JoVE Journal > Behavior
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Behavior

Høy gjennomstrømning av småmolekylær legemiddelscreening for aldersrelaterte søvnforstyrrelser ved bruk av Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65787
, , , , ,
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease,Southeast University

Summary

Presentert er en protokoll for high-throughput drug screening for å forbedre søvn ved å overvåke søvnadferden til fruktfluer i en eldre Drosophila-modell .

Abstract

Søvn, en viktig del av helse og generell velvære, gir ofte utfordringer for eldre personer som ofte opplever søvnforstyrrelser preget av forkortet søvnvarighet og fragmenterte mønstre. Disse søvnforstyrrelsene korrelerer også med økt risiko for ulike sykdommer hos eldre, inkludert diabetes, kardiovaskulære sykdommer og psykiske lidelser. Dessverre er eksisterende medisiner for søvnforstyrrelser forbundet med betydelige bivirkninger som kognitiv svekkelse og avhengighet. Følgelig er det et presserende behov for utvikling av nye, sikrere og mer effektive medisiner for søvnforstyrrelser. Den høye kostnaden og lange eksperimentelle varigheten av dagens narkotikascreeningsmetoder forblir imidlertid begrensende faktorer.

Denne protokollen beskriver en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsscreeningsmetode som bruker Drosophila melanogaster, en art med en svært konservert søvnreguleringsmekanisme sammenlignet med pattedyr, noe som gjør den til en ideell modell for å studere søvnforstyrrelser hos eldre. Ved å administrere ulike små forbindelser til eldre fluer, kan vi vurdere deres effekter på søvnforstyrrelser. Søvnatferden til disse fluene registreres ved hjelp av en infrarød overvåkingsenhet og analyseres med åpen kildekode-datapakken Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Denne protokollen tilbyr en rimelig, reproduserbar og effektiv screeningtilnærming for søvnregulering. Bananfluer, på grunn av deres korte livssyklus, lave oppdrettskostnader og enkle håndtering, tjener som gode emner for denne metoden. Som en illustrasjon demonstrerte Reserpine, et av de testede legemidlene, evnen til å fremme søvnvarighet hos eldre fluer, og fremhevet effektiviteten av denne protokollen.

Introduction

Søvn, en av de essensielle atferdene som er nødvendige for menneskelig overlevelse, er preget av to hovedtilstander: rask øyebevegelse (REM) søvn og ikke-rask øyebevegelse (NREM) søvn1. NREM-søvn består av tre stadier: N1 (overgangen mellom våkenhet og søvn), N2 (lett søvn) og N3 (dyp søvn, langsom bølgesøvn), som representerer progresjonen fra våkenhet til dyp søvn1. Søvn spiller en avgjørende rolle for både fysisk og psykisk helse2. Aldring reduserer imidlertid total søvnvarighet, søvneffektivitet, søvnprosent med langsomme bølger og REM-søvnprosent hos voksne3. Eldre individer har en tendens til å bruke mer tid i lett søvn sammenlignet med langsom bølgesøvn, noe som gjør dem mer følsomme for nattlige oppvåkninger. Etter hvert som antall oppvåkninger øker, reduseres gjennomsnittlig søvntid, noe som resulterer i et fragmentert søvnmønster hos eldre, noe som kan være forbundet med overdreven eksitering av Hcrt-nevroner hos mus4. I tillegg bidrar aldersrelaterte reduksjoner i sirkadiske mekanismer til et tidligere skifte i søvnvarighet 5,6. I kombinasjon med fysisk sykdom, psykisk stress, miljøfaktorer og medisinbruk, gjør disse faktorene eldre voksne mer utsatt for søvnforstyrrelser, som søvnløshet, REM-søvnadferdsforstyrrelse, narkolepsi, periodiske benbevegelser, rastløse bensyndrom og søvnforstyrret pust 7,8.

Epidemiologiske studier har vist at søvnforstyrrelser er nært knyttet til kroniske sykdommer hos eldre9, inkludert depresjon10, kardiovaskulær sykdom 11 og demens12. Å adressere søvnforstyrrelser spiller en avgjørende rolle i å forbedre og behandle kroniske sykdommer og forbedre livskvaliteten for eldre voksne. For tiden er pasienter primært avhengige av medisiner som benzodiazepiner, ikke-benzodiazepiner og melatoninreseptoragonister for å forbedre søvnkvaliteten13. Benzodiazepiner kan imidlertid føre til nedregulering av reseptorer og avhengighet etter langvarig bruk, og forårsake alvorlige abstinenssymptomer ved seponering14,15. Ikke-benzodiazepinmedikamenter bærer også risiko, inkludert demens 16, brudd17 og kreft18. Den vanlige melatoninreseptoragonisten, ramelteon, reduserer søvnforsinkelsen, men øker ikke søvnvarigheten og har leverfunksjonsrelaterte bekymringer på grunn av omfattende førstepassasjeeliminering19. Agomelatin, en melatoninreseptoragonist og serotoninreseptorantagonist, forbedrer depresjonsrelatert søvnløshet, men utgjør også en risiko for leverskade20. Følgelig er det et presserende behov for sikrere medisiner for å behandle eller lindre søvnforstyrrelser. Imidlertid er nåværende narkotikascreeningsstrategier, basert på molekylære og cellulære eksperimenter kombinert med automatiserte systemer og dataanalyse, dyre og tidkrevende21. Strukturbaserte legemiddeldesignstrategier, avhengig av reseptorstruktur og egenskaper, krever en klar forståelse av reseptorens tredimensjonale struktur og mangler prediktive evner for legemiddeleffekter22.

