמצעות חבילת הנתונים בקוד פתוח Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). פרוטוקול זה מציע גישת סינון זולה, ניתנת לשחזור ויעילה לוויסות שינה. זבובי פירות, בשל מחזור החיים הקצר שלהם, עלות הגידול הנמוכה וקלות הטיפול, משמשים כנושאים מצוינים לשיטה זו. לשם המחשה, רסרפין, אחת התרופות שנבדקו, הדגימה את היכולת לקדם את משך השינה אצל זבובים קשישים, והדגישה את יעילותו של פרוטוקול זה.

Introduction

שינה, אחת ההתנהגויות החיוניות להישרדות האדם, מאופיינת בשני מצבים עיקריים: שינה של תנועת עיניים מהירה (REM) ושינה של תנועת עיניים לא מהירה (NREM)1. שנת NREM מורכבת משלושה שלבים: N1 (המעבר בין ערות לשינה), N2 (שינה קלה) ו-N3 (שינה עמוקה, שנת גלים איטיים), המייצגים את ההתקדמות מעירות לשינה עמוקה1. שינה ממלאת תפקיד מכריע בבריאות הגופנית והנפשית2. עם זאת, הזדקנות מפחיתה את משך השינה הכולל, יעילות השינה, אחוז השינה בגלים איטיים ואחוז שנת REM אצל מבוגרים3. אנשים מבוגרים נוטים לבלות יותר זמן בשינה קלה בהשוואה לשנת גלים איטיים, מה שהופך אותם לרגישים יותר להתעוררויות ליליות. ככל שמספר ההתעוררויות עולה, זמן השינה הממוצע יורד, וכתוצאה מכך דפוס שינה מקוטע אצל קשישים, אשר עשוי להיות קשור לעירור יתר של נוירוני Hcrt בעכברים4. נוסף על כך, ירידה תלוית גיל במנגנונים צירקדיים תורמת לשינוי מוקדם יותר במשך השינה 5,6. בשילוב עם מחלות פיזיות, לחץ פסיכולוגי, גורמים סביבתיים ושימוש בתרופות, גורמים אלה הופכים מבוגרים לרגישים יותר להפרעות שינה, כגון נדודי שינה, הפרעת התנהגות בשינה REM, נרקולפסיה, תנועות רגליים תקופתיות, תסמונת רגליים חסרות מנוחה והפרעות נשימה בשינה 7,8.

מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי הפרעות שינה קשורות קשר הדוק למחלות כרוניות בקרב קשישים9, כולל דיכאון 10, מחלות לב וכלי דם11 ודמנציה12. לטיפול בהפרעות שינה תפקיד מכריע בשיפור וטיפול במחלות כרוניות ובשיפור איכות החיים של אנשים מבוגרים. כיום, חולים מסתמכים בעיקר על תרופות כגון בנזודיאזפינים, שאינם בנזודיאזפינים ואגוניסטים לקולטני מלטונין כדי לשפר את איכות השינה13. עם זאת, בנזודיאזפינים יכולים להוביל לירידה ברגולציה של קולטנים ותלות לאחר שימוש ארוך טווח, מה שגורם לתסמיני גמילה חמורים עם הפסקת14,15. תרופות שאינן בנזודיאזפינים נושאות גם סיכונים, כולל דמנציה 16, שברים17 וסרטן18. אגוניסט קולטן מלטונין נפוץ, ramelteon, מפחית את חביון השינה אבל לא מאריך את משך השינה ויש לו חששות הקשורים לתפקוד הכבד עקב חיסול נרחב של מעבר ראשון19. אגומלטין, אגוניסט לקולטן מלטונין ואנטגוניסט לקולטן סרוטונין, משפר נדודי שינה הקשורים לדיכאון אך גם מהווה סיכון לנזק לכבד20. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בתרופות בטוחות יותר לטיפול או הקלה על הפרעות שינה. עם זאת, אסטרטגיות סינון התרופות הנוכחיות, המבוססות על ניסויים מולקולריים ותאיים בשילוב עם מערכות אוטומטיות וניתוח ממוחשב, הן יקרות וגוזלות זמןרב 21. אסטרטגיות תכנון תרופות מבוססות מבנה, המסתמכות על מבנה הקולטן ותכונותיו, דורשות הבנה ברורה של המבנה התלת-ממדי של הקולטן וחסרות יכולות ניבוי להשפעות התרופה22.

