Summary
Viene presentato un protocollo per lo screening farmacologico ad alto rendimento per migliorare il sonno monitorando il comportamento del sonno dei moscerini della frutta in un modello di Drosophila anziana.
Abstract
Il sonno, una componente essenziale della salute e del benessere generale, presenta spesso sfide per le persone anziane che spesso soffrono di disturbi del sonno caratterizzati da una durata del sonno ridotta e schemi frammentati. Queste interruzioni del sonno sono anche correlate a un aumento del rischio di varie malattie negli anziani, tra cui diabete, malattie cardiovascolari e disturbi psicologici. Sfortunatamente, i farmaci esistenti per i disturbi del sonno sono associati a effetti collaterali significativi come il deterioramento cognitivo e la dipendenza. Di conseguenza, è urgentemente necessario lo sviluppo di nuovi, più sicuri e più efficaci farmaci per i disturbi del sonno. Tuttavia, l'alto costo e la lunga durata sperimentale degli attuali metodi di screening dei farmaci rimangono fattori limitanti.
Questo protocollo descrive un metodo di screening economico e ad alto rendimento che utilizza la Drosophila melanogaster, una specie con un meccanismo di regolazione del sonno altamente conservato rispetto ai mammiferi, rendendola un modello ideale per lo studio dei disturbi del sonno negli anziani. Somministrando vari piccoli composti ai moscerini anziani, possiamo valutare i loro effetti sui disturbi del sonno. I comportamenti del sonno di questi moscerini vengono registrati utilizzando un dispositivo di monitoraggio a infrarossi e analizzati con il pacchetto di dati open source Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Questo protocollo offre un approccio di screening a basso costo, riproducibile ed efficiente per la regolazione del sonno. I moscerini della frutta, grazie al loro breve ciclo di vita, ai bassi costi di allevamento e alla facilità di manipolazione, sono soggetti eccellenti per questo metodo. A titolo di esempio, la Reserpina, uno dei farmaci testati, ha dimostrato la capacità di favorire la durata del sonno nei moscerini anziani, evidenziando l'efficacia di questo protocollo.
Introduction
Il sonno, uno dei comportamenti essenziali necessari per la sopravvivenza umana, è caratterizzato da due stati principali: il sonno REM (Rapid Eye Movement) e il sonno NREM (Non-Rapid Eye Movement)1. Il sonno NREM comprende tre fasi: N1 (la transizione tra veglia e sonno), N2 (sonno leggero) e N3 (sonno profondo, sonno a onde lente), che rappresentano la progressione dalla veglia al sonno profondo1. Il sonno svolge un ruolo cruciale sia per la salute fisica che per quella mentale2. Tuttavia, l'invecchiamento riduce la durata totale del sonno, l'efficienza del sonno, la percentuale di sonno a onde lente e la percentuale di sonno REM negli adulti3. Gli individui più anziani tendono a trascorrere più tempo nel sonno leggero rispetto al sonno a onde lente, rendendoli più sensibili ai risvegli notturni. Con l'aumentare del numero di risvegli, il tempo medio di sonno diminuisce, con conseguente frammentazione del sonno negli anziani, che può essere associata a un'eccessiva eccitazione dei neuroni Hcrt nei topi4. Inoltre, il declino dei meccanismi circadiani legato all'età contribuisce a un cambiamento anticipato nella durata del sonno 5,6. In combinazione con la malattia fisica, lo stress psicologico, i fattori ambientali e l'uso di farmaci, questi fattori rendono gli anziani più suscettibili ai disturbi del sonno, come l'insonnia, il disturbo del comportamento del sonno REM, la narcolessia, i movimenti periodici delle gambe, la sindrome delle gambe senza riposo e la respirazione disturbata dal sonno 7,8.
