JoVE Journal > Behavior
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Behavior

Высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных препаратов на возрастные нарушения сна с использованием Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65787
, , , , ,
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease,Southeast University

Summary

Представлен протокол высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов для улучшения сна путем мониторинга поведения плодовых мушек во сне на пожилой модели дрозофилы .

Abstract

Сон, важнейший компонент здоровья и общего благополучия, часто представляет проблемы для пожилых людей, которые часто сталкиваются с нарушениями сна, характеризующимися сокращением продолжительности сна и фрагментированными паттернами. Эти нарушения сна также коррелируют с повышенным риском различных заболеваний у пожилых людей, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания и психологические расстройства. К сожалению, существующие препараты для лечения расстройств сна связаны со значительными побочными эффектами, такими как когнитивные нарушения и зависимость. Следовательно, срочно необходима разработка новых, более безопасных и эффективных препаратов для лечения расстройств сна. Тем не менее, высокая стоимость и длительная продолжительность экспериментов существующих методов скрининга лекарственных средств остаются ограничивающими факторами.

Этот протокол описывает экономически эффективный и высокопроизводительный метод скрининга, в котором используется Drosophila melanogaster, вид с высококонсервативным механизмом регуляции сна по сравнению с млекопитающими, что делает его идеальной моделью для изучения нарушений сна у пожилых людей. Вводя различные мелкие соединения старым мухам, мы можем оценить их влияние на нарушения сна. Поведение этих мух во время сна записывается с помощью инфракрасного устройства мониторинга и анализируется с помощью пакета данных с открытым исходным кодом Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Этот протокол предлагает недорогой, воспроизводимый и эффективный подход к скринингу для регуляции сна. Плодовые мушки, благодаря своему короткому жизненному циклу, низкой стоимости содержания и простоте в обращении, служат отличными объектами для этого метода. В качестве иллюстрации можно привести Резерпин, один из протестированных препаратов, продемонстрировавший способность увеличивать продолжительность сна у пожилых мух, подчеркнув эффективность этого протокола.

Introduction

Сон, одно из основных форм поведения, необходимых для выживания человека, характеризуется двумя основными состояниями: сон с быстрыми движениями глаз (БДГ)и сон с небыстрыми движениями глаз (NREM). Фазы быстрого сна включают в себя три стадии: N1 (переход между бодрствованием и сном), N2 (легкий сон) и N3 (глубокий сон, медленный сон), представляющие собой прогрессию от бодрствования к глубокому сну1. Сон играет важнейшую роль как в физическом, так и в психическом здоровье2. Тем не менее, старение снижает общую продолжительность сна, эффективность сна, процент медленного сна и процент быстрого сна у взрослых3. Пожилые люди, как правило, проводят больше времени в легком сне по сравнению с медленным сном, что делает их более чувствительными к ночным пробуждениям. По мере увеличения числа пробуждений среднее время сна уменьшается, что приводит к фрагментированному режиму сна у пожилых людей, что может быть связано с чрезмерным возбуждением нейронов Hcrt у мышей4. Кроме того, возрастное снижение циркадных механизмов способствует более раннему сдвигу продолжительности сна 5,6. В сочетании с физическими заболеваниями, психологическим стрессом, факторами окружающей среды и приемом лекарств эти факторы делают пожилых людей более восприимчивыми к нарушениям сна, таким как бессонница, расстройство поведения во время быстрого сна, нарколепсия, периодические движения ног, синдром беспокойных ног и нарушение дыхания во сне 7,8.