בשנת 2000, בהתבסס על קריטריוני השינה שהוצעו על ידי קמפבל וטובלר בשנת 1984 23, חוקרים הקימו מודלים פשוטים של בעלי חיים כדי לחקור שינה 24, כולל Drosophila melanogaster, אשר הציג מצבים דמויי שינה25,26. למרות ההבדלים האנטומיים בין דרוזופילה לבני אדם, מרכיבים נוירוכימיים רבים ומסלולי איתות המווסתים את השינה בדרוזופילה נשמרים בשנת יונקים, מה שמקל על חקר מחלות נוירולוגיות אנושיות 27,28. דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב גם במחקרי שעון ביולוגי, למרות הבדלים במתנדי הליבה בין זבובים ליונקים 29,30,31. לכן, דרוזופילה משמשת כאורגניזם מודל רב ערך לחקר התנהגות השינה וביצוע בדיקות סקר הקשורות לשינה.

מחקר זה מציע גישה חסכונית ופשוטה מבוססת פנוטיפ לסינון תרופות במולקולות קטנות לטיפול בהפרעות שינה באמצעות זבובים מזדקנים. ויסות השינה בדרוזופילה נשמר מאוד25, והירידה בשינה שנצפתה עם הגיל עשויה להיות הפיכה באמצעות מתן תרופות. לפיכך, שיטת סינון זו המבוססת על פנוטיפ שינה יכולה לשקף באופן אינטואיטיבי את יעילות התרופה. אנו מאכילים את הזבובים בתערובת של התרופה הנחקרת ומזון, מנטרים ומתעדים התנהגות שינה באמצעות Drosophila Activity Monitor (DAM)32, ומנתחים את הנתונים שנרכשו באמצעות חבילת הנתונים SCAMP2020 בקוד פתוח ב-MATLAB (איור 1). ניתוח סטטיסטי מתבצע באמצעות סטטיסטיקה ותוכנות גרפים (ראה טבלת חומרים). לדוגמה, אנו מדגימים את יעילותו של פרוטוקול זה על ידי הצגת נתונים ניסיוניים על Reserpine, מעכב מולקולות קטנות של טרנספורטר מונואמין שלפוחית שדווח כמגביר שינה33. פרוטוקול זה מספק גישה חשובה לזיהוי תרופות לטיפול בבעיות שינה הקשורות לגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה משתמש בזבובי w1118 בני 30 יום ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC_3605, ראה טבלת חומרים).

1. הכנת זבובי הפירות המיושנים

  1. הכנת מזון
    1. הכינו תרבית עמילן תירס סטנדרטית על ידי ערבוב 50 גרם / ליטר קורנפלקס, 110 גרם / ליטר סוכר, 5 גרם / ליטר אגר ו 25 גרם / ליטר שמרים. מחממים את הקורנפלקס והשמרים במים כדי לג'לטין, ולאחר מכן ממיסים לחלוטין את כל החומרים.
    2. כאשר המדיום מתקרר ל 50-60 מעלות צלזיוס, מוסיפים 6 מ"ל / ליטר של חומצה פרופיונית ומיד לארוז אותם לתוך בקבוקי תרבית.
  2. גידול זבובים והכנת זבובים מזדקנים
    1. הרבו את זן הזבוב w1118בבקבוקים המכילים מדיום סטנדרטי לתרבית קורנפלור והכניסו את הבקבוקים לאינקובטור טמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 68% לחות יחסית, תנאי תאורה של 500-1000 לוקס ומחזור אור כהה של 12 שעות: 12 שעות.
    2. מעבירים זבובים לבקבוק חדש כל 7 ימים בהתאם למחזור הגדילה של הזבובים, תוך שמירה על גיל אחיד של הפרטים באותו בקבוק.
    3. אספו את קבוצת הזבובים החדשה שבקעה מהבקבוק המקורי 3 ימים לאחר העברתם והכניסו אותם לבקבוק חדש. בעקבות העיקרון של החלפת הבקבוק כל 7 ימים, הם יהיו בתרבית עד סביב גיל 30 ימים.

2. הכנת מזון רפואי וצינורות זכוכית לניטור

הערה: הליך הכנת צינור זכוכית עוקב אחר עבודתם של ג'ין ואחרים עם שינויים34.