Studi epidemiologici hanno dimostrato che i disturbi del sonno sono strettamente legati alle malattie croniche negli anziani9, tra cui la depressione 10, le malattie cardiovascolari11 e la demenza12. Affrontare i disturbi del sonno svolge un ruolo cruciale nel miglioramento e nel trattamento delle malattie croniche e nel miglioramento della qualità della vita degli anziani. Attualmente, i pazienti si affidano principalmente a farmaci come benzodiazepine, non benzodiazepine e agonisti del recettore della melatonina per migliorare la qualità del sonno13. Tuttavia, le benzodiazepine possono portare a una sottoregolazione dei recettori e alla dipendenza dopo un uso a lungo termine, causando gravi sintomi di astinenza al momento dell'interruzione14,15. Anche i farmaci non benzodiazepinici comportano rischi, tra cui demenza 16, fratture17 e cancro18. L'agonista del recettore della melatonina comunemente usato, il ramelteon, riduce la latenza del sonno ma non aumenta la durata del sonno e presenta problemi legati alla funzione epatica a causa dell'ampia eliminazione di primo passaggio19. L'agomelatina, un agonista del recettore della melatonina e antagonista del recettore della serotonina, migliora l'insonnia correlata alla depressione, ma comporta anche un rischio di danno epatico20. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di farmaci più sicuri per trattare o alleviare i disturbi del sonno. Tuttavia, le attuali strategie di screening dei farmaci, basate su esperimenti molecolari e cellulari combinati con sistemi automatizzati e analisi computerizzate, sono costose e richiedono molto tempo21. Le strategie di progettazione di farmaci basate sulla struttura, che si basano sulla struttura e sulle proprietà dei recettori, richiedono una chiara comprensione della struttura tridimensionale dei recettori e mancano di capacità predittive per gli effetti dei farmaci22.
Nel 2000, sulla base dei criteri del sonno proposti da Campbell e Tobler nel 1984 23, i ricercatori hanno stabilito semplici modelli animali per studiare il sonno 24, tra cui Drosophila melanogaster, che ha mostrato stati simili al sonno25,26. Nonostante le differenze anatomiche tra la Drosophila e gli esseri umani, molti componenti neurochimici e le vie di segnalazione che regolano il sonno nella Drosophila sono conservati nel sonno dei mammiferi, facilitando lo studio delle malattie neurologiche umane27,28. La Drosophila è anche ampiamente utilizzata negli studi sul ritmo circadiano, nonostante le differenze negli oscillatori principali tra mosche e mammiferi 29,30,31. Pertanto, la Drosophila funge da prezioso organismo modello per lo studio del comportamento del sonno e la conduzione di screening farmacologici correlati al sonno.
Questo studio propone un approccio semplice ed economico basato sul fenotipo per lo screening di farmaci a piccole molecole per il trattamento dei disturbi del sonno utilizzando mosche anziane. La regolazione del sonno in Drosophila è altamente conservatae il declino del sonno osservato con l'età può essere reversibile attraverso la somministrazione di farmaci. Pertanto, questo metodo di screening basato sul fenotipo del sonno può riflettere intuitivamente l'efficacia del farmaco. Nutriamo i moscerini con una miscela del farmaco in esame e del cibo, monitoriamo e registriamo il comportamento del sonno utilizzando il Drosophila Activity Monitor (DAM)32 e analizziamo i dati acquisiti utilizzando il pacchetto di dati SCAMP2020 open source in MATLAB (Figura 1). L'analisi statistica viene eseguita utilizzando software di statistica e grafici (vedi Tabella dei Materiali). A titolo di esempio, dimostriamo l'efficacia di questo protocollo presentando dati sperimentali sulla Reserpina, una piccola molecola inibitrice del trasportatore vescicolare delle monoamine che aumenta il sonno33. Questo protocollo fornisce un approccio prezioso per identificare i farmaci per il trattamento dei problemi del sonno legati all'età.
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Protocol
Questo protocollo utilizza le mosche w1118 di 30 giorni del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione dei moscerini della frutta invecchiati
- Preparazione del cibo
- Preparare il terreno di coltura standard per amido di mais mescolando 50 g/L di cornflakes, 110 g/L di zucchero, 5 g/L di agar e 25 g/L di lievito. Scaldare i cornflakes e il lievito con acqua per gelatinizzare, quindi sciogliere completamente tutte le sostanze.