Эпидемиологические исследования показали, что нарушения сна тесно связаны с хроническимизаболеваниями у пожилых людей9, включая депрессию 10, сердечно-сосудистые заболевания11 и деменцию12. Борьба с нарушениями сна играет решающую роль в улучшении и лечении хронических заболеваний и повышении качества жизни пожилых людей. В настоящее время пациенты в основном полагаются на такие препараты, как бензодиазепины, небензодиазепины и агонисты рецепторов мелатонина для улучшения качества сна13. Тем не менее, бензодиазепины могут приводить к подавлению регуляции рецепторов и зависимости после длительного использования, вызывая тяжелые симптомы отмены при прекращении приема14,15. Небензодиазепиновые препараты также несут риски, включая деменцию16, переломы17 и рак18. Широко используемый агонист рецепторов мелатонина, рамелтеон, уменьшает латентность сна, но не увеличивает продолжительность сна и вызывает проблемы, связанные с функцией печени, из-за обширной элиминации при первом прохождении19. Агомелатин, агонист рецепторов мелатонина и антагонист серотониновых рецепторов, улучшает бессонницу, связанную с депрессией, но также представляет риск повреждения печени20. Следовательно, существует острая потребность в более безопасных препаратах для лечения или облегчения нарушений сна. Однако современные стратегии скрининга лекарственных средств, основанные на молекулярных и клеточных экспериментах в сочетании с автоматизированными системами и компьютерным анализом, являются дорогостоящими и трудоемкими. Структурно-ориентированные стратегии разработки лекарственных средств, основанные на структуре и свойствах рецепторов, требуют четкого понимания трехмерной структуры рецептора и не имеют прогностических возможностей для эффектов лекарств22.

В 2000 году, основываясь на критериях сна, предложенных Кэмпбеллом и Тоблером в 1984 году, исследователи создали простые животные модели дляизучения сна, включая Drosophila melanogaster, которая демонстрировала состояния, похожие на сон25,26. Несмотря на анатомические различия между дрозофилой и человеком, многие нейрохимические компоненты и сигнальные пути, регулирующие сон у дрозофилы, сохраняются во сне млекопитающих, что облегчает изучение неврологических заболеваний человека 27,28. Дрозофила также широко используется в исследованиях циркадных ритмов, несмотря на различия в основных осцилляторах у мух и млекопитающих 29,30,31. Таким образом, дрозофила служит ценным модельным организмом для изучения поведения во сне и проведения скрининга лекарств, связанных со сном.

В этом исследовании предлагается экономически эффективный и простой фенотипический подход к скринингу низкомолекулярных препаратов для лечения нарушений сна с использованием старых мух. Регуляция сна у дрозофилы являетсявысококонсервативной, и снижение сна, наблюдаемое с возрастом, может быть обратимым при приеме лекарств. Таким образом, этот метод скрининга, основанный на фенотипе сна, может интуитивно отражать эффективность препарата. Мы кормим мух смесью исследуемого препарата и корма, отслеживаем и записываем поведение во сне с помощью монитора активности дрозофилы (DAM)32 и анализируем полученные данные с помощью пакета данных SCAMP2020 с открытым исходным кодом в MATLAB (рис. 1). Статистический анализ выполняется с помощью программ для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). В качестве примера мы демонстрируем эффективность этого протокола, представляя экспериментальные данные по резерпину, низкомолекулярному ингибитору везикулярного переносчика моноаминов, который, как сообщается, увеличивает сон33. Этот протокол обеспечивает ценный подход к определению препаратов для лечения возрастных проблем со сном.

Protocol

В этом протоколе используются 30-дневные мухи w1118 из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, см. Таблицу материалов). 1. Приготовление выдержанных плодовых мушек Приготовление пищиПриготовьте стандартную питательную среду для кукурузного кр?…

Representative Results

Резерпин является низкомолекулярным ингибитором везикулярного транспортера моноаминов (VMAT), который ингибирует обратный захват моноаминов в пресинаптические везикулы, что приводит к увеличению продолжительности сна33. Снотворное действие Резерпина было изучено на 30-дне…

Discussion

Описанный метод подходит для быстрого скрининга снотворных препаратов малого и среднего размера. В настоящее время большинство основных высокопроизводительных методов скрининга лекарственных средств основаны на биохимическом и клеточном уровнях. Например, исследуется структура и ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Джунхай Хана за их обсуждение и комментарии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 32170970 Y.T и «Cyanine Blue Project» провинции Цзянсу для Z.C.Z.

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Keywords: High-throughput ScreeningDrug DiscoveryStructure-based DesignFragment-based DesignDrosophila MelanogasterSleep DisordersInfrared MonitoringSCAMP2020Cost-effectiveAge-related Sleep Disorders
check_url/65787?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image