  1. ניקוי וייבוש צינורות זכוכית
    1. מניחים את צינור הזכוכית (קוטר 5 מ"מ x 65 מ"מ אורך, ראו טבלת חומרים) לתוך גדולה, משרים אותה ומרתיחים אותה במים מזוקקים כפול למשך 20 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.
    2. מוציאים וצרורים את צינור הזכוכית, שוטפים את החלק הפנימי במים מזוקקים כפול 3-5 פעמים ומכניסים לתנור לייבוש.
  2. הכנת מדיום תרבית פשוטה (100 מ"ל)
    1. ממיסים 1.5 גרם אגר ו-5 גרם סוכרוז במים מזוקקים כפול, מחממים ומתרכזים עד 100 מ"ל.
    2. הוסף 600 μL חומצה propionic כאשר המדיום מתקרר לכ 70 ° C, מונע ממנו להתמצק באמצעות אמבט מים טמפרטורה קבועה.
    3. הוסף כ 4 מ"ל של מדיום פשוט ו Reserpine (ראה טבלה של חומרים) לתוך קטנה 10 מ"ל עד התרופה מגיע 20 מיקרומטר או 50 מיקרומטר. להוסיף dimethyl sulfoxide (DMSO) לריכוז של 0.2% בקבוצת הביקורת שלילית.
  3. הכנת צינורות זכוכית המכילים תרופות
    1. כדי להקל על זרימת המדיום, הכנס בזהירות אורך מתאים של צינור זכוכית לתוך קטנה. התווך ייכנס באופן טבעי לצינור הזכוכית עקב לחץ אטמוספרי.
    2. משוך את צינור הזכוכית כאשר מדיום התרבית מוצק לחלוטין ונגב את הקיר החיצוני כדי לקבל צינור זכוכית ניטור עם מדיום תרבית המכיל סמים בקצה אחד.
    3. מחממים את הפרפין המוצק בכוס עד שהוא נמס ב 70 מעלות צלזיוס, מכניסים את קצה צינור הזכוכית קרוב למזון לתוך נוזל הפרפין כ -5 מ"מ, ומסירים אותו במהירות. המתן עד שהפרפין יתמצק כדי לאטום את קצה המזון של צינור הזכוכית.

3. תכנון ניסויי וטיפול בזבובים

  1. תכננו את הניסוי לטיפול בזבוב לפי טבלה 1.

4. הרכבת דרוזופילה וניטור שינה

הערה: ההליך להרכבת דרוזופילה עוקב אחר עבודתם של ג'ין ואחרים 34 עם שינויים.

  1. מרדימים זבובים בגזCO2 , מכניסים אותם לצינורות זכוכית אטומים בפרפין (אחד לכל צינור), וחוסמים את הקצה שאינו מזון עם כדור צמר גפן סופג כדי למנוע מזבובים לברוח ולהבטיח זרימת אוויר.
  2. טען צינורות על צג האינפרא אדום לצורך ניטורם.
    1. הרכיבו את צינורות הזכוכית המכילים זבובים על צג אינפרא אדום באותו כיוון, ורשמו את מספר הצג ומספר החור המתאימים לכל תרופה.
    2. התאימו את היישור של כל צינור, וגרמו לקרני האינפרא אדום לעבור אנכית דרך מרכז טווח הפעילות של הזבוב.
    3. מקם את הצג בתוך אינקובטור של 25 מעלות צלזיוס הממוקם בחדר החושך של הזבוב, בהתאם להגדרות שצוינו: טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, צייטגבר 12 (ZT12) (שווה ערך לזמן המקומי 08:00 בערב) ו- ZT24 (שווה ערך לזמן המקומי 08:00 בבוקר). מערך זה מבטיח שהזבובים יחוו לסירוגין פרקי זמן של 12 שעות של אור וחושך.
      הערה: נסה לא לפתוח את הדלת עד להשלמת איסוף הנתונים לניטור כדי לשמור על סביבה יציבה בחממה במהלך הניטור.
    4. התחל ניטור באמצעות מערכת DAM2 (ראה טבלת חומרים).
    5. לאחר השלמת הניטור, הורד את הנתונים שנאספו בפורמט .txt מהמערכת.