- Quando il terreno si raffredda a 50-60 °C, aggiungere 6 mL/L di acido propionico e confezionarli prontamente in flaconi di coltura.
- Allevamento di mosche e preparazione di mosche invecchiate
- Allevare il ceppo w1118in bottiglie contenenti un terreno di coltura standard per amido di mais e mettere le bottiglie in un'incubatrice a temperatura costante a 25° C, 68% di umidità relativa, condizioni di illuminazione 500-1000 lux e un ciclo luce:buio di 12 h:12 h.
- Trasferire le mosche in una nuova bottiglia ogni 7 giorni in base al ciclo di crescita delle mosche, mantenendo costante l'età degli individui nella stessa bottiglia.
- Raccogli il nuovo lotto di mosche che si schiudono dalla bottiglia originale 3 giorni dopo averle trasferite e mettile in una nuova bottiglia. Seguendo il principio di cambiare la bottiglia ogni 7 giorni, saranno coltivati fino a circa 30 giorni di età.
2. Preparazione di alimenti medicinali e provette di vetro per il monitoraggio
NOTA: La procedura per la preparazione del tubo di vetro segue il lavoro di Jin et al. con modifiche34.
- Pulizia e asciugatura dei tubi di vetro
- Mettere il tubo di vetro (5 mm di diametro x 65 mm di lunghezza, vedi Tabella dei materiali) in un bicchiere grande, immergerlo e farlo bollire con acqua bidistillata per 20 minuti. Ripeti 3 volte.
- Rimuovere e avvolgere il tubo di vetro, sciacquare l'interno con acqua bidistillata 3-5 volte e metterlo in forno per l'asciugatura.
- Preparazione del terreno di coltura semplice (100 mL)
- Sciogliere 1,5 g di agar e 5 g di saccarosio in acqua bidistillata, scaldare e concentrare a 100 ml.
- Aggiungere 600 μL di acido propionico quando il mezzo si raffredda a circa 70 °C, impedendone la solidificazione utilizzando un bagnomaria a temperatura costante.
- Aggiungere circa 4 mL di terreno semplice e Reserpina (vedere Tabella dei materiali) in un becher piccolo da 10 mL fino a quando il farmaco raggiunge i 20 μM o 50 μM. Aggiungere dimetilsolfossido (DMSO) alla concentrazione dello 0,2% nel gruppo di controllo negativo.
- Preparazione delle provette di vetro contenenti il medicinale
- Per facilitare il flusso del fluido, inserire con cautela un tubo di vetro di lunghezza adeguata in un piccolo becher. Il fluido entrerà naturalmente nel tubo di vetro a causa della pressione atmosferica.
- Estrarre la provetta di vetro quando il terreno di coltura è completamente solidificato e pulire la parete esterna per ottenere una provetta di vetro di monitoraggio con un terreno di coltura contenente farmaci a un'estremità.
- Scaldare la paraffina solida in un becher fino a quando non si scioglie a 70 °C, mettere l'estremità del tubo di vetro vicino al cibo nel liquido di paraffina per circa 5 mm e rimuoverlo rapidamente. Attendere che la paraffina si solidifichi per sigillare l'estremità alimentare del tubo di vetro.
3. Disegno sperimentale e trattamento della mosca
- Progettare l'esperimento per il trattamento della mosca seguendo la Tabella 1.
4. Assemblaggio della Drosophila e monitoraggio del sonno
NOTA: La procedura per l'assemblaggio della Drosophila segue il lavoro di Jin et al.34 con modifiche.
- Anestetizzare le mosche con gas CO2 , metterle in provette di vetro sigillate in paraffina (una per provetta) e bloccare l'estremità non alimentare con un batuffolo di cotone assorbente per impedire la fuoriuscita delle mosche e garantire la circolazione dell'aria.
- Caricare i tubi sul monitor a infrarossi per monitorarli.