I 2000, basert på søvnkriteriene foreslått av Campbell og Tobler i 1984 23, etablerte forskere enkle dyremodeller for å studere søvn 24, inkludert Drosophila melanogaster, som viste søvnlignende tilstander25,26. Til tross for anatomiske forskjeller mellom Drosophila og mennesker, er mange nevrokjemiske komponenter og signalveier som regulerer søvn i Drosophila bevart i pattedyrs søvn, noe som letter studiet av menneskelige nevrologiske sykdommer27,28. Drosophila er også mye brukt i sirkadiske rytmestudier, til tross for forskjeller i kjerneoscillatorer mellom fluer og pattedyr 29,30,31. Derfor tjener Drosophila som en verdifull modellorganisme for å studere søvnadferd og gjennomføre søvnrelatert legemiddelscreening.

Denne studien foreslår en kostnadseffektiv og enkel fenotypebasert tilnærming for screening av småmolekylære legemidler for å behandle søvnforstyrrelser ved bruk av eldre fluer. Søvnregulering i Drosophila er svært bevart25, og nedgangen i søvn observert med alderen kan være reversibel gjennom legemiddeladministrasjon. Dermed kan denne søvnfenotypebaserte screeningsmetoden intuitivt gjenspeile legemiddeleffekten. Vi mater fluene med en blanding av stoffet som undersøkes og mat, overvåker og registrerer søvnadferd ved hjelp av Drosophila Activity Monitor (DAM) 32, og analyserer de oppkjøpte dataene ved hjelp av åpen kildekode-SCAMP2020 datapakke i MATLAB (figur 1). Statistisk analyse utføres ved hjelp av statistikk og grafisk programvare (se Materialfortegnelse). Som et eksempel demonstrerer vi effektiviteten av denne protokollen ved å presentere eksperimentelle data på Reserpine, en liten molekylinhibitor av vesikulær monoamintransportør rapportert å øke søvn33. Denne protokollen gir en verdifull tilnærming til å identifisere legemidler for behandling av aldersrelaterte søvnproblemer.

Protocol

Denne protokollen bruker den 30 dager gamle w1118 fluer fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, se tabell over materialer). 1. Forberedelse av de gamle fruktfluene MatlagingForbered standard maisstivelseskulturmedium ved å blande 50 g / L cornflakes, 110 g / L sukker, 5 g / L agar og 25 g / L gjær. Varm cornflakes og gjær med vann for å gelatinisere, og oppløs deretter alle stoffene helt. <…

Representative Results

Reserpin er en småmolekylær hemmer av vesikulær monoamintransportør (VMAT), som hemmer gjenopptaket av monoaminer i presynaptiske vesikler, noe som fører til økt søvn33. De søvnfremmende effektene av reserpin ble undersøkt hos 30 dager gamle fluer, med kontrollgruppen som utelukkende ble matet med løsningsmidlet dimetylsulfoksid (DMSO). I Reserpine-gruppen viste eldre fluer betydelig økt søvn både dag og natt sammenlignet med DMSO-gruppen. Figur 5A,E illu…

Discussion

Den beskrevne metoden er egnet for rask screening av små og mellomstore søvnmedisiner. For tiden er de fleste vanlige screeningsmetoder med høy gjennomstrømning basert på biokjemiske og cellulære nivåer. For eksempel undersøkes strukturen og egenskapene til reseptoren for å søke etter spesifikke ligander som kan binde seg til den22. En annen tilnærming innebærer å analysere bindingsmodus og styrke av molekylære fragmenter av utvalgte stoffer ved bruk av kjernemagnetisk resonans (NMR)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker professor Junhai Hans laboratoriemedlemmer for deres diskusjon og kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China 32170970 til YT og “Cyanine Blue Project” av Jiangsu-provinsen til Z.C.Z.

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Keywords: High-throughput ScreeningDrug DiscoveryStructure-based DesignFragment-based DesignDrosophila MelanogasterSleep DisordersInfrared MonitoringSCAMP2020Cost-effectiveAge-related Sleep Disorders
check_url/65787?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image