5. עיבוד נתונים

הערה: עיבוד הנתונים באמצעות מערכת DAM, DAMFileScan107 ו- SCAMP בוצע בהתאם להוראות באתרי האינטרנט הרשמיים שלהם (ראה טבלת חומרים).

  1. ייבא את קובץ txt לעיל לתוכנת DAMFileScan107 לסריקה וחלק אותו לפי הצורך כדי לקבל נתוני שינה.
    1. הגדר את שעת ההתחלה של נתוני הסגמנטציה ל- 8:01 (פילוח של דקה אחת) או 8:00 (פילוח של 30 דקות) בבוקר השלישי לאחר הפעלת המוניטורים, ושעת הסיום היא 8:00 בבוקר שלושה ימים לאחר שעת ההתחלה (איור 2A1).
      הערה: הזבובים חייבים להסתגל לסביבת הניטור למשך יום אחד לפחות. לכן, ניתן להגדיר את שעת ההתחלה של הנתונים המפוצלים ל-8 בבוקר ביום השלישי לאחר תחילת הצג.
    2. פצל את הנתונים במרווחי זמן של דקה ו- 30 דקות. שנה את האפשרות "אורך סל" לדקה אחת, שנה את האפשרות "סוג קובץ פלט" לקבצי ערוץ, שינוי שם ופלט. שיטת פילוח הנתונים של 30 דקות זהה לזו שלעיל (איור 2A2-5).
      הערה: בעת ביצוע פילוח נתונים במרווחים של דקה ו- 30 דקות, שינוי השם הסופי של שני הקבצים צריך להיות עקבי; אחרת, ייתכן שלא ניתן יהיה לקרוא אותו במהלך עיבוד Matlab לאחר מכן. במידת הצורך, ניתן לשנות את שם הקובץ לאחר הפלט כדי להקל על הבידול.
  2. עיבוד נתונים באמצעות SCAMP2020
    1. פתחו את חבילת התוכנית SCAMP2020 ב-Matlab, ולחצו פעמיים על Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (איור 2B).
    2. הוסף את תיקיית המשנה שלו "Vecsey SCAMP Scripts" לנתיב, מצא את הקובץ "scamp.m" בתיקיה זו והפעל אותו. בחלון המוקפץ הבא, בחרו את התיקיות של התהליך ברצף של דקה ו-30 דקות (איור 2C,D).
    3. בחר צג, לחץ על טען חלקות בודדות לתצוגה מקדימה (איור 3A1), ובדוק את התמונה שמופיעה. בטל את הסימון של הערוץ המתאים של זבובים מתים (איור 3A2, איור 3B).
    4. חזור על השלבים לעיל כדי לבדוק את כל הצגים.
    5. שנה את שם כל ערוץ בכל צג בהתבסס על התרופה המתאימה לבדיקה (איור 3A3), בחר את כל הצגים ולחץ על נתח נתונים נבחרים לניתוח (איור 3A4).
    6. ברירת מחדל לאפשרות שנבחרה, לחץ על נתח עבור סל נבחר, סמן ייצוא נתונים, ולבסוף לחץ על GRAPH 30 min סוגי נתונים עבור כל הימים עבור קבוצות נבחרות וייצוא כל הנתונים כדי להפיק את התוצאות (איור 3C).
  3. בחר את הקובץ בשם s30 מקובץ ה- CSV, מצא את הערך הממוצע המתאים ואת נתוני השגיאה הסטנדרטיים עבור כל צג, גבה אותו ב- Excel לצורך שינוי והתאמה והדבק אותו ב- GraphPad Prism (ראה טבלת חומרים) כדי לצייר דיאגרמת מצב שינה (איור 4A,B).
  4. מצאו את הקובץ שנקרא "stdur" וחשבו את הערכים הממוצעים של שעות היום, הלילה והשינה הכוללת עבור כל זבוב בתוך שלושה ימים (איור 4A,C). הדבק את הנתונים בתוכנת פריזמה כדי להשלים את בדיקת ההבדל ולצייר גרף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpine הוא מעכב מולקולה קטנה של טרנספורטר מונואמין שלפוחית (VMAT), אשר מעכב את ספיגה מחדש של מונואמינים לתוך שלפוחיות presynaptic, המוביל שינה מוגברת33. ההשפעות מעודדות השינה של רסרפיין נבדקו בזבובים בני 30 יום, כאשר קבוצת הביקורת ניזונה אך ורק מדימתיל סולפוקסיד הממס (DMSO). בקבוצת Reserpine, זבובים מבוגרים יותר הציגו שינה מוגברת באופן משמעותי הן ביום והן בלילה בהשוואה לקבוצת DMSO. איור 5A,E ממחיש את דפוסי השינה של זבובי Reserpine ו-DMSO במשך שלושה ימים רצופים, בעוד שאיור 5B-D ואיור 5F-H מראים את תוצאות הבדיקה הדיפרנציאלית על נתוני השינה. כדי למנוע את האפשרות שהתרופה תפעל אך ורק על מין אחד, הניסויים חזרו על עצמם באמצעות זבובים זכרים. ניתנו ריכוזים שונים של Reserpine, 20 μM ו-50 μM, והראו מתאם חיובי בין ריכוז Reserpine לבין קידום שינה.