- Assemblare i tubi di vetro contenenti le mosche su un monitor a infrarossi nella stessa direzione e registrare il numero del monitor e il numero di foro corrispondenti a ciascun farmaco.
- Regola l'allineamento di ciascun tubo e fai in modo che i raggi infrarossi passino verticalmente attraverso il centro dell'intervallo di attività della mosca.
- Posizionare il monitor all'interno di un'incubatrice a 25 °C situata nella camera oscura del sonno delle mosche, seguendo le impostazioni specificate: temperatura di 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente all'ora locale delle 20:00) e ZT24 (equivalente all'ora locale delle 08:00). Questa configurazione assicura che le mosche sperimentino periodi alternati di 12 ore di luce e buio.
NOTA: Cercare di non aprire la porta fino al completamento della raccolta dei dati di monitoraggio per mantenere un ambiente stabile nell'incubatrice durante il monitoraggio. - Avviare il monitoraggio utilizzando il sistema DAM2 (vedi Tabella dei materiali).
- Una volta completato il monitoraggio, scaricare i dati raccolti in formato .txt dal sistema.
5. Trattamento dei dati
NOTA: L'elaborazione dei dati utilizzando il sistema DAM, DAMFileScan107 e SCAMP è stata eseguita secondo le istruzioni sui loro siti Web ufficiali (vedere la tabella dei materiali).
- Importare il file txt di cui sopra nel software DAMFileScan107 per la scansione e dividerlo secondo necessità per ottenere i dati del sonno.
- Impostare l'ora di inizio dei dati di segmentazione alle 8:01 (segmentazione di 1 minuto) o alle 8:00 (segmentazione di 30 minuti) della terza mattina dopo l'avvio dei monitoraggi e l'ora di terminazione è alle 8:00 di tre giorni dopo l'ora di inizio (Figura 2A1).
NOTA: Le mosche devono adattarsi all'ambiente di monitoraggio per almeno un giorno. Quindi, è possibile impostare l'ora di inizio dei dati divisi alle 8 del mattino del terzo giorno dopo l'inizio del monitor. - Suddividere i dati a intervalli di 1 minuto e 30 minuti. Modificare l'opzione "Lunghezza del contenitore" a 1 minuto, modificare l'opzione "Tipo di file di output" in File canale, rinominare ed emettere. Il metodo di segmentazione dei dati di 30 minuti è lo stesso di cui sopra (Figura 2A2-5).
NOTA: Quando si esegue la segmentazione dei dati a intervalli di 1 minuto e 30 minuti, la ridenominazione finale dei due file deve essere coerente; in caso contrario, potrebbe essere illeggibile durante la successiva elaborazione Matlab. Se necessario, il nome del file può essere modificato dopo l'output per facilitare la differenziazione.
- Impostare l'ora di inizio dei dati di segmentazione alle 8:01 (segmentazione di 1 minuto) o alle 8:00 (segmentazione di 30 minuti) della terza mattina dopo l'avvio dei monitoraggi e l'ora di terminazione è alle 8:00 di tre giorni dopo l'ora di inizio (Figura 2A1).
- Trattamento dei dati mediante SCAMP2020
- Aprire il pacchetto del programma SCAMP2020 in Matlab e fare doppio clic su Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).
- Aggiungi la sua sottocartella "Vecsey SCAMP Scripts" al percorso, trova il file "scamp.m" in quella cartella ed eseguilo. Nella seguente finestra pop-up, selezionare le cartelle del processo 1 min e 30 min in sequenza (Figura 2C,D).
- Selezionare un monitor, fare clic su Carica singoli grafici per visualizzare l'anteprima (Figura 3A1) e controllare l'immagine visualizzata. Deselezionare il canale corrispondente delle mosche morte (Figura 3A2, Figura 3B).
- Ripetere i passaggi precedenti per controllare tutti i monitor.
- Rinominare ciascun canale in ciascun monitor in base al farmaco corrispondente da testare (Figura 3A3), selezionare tutti i monitor e fare clic su ANALIZZA dati selezionati per l'analisi (Figura 3A4).