Figure 1
איור 1: סינון תרופות מולקולרי קטן עבור הפרעות שינה הקשורות לגיל תהליך ניסיוני. זבובים קשישים הוכנסו לצינור זכוכית קטן עם מזון שהכיל את התרופות לבדיקה. דפוסי השינה נוטרו ברציפות במשך שלושה ימים באמצעות מערכת DAM. הנתונים שנרכשו יובאו למחשב לצורך עיבוד, הדמיה וניתוח, והובילו למסקנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סריקה וחלוקה של נתונים. (A) בחירה וסריקה של נתונים, ולאחר מכן פילוח זמני רציף. (B) מיקום התיקיה "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) הוספת תיקיית המשנה "Vecsey SCAMP Scripts" לנתיב. (ד) מיקום הקובץ "scamp.m". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בחירה ועיבוד של נתוני שינה . (A) תצוגה מקדימה של תנאי השינה של הזבובים, ביטול הסימון של הערוץ לאיתור זבובים מתים, קיבוץ וניתוח של נתונים נבחרים. (B) תצוגה מקדימה של שנת דרוזופילה, שבה מלבן כחול אחיד מצביע על שינה פעילה, בעוד שרגע מסוים של מלבן כחול אחיד מצביע על כך שהזבוב מת. זבובים מתים מסומנים במלבנים אדומים. (ג) ניתוח ופלט של נתונים נבחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות ניתוח נתוני שינה . (A) בחירת קובצי s30 וקובצי stdur מקובץ ה-CSV. (B) הערך הממוצע ושגיאת התקן של הממוצע (SEM) של שינה עבור כל קבוצה ב- "s30.csv". (C) ערכים של שעות היום (Bin1, Bin3, Bin5), שעות הלילה (Bin2, Bin4, Bin6), והשינה הכוללת של כל זבוב בתוך שלושה ימים ב-"stdur.csv". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מצבי שינה של זבובים זקנים שטופלו ב-Reserpine. (A) ייצוג סכמטי של זמן השינה תוך 3 ימים בנקבות מבוגרות שניזונו מ-0.2% DMSO, 20 μM Reserpine ו-50 μM Reserpine. (ב-ד) ניתוח כמותי של זמן השינה הממוצע בשעות היום, הלילה והזמן הכולל בתוך 3 ימים עם או בלי תרופות. התוצאות מראות עלייה משמעותית בזמן השינה אצל נקבות מבוגרות שניזונו מרסרפין. N = 8 עבור כל קבוצה, ANOVA בכיוון אחד, **p < 0.01, ***p < 0.001. (E) ייצוג סכמטי של זמן השינה תוך 3 ימים בזכרים מבוגרים שניזונו מ-0.2% DMSO, 20 μM Reserpine ו-50 μM Reserpine. (פ-ח) ניתוח כמותי של זמן השינה הממוצע בשעות היום, הלילה והזמן הכולל בתוך 3 ימים עם או בלי תרופות. התוצאות מצביעות על כך שזמן השינה גדל אצל גברים שניזונו מרסרפין. n = 16 עבור כל קבוצה, ANOVA בכיוון אחד, *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השוואת משך השינה בין זבובים צעירים לזקנים. (A) תרשים סכמטי הממחיש את המעקב אחר משך השינה במשך 3 ימים אצל זכרים צעירים ומבוגרים. (ב-ד) ניתוח כמותי של זמן השינה הממוצע בשעות היום, הלילה וזמן השינה הכולל במשך 3 ימים אצל גברים צעירים ומבוגרים לא גילה הבדל משמעותי. n = 32 לכל קבוצה, מבחן t לא מזווג, n.s., לא משמעותי. (E) ניטור סכמטי של משך השינה במשך 3 ימים בנקבות צעירות וזקנות. (פ-ח) ניתוח כמותי של זמן השינה הממוצע בשעות היום, הלילה ובסך הכל במשך 3 ימים בנקבות צעירות וזקנות הראה ירידה משמעותית בשעות היום, הלילה וזמן השינה הכולל בנקבות זקנות בהשוואה לנקבות צעירות. n = 32 עבור כל קבוצה, מבחן t לא מזווג, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קבוצה קבוצת לימוד טיפול גיל ומין הזבובים מספר הזבובים
Equation 1 פקדים רגילים 4 מ"ל מדיום תרבית פשוטה עם 0.2% DMSO למשך 4 ימים 30 יום זכרים/נקבות 16 זבובים בקבוצה
Equation 2 בדיקת סמים במינון נמוךEquation 6 4 מ"ל מדיום תרבית פשוטה עם 20 מיקרומטר reserpine במשך 4 ימים 30 יום נקבות 16 זבובים בקבוצה
Equation 3 בדיקת סמים במינון גבוהEquation 6 4 מ"ל מדיום תרבית פשוטה עם reserpine 50 מיקרומטר במשך 4 ימים 30 יום נקבות 16 זבובים בקבוצה
Equation 4 בדיקת סמים במינון נמוךEquation 7 4 מ"ל מדיום תרבית פשוטה עם 20 מיקרומטר reserpine במשך 4 ימים 30 יום זכרים 16 זבובים בקבוצה
Equation 5 בדיקת סמים במינון גבוהEquation 7 4 מ"ל מדיום תרבית פשוטה עם reserpine 50 מיקרומטר במשך 4 ימים 30 יום זכרים 16 זבובים בקבוצה

טבלה 1: תכנון ניסויי לטיפול בזבוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת מתאימה לסינון מהיר של תרופות שינה קטנות ובינוניות. כיום, רוב שיטות סינון התרופות המקובלות בתפוקה גבוהה מבוססות על רמות ביוכימיות ותאיות. לדוגמה, המבנה והתכונות של הקולטן נבדקים כדי לחפש ליגנדות ספציפיות שיכולות להיקשר אליו22. גישה אחרת כוללת ניתוח מצב הקשירה והחוזק של מקטעים מולקולריים של תרופות נבחרות באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) עם ספקטרומטריית מסות35. עם זאת, לשיטות אלה יש לעתים קרובות שיעור שגיאות סינון גבוה יחסית, והתרופות שנבחרו באמצעותן לעתים קרובות אינן מראות השפעה בניסויים בבעלי חיים או בניסויים קליניים. יעילות התרופות בגוף מושפעת מגורמים שונים, כגון ספיגת תרופות, פיזורן, חילוף חומרים והפרשה, מה שמוביל לשיעור גבוה של בדיקות שווא. לעומת זאת, למרות שלשיטה המוצעת שלנו יש סולם סינון קטן יותר בהשוואה לשיטות בעלות תפוקה גבוהה, היא מציעה גישה פשוטה וחסכונית יותר על ידי התבוננות ישירה בהשפעות התרופות על פנוטיפים. זה מדגים את הפוטנציאל של שימוש במודל דרוזופילה לסינון יעיל של תרופות וזיהוי מטרות סמים.