- Per impostazione predefinita, selezionare Analizza per il contenitore scelto, selezionare Esporta dati e infine fare clic su GRAFICO 30 min Tipi di dati per tutti i giorni per gruppi selezionati e ESPORTA tutti i dati per visualizzare i risultati (Figura 3C).
- Selezionare il file denominato s30 dal file CSV, trovare il valore medio corrispondente e i dati di errore standard per ciascun monitor, eseguirne il backup in Excel per la modifica e la regolazione e incollarlo in GraphPad Prism (vedere Tabella dei materiali) per disegnare un diagramma dello stato del sonno (Figura 4A,B).
- Trova il file denominato "stdur" e calcola i valori medi del sonno diurno, notturno e totale per ogni mosca nell'arco di tre giorni (Figura 4A,C). Incolla i dati nel software Prism per completare il test delle differenze e disegnare un grafico.
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Representative Results
La reserpina è un inibitore a piccola molecola del trasportatore vescicolare delle monoamine (VMAT), che inibisce la ricaptazione delle monoamine nelle vescicole presinaptiche, portando ad un aumento del sonno33. Gli effetti di promozione del sonno della reserpina sono stati esaminati in moscerini di 30 giorni, con il gruppo di controllo alimentato esclusivamente con il solvente dimetilsolfossido (DMSO). Nel gruppo Reserpina, i moscerini più anziani hanno mostrato un aumento significativo del sonno sia durante il giorno che durante la notte rispetto al gruppo DMSO. La Figura 5A,E illustra i modelli di sonno dei moscerini Reserpina e DMSO per tre giorni consecutivi, mentre la Figura 5B-D e la Figura 5F-H mostrano i risultati del test differenziale sui dati del sonno. Per eliminare la possibilità che il farmaco agisse esclusivamente su un sesso, gli esperimenti sono stati ripetuti utilizzando mosche maschi. Sono state somministrate diverse concentrazioni di reserpina, 20 μM e 50 μM, dimostrando una correlazione positiva tra la concentrazione di reserpina e la promozione del sonno.
Figura 1: Processo sperimentale di screening di farmaci a piccole molecole per i disturbi del sonno legati all'età. Le mosche anziane sono state messe in un piccolo tubo di vetro con cibo contenente i farmaci da testare. I modelli di sonno sono stati monitorati continuamente per tre giorni utilizzando il sistema DAM. I dati acquisiti sono stati importati in un computer per l'elaborazione, la visualizzazione e l'analisi, portando a conclusioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Scansione e divisione dei dati. (A) Selezione e scansione dei dati, seguita da segmentazione temporale sequenziale. (B) Posizione della cartella "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Aggiunta della sottocartella "Vecsey SCAMP Scripts" al percorso. (D) Ubicazione del file "scamp.m". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Selezione ed elaborazione dei dati sul sonno. (A) Anteprima delle condizioni di sonno delle mosche, deselezionando il canale per le mosche morte e raggruppando e analizzando i dati selezionati. (B) Anteprima del sonno della Drosophila, dove un rettangolo blu uniforme indica il sonno attivo, mentre un certo momento di un rettangolo blu uniforme suggerisce che la mosca è morta. Le mosche morte sono contrassegnate con rettangoli rossi. (C) Analisi e output dei dati selezionati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati dell'analisi dei dati sul sonno . (A) Selezione dei file s30 e stdur dal file CSV. (B) Il valore medio e l'errore standard della media (SEM) del sonno per ciascun gruppo in "s30.csv". (C) Valori di giorno (Bin1, Bin3, Bin5), notte (Bin2, Bin4, Bin6) e sonno totale per ogni mosca entro tre giorni in "stdur.csv". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Condizioni del sonno di moscerini anziani trattati con Reserpina. (A) Rappresentazione schematica del tempo di sonno entro 3 giorni in femmine anziane alimentate con DMSO allo 0,2%, 20 μM di Reserpina e 50 μM di Reserpina. (B-D) Analisi quantitativa del tempo medio di sonno diurno, notturno e totale entro 3 giorni con o senza farmaci. I risultati dimostrano un aumento significativo del tempo di sonno nelle femmine anziane alimentate con Reserpina. N = 8 per ogni gruppo, ANOVA unidirezionale, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Rappresentazione schematica del tempo di sonno entro 3 giorni in maschi anziani alimentati con DMSO allo 0,2%, 20 μM di reserpina e 50 μM di reserpina. (F-H) Analisi quantitativa del tempo medio di sonno diurno, notturno e totale entro 3 giorni con o senza farmaci. I risultati indicano che il tempo di sonno è aumentato nei maschi alimentati con Reserpina. n = 16 per ogni gruppo, ANOVA unidirezionale, *p < 0,05, **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Confronto della durata del sonno tra mosche giovani e vecchie. (A) Diagramma schematico che illustra il monitoraggio della durata del sonno per 3 giorni in maschi giovani e anziani. (B-D) L'analisi quantitativa del tempo medio di sonno diurno, notturno e totale nell'arco di 3 giorni nei maschi giovani e anziani non ha rivelato differenze significative. n = 32 per ciascun gruppo, t-test spaiato, n.s., non significativo. (E) Monitoraggio schematico della durata del sonno nell'arco di 3 giorni in donne giovani e anziane. (F-H) L'analisi quantitativa del tempo medio di sonno diurno, notturno e totale nell'arco di 3 giorni nelle donne giovani e anziane ha dimostrato una significativa diminuzione del tempo di sonno diurno, notturno e totale nelle femmine anziane rispetto alle giovani femmine. n = 32 per ciascun gruppo, test t spaiato, ****p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo | Gruppo di studio | Trattamento | Età e sesso delle mosche | Numero di mosche | |||||
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Controlli normali | Terreno di coltura semplice da 4 mL con DMSO allo 0,2% per 4 giorni | 30 giorni maschi/femmine | 16 mosche per gruppo | |||||
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Test antidroga a basso dosaggio |
4 mL di terreno di coltura semplice con 20 μM di reserpina per 4 giorni | 30 giorni femmine | 16 mosche per gruppo | |||||
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Test antidroga ad alte dosi |
4 mL di terreno di coltura semplice con 50 μM di reserpina per 4 giorni | 30 giorni femmine | 16 mosche per gruppo | |||||
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Test antidroga a basso dosaggio |
4 mL di terreno di coltura semplice con 20 μM di reserpina per 4 giorni | 30 giorni maschi | 16 mosche per gruppo | |||||
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Test antidroga ad alte dosi |
4 mL di terreno di coltura semplice con 50 μM di reserpina per 4 giorni | 30 giorni maschi | 16 mosche per gruppo | |||||
Tabella 1: Disegno sperimentale per il trattamento della mosca.
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Discussion
Il metodo descritto è adatto per lo screening rapido di farmaci per il sonno di piccole e medie dimensioni. Attualmente, la maggior parte dei principali metodi di screening dei farmaci ad alto rendimento si basa su livelli biochimici e cellulari. Ad esempio, vengono esaminate la struttura e le proprietà del recettore per cercare ligandi specifici che possano legarsi ad esso22. Un altro approccio prevede l'analisi della modalità di legame e della forza dei frammenti molecolari di farmaci selezionati utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR) con la spettrometria di massa35. Tuttavia, questi metodi hanno spesso un tasso di errore di screening relativamente elevato e i farmaci selezionati attraverso di essi spesso non mostrano alcun effetto negli esperimenti sugli animali o clinici. L'efficacia dei farmaci nell'organismo è influenzata da vari fattori, come l'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l'escrezione dei farmaci, portando a un alto tasso di falsi screening. Al contrario, sebbene il nostro metodo proposto abbia una scala di screening più piccola rispetto ai metodi ad alto rendimento, offre un approccio più semplice ed economico osservando direttamente gli effetti dei farmaci sui fenotipi. Ciò dimostra il potenziale dell'utilizzo del modello Drosophila per uno screening farmacologico efficace e l'identificazione di bersagli farmacologici.
La Drosophila possiede un meccanismo di regolazione del sonno conservato e mostra disturbi del sonno associati all'invecchiamento. Abbiamo osservato che la durata del sonno delle mosche femmine di 30 giorni era significativamente più breve di quella delle mosche di 7 giorni, mentre la durata del sonno delle mosche maschi di 30 giorni non differiva significativamente da quella delle mosche di 7 giorni (Figura 6). Di conseguenza, per gli attuali esperimenti sono state selezionate mosche femmine di 30 giorni. Il processo di screening in più cicli è stato condotto per ridurre al minimo l'interferenza accidentale del fattore. La concentrazione del farmaco nel primo ciclo è stata fissata a 20 μM per evitare effetti collaterali tossici che potrebbero portare alla mortalità dei moscerini. Nel secondo ciclo di screening, la concentrazione del farmaco è stata aumentata a 50 μM per valutare gli effetti del farmaco a diverse concentrazioni. I farmaci selezionati dal secondo ciclo sono stati somministrati a moscerini maschi sia a 20 μM che a 50 μM per valutare le differenze di sesso negli effetti del farmaco. Ciò ha permesso di eseguire lo screening di farmaci che hanno costantemente dimostrato effetti correlati al sonno. Ad esempio, è stato precedentemente dimostrato che la reserpina aumenta il sonno nei moscerini adulti di età compresa tra 4 e 6 giorni31. Abbiamo replicato con successo questo risultato nel nostro modello utilizzando mosche più anziane, in cui le femmine più anziane hanno mostrato un aumento significativo del sonno dopo la somministrazione di Reserpina (Figura 5).
Il DMSO è stato utilizzato per sciogliere i farmaci, ma la sua potenziale tossicità deve essere considerata. Studi precedenti hanno dimostrato che concentrazioni di DMSO dallo 0,1% allo 0,25% nel terreno di coltura non danneggiano le cellule ciliate di ratto entro 24 ore, mentre concentrazioni dallo 0,5% al 6% aumentano significativamente la morte cellulare36. Allo stesso modo, è stato riscontrato che concentrazioni di DMSO dello 0,1% o inferiori non influenzano l'espressione di enzimi o trasportatori chiave correlati al metabolismo dei farmaci negli epatociti umani. Tuttavia, concentrazioni più elevate possono indurre cambiamenti nell'espressione37. Tuttavia, va notato che è stato riscontrato che lo 0,1% di DMSO influisce in modo significativo sulla durata della vita delle mosche femmine ma non dei maschi38. Inoltre, è stato dimostrato che la somministrazione intraperitoneale di DMSO al 15% e al 20% interferisce con il sonno nei ratti39. Per mitigare la potenziale tossicità del DMSO, abbiamo mantenuto la sua concentrazione al di sotto dello 0,2%.
Attualmente, ci sono due metodi principali utilizzati per caratterizzare il comportamento della Drosophila. Un metodo si basa sull'analisi video, che fornisce una vasta gamma di parametri comportamentali, tra cui la posizione della mosca, la velocità e i movimenti sottili delle parti del corpo. L'altro metodo si basa sulla frattura del fascio infrarosso, come il sistema DAM. 40. Tuttavia, è importante notare che alcuni strumenti di analisi video come PySolo sono progettati per studiare più mosche residenti singolarmente, limitando il numero di mosche che possono essere posizionate sotto una telecamera41. Altri strumenti come C-trax42 e JAABA43 possono eseguire il monitoraggio della popolazione, ma sono costosi dal punto di vista computazionale e richiedono molto tempo. Per lo screening ad alto rendimento, l'acquisizione della durata complessiva del sonno dei moscerini è di solito sufficiente e non sono necessari parametri di movimento precisi. Pertanto, è preferibile il metodo ampiamente utilizzato e altamente scalabile basato sulla frattura del fascio infrarosso. Tuttavia, questo metodo ha anche i suoi limiti. Ad esempio, se le mosche si muovono solo a un'estremità del tubo senza interrompere il raggio infrarosso, il sistema potrebbe erroneamente registrarlo come sonno, portando a una sovrastima del sonno44. Inoltre, è importante testare attentamente la motilità del ceppo di mosca prima di utilizzarlo nello screening per evitare influenze indesiderate.