דרוזופילה בעלת מנגנון ויסות שינה שמור ומציגה הפרעות שינה הקשורות להזדקנות. ראינו שמשך השינה של נקבות זבובים בני 30 יום היה קצר משמעותית מזה של זבובים בני 7 ימים, בעוד שמשך השינה של זבובים זכרים בני 30 יום לא היה שונה באופן משמעותי מזה של זבובים בני 7 ימים (איור 6). כתוצאה מכך, נבחרו נקבות זבובים בנות 30 יום לניסויים הנוכחיים. תהליך הסינון במספר סבבים נערך כדי למזער הפרעות גורם מקרי. ריכוז התרופה בסבב הראשון נקבע על 20 מיקרומטר כדי למנוע תופעות לוואי רעילות שעלולות להוביל לתמותת זבובים. בסבב הסינון השני הועלה ריכוז התרופה ל-50 מיקרומטר כדי להעריך את השפעות התרופה בריכוזים שונים. תרופות שנבחרו בסבב השני ניתנו לזבובים זכרים הן במינון של 20 מיקרומטר והן במינון של 50 מיקרומטר כדי להעריך את ההבדלים בין המינים בהשפעות התרופות. זה איפשר לסנן תרופות שהדגימו באופן עקבי השפעות הקשורות לשינה. לדוגמה, הוכח בעבר כי Reserpine מגביר את השינה אצל זבובים בוגרים בגילאי 4-6 ימים31. שכפלנו בהצלחה את התוצאה הזו במודל שלנו באמצעות זבובים מבוגרים יותר, כאשר נקבות מבוגרות יותר הראו עלייה משמעותית בשינה לאחר מתן רסרפיין (איור 5).

DMSO שימש להמסת התרופות, אך יש לקחת בחשבון את רעילותו הפוטנציאלית. מחקרים קודמים הראו כי ריכוזים של 0.1% עד 0.25% DMSO במדיום התרבית אינם פוגעים בתאי שיער של חולדות תוך 24 שעות, בעוד שריכוזים של 0.5% עד 6% מגדילים באופן משמעותי את תמותת התאים36. באופן דומה, נמצא כי ריכוזי DMSO של 0.1% או פחות אינם משפיעים על הביטוי של אנזימים או טרנספורטרים מרכזיים הקשורים למטבוליזם של תרופות בהפטוציטים אנושיים. עם זאת, ריכוזים גבוהים יותר יכולים לגרום לשינויים בביטוי37. עם זאת, יש לציין כי 0.1% DMSO נמצא להשפיע באופן משמעותי על תוחלת החיים של נקבות זבובים אך לא זכרים38. בנוסף, מתן תוך-צפקי של 15% ו-20% DMSO הוכח כמפריע לשינה בחולדות39. כדי למתן את הרעילות הפוטנציאלית של DMSO, שמרנו על ריכוזו מתחת ל-0.2%.

נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות המשמשות לאפיון ההתנהגות של Drosophila. שיטה אחת מבוססת על ניתוח וידאו, המספק שפע של פרמטרים התנהגותיים, כולל תנוחת זבוב, מהירות ותנועות עדינות של חלקי גוף. השיטה השנייה מבוססת על שבר קרן אינפרא אדום, כגון מערכת DAM. 40. עם זאת, חשוב לציין כי כלי ניתוח וידאו מסוימים כמו PySolo מיועדים לחקר מספר זבובים תושבים יחידים, ומגבילים את מספר הזבובים שניתן להציב תחת מצלמה41. כלים אחרים כמו C-trax42 ו- JAABA43 יכולים לבצע מעקב אחר אוכלוסייה אך הם יקרים מבחינה חישובית וגוזלים זמן. עבור סינון בתפוקה גבוהה, לכידת משך השינה הכולל של זבובים היא בדרך כלל מספיקה, ואין צורך בפרמטרים מדויקים של תנועה. לכן, השיטה הנפוצה והניתנת להרחבה ביותר המבוססת על שבר קרן אינפרא אדום עדיפה. עם זאת, שיטה זו יש גם מגבלות שלה. לדוגמה, אם זבובים נעים רק בקצה אחד של הצינור מבלי להפריע לקרן האינפרא אדום, המערכת עלולה לרשום זאת בטעות כשינה, מה שמוביל להערכת יתר של שינה44. בנוסף, חשוב לבדוק היטב את תנועתיות זן הזבוב לפני השימוש בו בהקרנה כדי למנוע השפעות לא מכוונות.