Ecco alcuni suggerimenti utili per una configurazione di successo: (1) Per evitare che il cibo si attacchi al tubo di vetro quando lo si rimuove dal piccolo bicchiere dopo la solidificazione, si può provare a inserire il tubo di vetro verticalmente sul fondo del piccolo bicchiere prima che il cibo si solidifichi. Tirare delicatamente il tubo di vetro avanti e indietro, picchiettare il fondo del bicchiere per consentire l'ingresso dell'aria, ruotare lentamente il bicchiere per rimuovere tutto il cibo e il tubo di vetro, quindi pulire con cura eventuali residui di cibo sulla parete esterna del tubo di vetro può essere efficace. (2) Quando si sigilla l'estremità alimentare del tubo di vetro con pellicola di paraffina, si consiglia di utilizzare un bagnomaria per riscaldare lentamente la pellicola fino a quando la paraffina non si scioglie. Questo approccio aiuta a evitare il problema dell'alimento medicinale che schizza violentemente ad alte temperature e contamina il film di paraffina. In alternativa, si possono usare piccoli tappi di plastica per la sigillatura, ma assicurarsi che l'aria possa entrare durante la sigillatura, causando la spinta complessiva del cibo verso l'alto. (3) Vale la pena considerare che alcuni potenti farmaci che favoriscono il sonno possono inizialmente portare a un giudizio errato dei moscerini testati come morti. Per ovviare a questo problema, si consiglia di impostare un gradiente di concentrazione, consentendo l'esplorazione della concentrazione ottimale del farmaco e la ripetizione dell'esperimento. (4) Tenere conto del fatto che l'odore del farmaco può influenzare la quantità di cibo consumato dalle mosche e la loro assunzione del farmaco, influenzando potenzialmente l'accuratezza dei risultati sperimentali. Pertanto, può essere utile prolungare la durata dell'esperimento in modo appropriato, assicurando che i moscerini abbiano tutto il tempo per consumare quanto più farmaco possibile e migliorando l'effetto di accumulo del farmaco. (5) Per l'elaborazione dei dati, mentre molte università e istituti hanno accesso a Matlab per uso pubblico, sono disponibili alternative a basso costo per gli individui o gli istituti di ricerca che non hanno ancora acquistato il programma. Un'opzione consigliata è ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.
In conclusione, abbiamo sviluppato una procedura passo-passo per lo screening dei farmaci per il trattamento dei disturbi del sonno. Utilizzando un modello di mosca più vecchio che mostra un fenotipo di durata del sonno più breve, viene convalidata l'efficacia della reserpina nell'aumentare la durata del sonno nelle mosche femmine più anziane. Questo metodo offre un nuovo approccio allo screening dei farmaci con un significativo potenziale di applicazione e funge da base per ulteriori ricerche sui farmaci. Mentre gli effetti dei farmaci sono valutati in base ai fenotipi, il meccanismo alla base dell'azione dei farmaci rimane sconosciuto. Ulteriori studi saranno condotti per indagare la patologia dei disturbi del sonno e la regolazione molecolare del sonno, facendo così luce sui meccanismi farmacologici coinvolti. Sebbene il meccanismo circadiano della Drosophila abbia somiglianze con gli oscillatori umani, le differenze nei meccanismi di controllo del sonno tra gli esseri umani e le mosche non dovrebbero essere trascurate. Questo protocollo fornisce un quadro di base per lo screening farmacologico per i disturbi del sonno. Tuttavia, la ricerca futura determinerà se uno qualsiasi dei farmaci sottoposti a screening può essere utilizzato per il trattamento clinico, oltre a chiarire i loro meccanismi d'azione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio del Prof. Junhai Han per la loro discussione e i loro commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China 32170970 a Y.T e dal "Cyanine Blue Project" della provincia di Jiangsu a Z.C.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
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