הנה כמה טיפים מועילים להתקנה מוצלחת: (1) כדי למנוע ממזון להידבק לצינור הזכוכית בעת הוצאתו מהכוס הקטנה לאחר התמצקות, ניתן לנסות להכניס את צינור הזכוכית אנכית לתחתית הכד הקטן לפני שהמזון מתמצק. משיכת צינור הזכוכית בעדינות קדימה ואחורה, הקשה על תחתית הכד כדי לאפשר כניסת אוויר, סיבוב איטי של הכד כדי להסיר את כל המזון וצינור הזכוכית, ולאחר מכן ניגוב זהיר של כל המזון שנותר על הקיר החיצוני של צינור הזכוכית יכול להיות יעיל. (2) בעת איטום קצה המזון של צינור הזכוכית בסרט פרפין, מומלץ להשתמש באמבט מים כדי לחמם את הסרט באיטיות עד שהפרפין נמס. גישה זו מסייעת למנוע את הבעיה של מזון מרפא להתיז באלימות בטמפרטורות גבוהות ולזהם את סרט הפרפין. לחילופין, ניתן להשתמש בפקקי פלסטיק קטנים לאיטום, אך יש לוודא שהאוויר עלול להיכנס במהלך האיטום ולגרום למזון להידחף כלפי מעלה. (3) כדאי לקחת בחשבון שכמה תרופות חזקות המקדמות שינה עלולות להוביל בתחילה לשיפוט שגוי של זבובים שנבדקו כמתים. כדי להתגבר על בעיה זו, מומלץ לקבוע שיפוע ריכוז, המאפשר לחקור את ריכוז התרופה האופטימלי ולחזור על הניסוי. (4) יש לקחת בחשבון כי ריח התרופה עשוי להשפיע על כמות המזון הנצרכת על ידי הזבובים ועל צריכתם בתרופה, דבר שעלול להשפיע על דיוק תוצאות הניסוי. לכן, זה יכול להיות מועיל להאריך את משך הניסוי כראוי, להבטיח כי זבובים יש מספיק זמן לצרוך סמים רבים ככל האפשר ולשפר את אפקט הצטברות של התרופה. (5) לצורך עיבוד נתונים, בעוד שלאוניברסיטאות ומכונים רבים יש גישה למטלב לשימוש הציבור, קיימות חלופות בעלות נמוכה יותר עבור יחידים או מוסדות מחקר שטרם רכשו את התוכנית. אפשרות מומלצת אחת היא ShinyR-DAM v3.1 «רענון»45.

לסיכום, פיתחנו הליך שלב אחר שלב לבדיקת תרופות לטיפול בהפרעות שינה. באמצעות מודל זבוב ישן יותר המציג פנוטיפ של משך שינה קצר יותר, מאומתת יעילותו של רסרפיין בהגדלת משך השינה אצל נקבות זבובים מבוגרות. שיטה זו מציעה גישה חדשה לסינון תרופות עם פוטנציאל יישום משמעותי ומשמשת בסיס למחקר תרופתי נוסף. בעוד שהשפעות התרופות מוערכות על סמך פנוטיפים, המנגנון הבסיסי של פעילות התרופה נותר לא ידוע. מחקרים נוספים ייערכו כדי לחקור את הפתולוגיה של הפרעות שינה ואת הרגולציה המולקולרית של השינה, ובכך לשפוך אור על המנגנונים הפרמקולוגיים המעורבים. למרות שהמנגנון הצירקדי בדרוזופילה דומה למתנדים אנושיים, אין להתעלם מההבדלים במנגנוני בקרת השינה בין בני אדם לזבובים. פרוטוקול זה מספק מסגרת בסיסית לבדיקת תרופות להפרעות שינה. עם זאת, מחקר עתידי יקבע אם ניתן להשתמש באחת התרופות המוקרנות לטיפול קליני, כמו גם להבהיר את מנגנוני הפעולה שלהן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדתו של פרופ' ג'ונהאי האן על הדיון וההערות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 32170970 ל- Y.T ו"פרויקט כחול ציאנין" של מחוז ג'יאנגסו ל- Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

תפוקה גבוהה בדיקת תרופות במולקולות קטנות הפרעות שינה הקשורות לגיל דרוזופילה מלנוגסטר משך השינה דפוסים מקוטעים קשישים מחלות סוכרת מחלות לב וכלי דם הפרעות פסיכולוגיות תרופות קיימות תופעות לוואי ליקוי קוגניטיבי התמכרות תרופות בטוחות יותר תרופות יעילות להפרעות שינה שיטת סינון חסכונית מנגנון ויסות שינה אורגניזם מודל מכשיר ניטור אינפרא אדום ניתוח שינה וצירקדיאן תוכנית MATLAB 2020 (SCAMP2020) פרוטוקול סינון בעלות נמוכה
בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter