Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Utforska livshistorieval: Att använda temperatur och substrattyp som samverkande faktorer för blåsfluglarver och honpreferenser

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65835
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 2Department of Zoology, Institute of Biosciences, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Här beskrivs två protokoll för att bedöma födokälla och äggläggningspreferenser hos larver och honor av blåsflugor. Dessa består av fyra val med två samverkande faktorer: substrattyp och temperatur. Analyserna gör det möjligt att bestämma larvernas födokälla och honornas preferens för äggläggningsstället.

Abstract

Blåsflugor (Diptera: Calliphoridae) uppvisar ett brett spektrum av larvlivsstilar, vanligtvis klassificerade som obligat parasitism, fakultativ parasitism och fullständig sapro-nekrofagi. Flera parasitarter, både obligata och fakultativa, anses vara av sanitär och ekonomisk betydelse, eftersom deras larver kan orsaka myiasis (maskangrepp i levande vävnad). Det är dock värt att notera att den vuxna honan spelar en avgörande roll när hon väljer äggläggningsplats och därför till stor del bestämmer larvernas matvanor och utvecklingsförhållanden. I denna studie föreslås två protokoll för att testa larvernas födopreferenser och honornas preferens för äggläggningsställen med hänsyn till två samverkande faktorer: köttsubstrattyp och temperatur. Uppställningarna som presenteras här gjorde det möjligt att testa Lucilia cuprina-larver och dräktiga honor i en fyrvalsanalys med två temperaturer (33 ± 2 °C och 25 ± 2 °C) och två typer av köttsubstrat (färskt kött kompletterat med blod och 5 dagar gammalt ruttet kött). Larver eller dräktiga honor kan välja att gräva eller lägga sina ägg i något av följande: ruttet kött vid 25 °C (simulerat ett tillstånd av en askultativ art), färskt kött som tillförs blod vid 33 °C (simulerat ett parasitarttillstånd) och två kontroller, ruttet kött vid 33 °C eller färskt kött som tillförs blod vid 25 °C. Preferensen bedöms genom att räkna antalet larver eller ägg som läggs i varje alternativ för varje replikat. Genom att jämföra de observerade resultaten med en slumpmässig fördelning kunde man uppskatta den statistiska signifikansen av preferensen. Resultaten indikerade att L. cuprina-larver har en stark preferens för det ruttna substratet vid 25 °C. Omvänt var honornas preferens för äggläggningsstället mer varierad för kötttypen. Denna metod kan anpassas för att testa preferenserna hos andra insektsarter av liknande storlek. Andra frågor kan också undersökas med hjälp av alternativa villkor.

Introduction

Flugor, särskilt kalyptratmuscoider (inklusive blåsflugor, husflugor, botflugor och köttflugor bland andra), uppvisar ett brett spektrum av livsstilar, som omfattar parasitiska och nekro-saprofagiska beteenden1. Parasitiska arter orsakar vanligtvis myiasis, ett angrepp av levande vävnader av larver (larver)2. I familjen Calliphoridae är både obligata och fakultativa parasitiska arter stora skadegörare på boskap som är ansvariga för ekonomiska förluster och dålig djurvälfärd på grund av maskangrepp 2,3,4,5,6,7. Obligata parasiter, såsom skruvmaskar från Nya och Gamla världen (Cochliomyia hominivorax respektive Chrysomyia bezziana), är särskilt problematiska 4,7,8,9,10 tillsammans med fakultativa parasiter, såsom fårblåsflugor (Lucilia cuprina och Lucilia sericata)2,5,6, 7. veckor Icke-parasitiska arter, inklusive sapro-nekrofager, utvecklas i ruttnande och nekrotiskt organiskt material och är vanligt förekommande i ohälsosamma miljöer. Deras strikt icke-parasitiska livsstil kan framgångsrikt användas för maskterapi, som använder fluglarver för att rengöra sår på nekrotiska vävnader11,12,13. Blåsflugor används också inom kriminalteknik, eftersom de är bland de första organismerna som lokaliserar och koloniserar nyligen avlidna kroppar, med de utvecklande larverna som ett sätt att uppskatta tidpunkten för döden14.

Blåsflugans livsstil har varit föremål för olika forskningsstudier (t.ex. 15,16,17,18,19,20,21) på grund av deras betydelse i förhållande till mänskliga intressen. Att förstå de biologiska mekanismerna som styr en arts livsstil kan ge värdefulla insikter för att förbättra metoder som syftar till att bekämpa skadedjursarter. Dessutom erbjuder mångfalden och utvecklingen av flugans livsstil ett idealiskt sammanhang för att studera ursprunget och mekanismerna för komplexa egenskaper (t.ex. parasitism). Parasitism på grund av larver som livnär sig på levande vävnad har utvecklats oberoende av varandra flera gånger inom familjen Calliphoridae22,23. Den evolutionära historien om födovanorna hos blåsflugor är dock fortfarande till stor del okänd, med studier begränsade till att kartlägga vanorna längs fylogenier (t.ex. 16,19,22) utan hjälp av funktionella analyser. Till exempel är det osäkert om obligata parasiter utvecklades från generalister (dvs. fakultativa parasiter) eller direkt från obdukduka arter. De molekylära, fysiologiska och beteendemässiga processer som åtföljer de evolutionära förändringarna i livsstil är också till stor del okända.

I detta sammanhang erbjuder fakultativa parasiter, såsom blåsflugan Lucilia cuprina, som kan utvecklas som parasiter på en värd eller som obduktioner på kadaver, möjligheten att utforska de faktorer och mekanismer som styr livsstilsval. Lucilia cuprina är en kosmopolitisk art som är känd för att orsaka flugangrepp på får, särskilt i Australien där den anses vara ett skadedjur 3,16. Myiasis orsakad av L. cuprina kan också förekomma hos andra husdjur, husdjur och människor 3,24,25,26,27,28,29,30. Men dess larver kan också utvecklas i nekrotiska vävnader och ruttnande material och denna art har framgångsrikt använts inom rättsentomologi eftersom den är mycket snabb att lokalisera och kolonisera lik31,32,33,34. Även om den parasitiska kontra icke-parasitiska livsstilen hos blåsflugor definieras av larvstadiet, är det den vuxna honan som väljer äggläggningsstället. Följaktligen påverkar den vuxna honan i hög grad larvernas livsstil, eftersom de senare har begränsad rörlighet. Honans val innebär dock inte nödvändigtvis att larverna skulle föredra samma substrat när de ställs inför ett val35. En hypotes är att beteendeförändringar som ledde till att honor lade sina ägg på levande vävnad kan ha varit en del av en tidig övergång till en parasitisk livsstil. Föranpassningar eller fysiologiska förmågor hos de resulterande larverna skulle ha varit avgörande för deras framgångsrika utveckling på den levande vävnaden, vilket ledde till uppkomsten av den parasitiska livsstilen. Som sådan kanske de processer som påverkas och väljs inte nödvändigtvis överensstämmer mellan båda livsstadierna.

I detta sammanhang utvecklades två metoder för att testa beteendepreferens hos blåsflugor, i synnerhet för L. cuprina, med avseende på larvfödosubstrat (larvpreferensanalys) och äggläggningsställe (honpreferensanalys). Dessa metoder tar hänsyn till två samverkande faktorer: temperatur och köttets färskhet. Temperatur valdes som en avgörande faktor eftersom de flesta fall av myiasis förekommer hos homeoterma djur2. Därför valdes en temperatur på 33 °C som en proxy för den "parasitiska livsstilsfaktorn", medan en temperatur på 25 °C (rumstemperatur) representerar den "icke-parasitiska faktorn". En temperatur på 25 °C valdes eftersom den är representativ för den genomsnittliga årstemperaturen som uppmätts i Brasilien (National Institute of Meteorology, INMET). Dessutom övervägdes två typer av köttsubstrat, båda från nötkreatur: (i) färskt kött kompletterat med blod, som efterliknar substratet för den parasitiska livsstilen, som används för att föda upp den parasitiska blåsflugan Co. hominivorax under laboratorieförhållanden36, och (ii) 5 dagar gammalt ruttet kött, som efterliknar substratet för den obduktiva livsstilen. Det bovina substratet används ofta för att föda upp L. cuprina under laboratorieförhållanden 27,37,38,39 eftersom det erbjuder flera fördelar när det gäller tillgänglighet, kostnadseffektivitet och praktiska egenskaper samtidigt som det är ett ekologiskt motiverat substrat. Andra studier40,41 som jämför effekten av ruttna kontra färska substrat hos blåsflugor har använt 7 dagar gammalt ruttet substrat (under anaeroba förhållanden) och visat en negativ effekt av det ruttna substratet på utvecklingshastighet, överlevnad och tillväxt. Eftersom L. cuprina är känd för att kolonisera färska kadaver som vanligtvis utsätts för luft, bestämde vi oss för att använda 5 dagar gammalt ruttet kött (köttfärs) i icke-hermetiska krukor (aerob och anaerob nedbrytning) för att efterlikna ett obduktörssubstrat.

De experimentella designerna som presenteras här erbjuder fördelen att urskilja preferenser för individuella faktorer såväl som deras kombinerade effekter. Dessutom är de fenotyper som poängsätts, det vill säga valet av larvsubstrat och antalet ägg som läggs, direkt relevanta för de biologiska och ekologiska aspekterna av blåsflugearter. Lämpligheten av dessa protokoll belyses genom att visa deras effektivitet i L. cuprina. Dessutom tillhandahålls ett skript för statistisk analys, som kan användas för att jämföra de observerade resultaten som erhållits i L. cuprina med simulerade slumpmässiga data, vilket säkerställer robust statistisk analys och tolkningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Flugprover togs med hjälp av fällor och inte på angripna djur. En SISBIO-licens (67867-1) utfärdades för att samla in och hålla flugor av familjen Calliphoridae i fångenskap under laboratorieförhållanden. Insektsprover är undantagna från etisk utvärdering vid forskning i Brasilien. Kött och blod från nötkreatur erhölls kommersiellt, och inget etiskt godkännande krävdes.

1. Larvens födosök

  1. Tillagning av petriskålar som innehåller 2 % agar
    1. Tillaga fyra petriskålar med 2 % agar. Tillsätt 6 g bakteriologisk agar till 300 ml vatten och smält blandningen i mikrovågsugn. Fördela sedan volymen jämnt i fyra petriskålar i glas (150 x 20 mm), med cirka 70 ml i varje skål.
      OBS: Förbered petriskålar lika med det antal experimentella replikat som önskas. I denna studie användes 36 replikat.
    2. När agarn har stelnat, använd ett 50 ml koniskt rör (3 cm i diameter) för att slå fyra hål i agar, två på varje sida av petriskålen, enligt det angivna skärmönstret (figur 1).
      OBS: Denna inställning liknar tidigare beskrivna protokoll av Fouche et al. (2021)40 och Boulay et al. (2016)42.
  2. Beredning av underlag
    1. För att förbereda det färska köttet med blod, tillsätt 12 ml utspätt nötkreatursblod till 200 g färskt nötmalet kött. Blanda ordentligt. Se till att använda olika graderade cylindrar och skedar för varje typ av kött för att undvika korskontaminering mellan substrat.
      OBS: Det utspädda blodet består av 50 % rent blod blandat med ett antikoagulantia (3,8 % natriumcitrat) och 50 % filtrerat vatten.
    2. För att förbereda det ruttna substratet, tillsätt 12 ml filtrerat vatten till 200 g 5 dagar gammalt ruttet nötkött och blanda det väl.
      OBS: Ruttet kött erhölls genom inkubering av färskt malet kött i fem dagar vid 25 °C i icke-hermetiska plastkrukor (blandning av aerob och icke-aerob nedbrytning). Varje gryta innehöll 200 g färskt köttfärs. Den frystes sedan ner tills den användes.
    3. Fyll två hål i varje petriskål med den färska kött- och blodblandningen och de återstående två hålen med den ruttna kött- och vattenblandningen.
      OBS: För att undvika positionsförskjutningar, variera placeringen av de olika kötttyperna i petriskålarna. Till exempel bör vissa petriskålar ha samma typ av kött vända mot varandra, medan i andra rätter bör kötttypen korsas, som visas i figur 2.
  3. Experimentell uppställning
    1. Vid en rumstemperatur (RT) på 25 °C, placera värmedynan direkt under en ljuskälla för att jämnt belysa experimentområdet och undvika beteendeförskjutning mot eller mot ljuset. Placera pappkuddar runt värmedynan för att säkerställa att experimentuppställningen förblir jämn.
      OBS: Ljuskällan som användes var vitt lågvärmeavgivande ljus, till exempel ett neonrör. Värmedynan placerades på ett bord precis under taklamporna (Figur 3).
    2. Täck värmedynan och utjämningspappdynorna med svart kartong och slå på värmedynan.
      OBS: Det svarta kartongomslaget bör användas för att undvika visuella signaler som kan påverka beteendeanalysen.
    3. Placera sex petriskålar med agar och köttsubstrat över den svarta kartongen med två substrat, ett av varje typ, på värmedynan och de andra två utanför värmedynans yta (Figur 2). Låt substraten värmas upp i ca 10 min.
      OBS: Kondens kan bildas på locket på petriskålarna.
  4. Test av larver
    1. Kontrollera temperaturen på underlaget (kall sida: 25 ± 2 °C; varm sida: 33 ± 2 °C) med en infraröd termometer.
      OBS: Värmedynan förblir på under hela experimentets längd. Temperaturmätningar gjordes i början och i slutet av experimentet. Även om temperaturen varierade med ± 2 °C, var det fortfarande minst 8 °C temperaturskillnad mellan varma och kalla förhållanden.
    2. När du har uppnått önskad temperatur placerar du fem larver i mitten av varje petriskål med hjälp av en pincett (figur 2) och täcker petriskålarna med locken. Låt valexperimentet pågå i 10 min.
      OBS: Vissa larver kan krypa runt kanterna och på locket på petriskålarna. Om någon larv rymmer, använd en pincett för att placera den tillbaka i mitten av petriskålen.
    3. Efter 10 minuter tar du bort alla petriskålar från värmedynan och placerar dem på en annan yta för att undvika att fortsätta värma upp underlaget. Räkna sedan antalet larver i varje substrat, såväl som de som inte valde något substrat.
      OBS: Lucilia cuprina-larver stannar i sitt valda substrat, vilket observerats i detta experiment.

2. Preferens för honans äggläggningsplats

  1. Experimentell uppställning
    1. Använd en vanlig hylla som tidigare täckts med svart kartong och belysts jämnt med vita LED-ljuslister.
      OBS: De svarta kartongskydden bör användas för att undvika visuella signaler som kan påverka beteendeanalysen. De vita LED-remsorna fästs på längden i mitten av hyllan precis ovanför experimentet. Hyllorna som användes i installationen placerades 45 cm från varandra.
    2. Vid RT (25 °C), placera en värmedyna i mitten av hyllan. Använd kartongkuddar runt värmedynan som stöd för att säkerställa att experimentuppställningen är jämn.
    3. Täck värmedynan och utjämningskartongdynorna med en svart kartong för att behålla samma visuella mönster under alla underlag.
    4. Placera två korsformade glasbehållare på en hylla, var och en ska ha två armar över den svarta kartongen och värmedynan. Slå på de vita LED-ljusremsorna och värmedynorna innan experimentet börjar.
    5. Använd 70 % etanol för att rengöra korsen (inuti korset och locket) för att undvika luktkontaminering.
  2. Beredning av underlag
    1. Förbered fyra petriskålar (60 mm x 15 mm) per korsning med 5 g 5 dagar gammalt ruttet eller färskt kött (två av varje typ av substrat).
      OBS: Förbered petriskålar lika med antalet experimentella replikat önskade gånger fyra. I denna studie användes 30 replikat, totalt 120 tillagade petriskålar.
    2. Tillsätt 1 ml utspätt nötkreatursblod (50 % rent blod med antikoagulantia och 50 % filtrerat vatten) till det färska köttet och 1 ml filtrerat vatten till det ruttna köttet. Blanda köttet noggrant (färskt eller ruttet) med vätskan (blod eller vatten) med olika skedar för varje typ av kött.
      OBS: Beredningen av köttet för honanalysen är mycket lik larvanalysen, även om mängderna är annorlunda eftersom hontestet kommer att pågå längre än larvtestet. Kom ihåg att använda olika pipettspetsar och skedar för varje typ av kött för att undvika korskontaminering av lukt mellan substrat.
    3. Kontrollera om alkoholen har avdunstat helt från korsen. Placera sedan fyra petriskålar (en av varje typ av kött på värmedynan och de andra två utanför värmedynans yta) längst ut på varje korsarm (Figur 4). Stäng korsen med locken och låt substraten värmas upp i ca 10 min.
      OBS: Dessutom, för att undvika positionsförskjutningar, variera placeringen av de olika kötttyperna i korsningarna. Till exempel bör vissa korsningar ha samma typ av kött på intilliggande armar, medan i andra korsningar bör samma kötttyp vara mittemot varandra, som visas i figur 4.
  3. Kvinnliga test
    1. Samla in dräktiga honor i flugburen och isolera dem i enskilda rör.
      OBS: Dräktiga honor kännetecknas av att de har en förstorad och vitgul buk i motsats till icke-dräktiga honor (Figur 5). Dräktiga honor samlades in mellan 10 och 16 dagar efter uppkomst för experimenten.
    2. Kontrollera temperaturen på underlagen i korsen (kall sida: 25 ± 2 °C; varm sida: 33 ± 2 °C) med en infraröd termometer.
      OBS: Precis som i larvtestet förblir värmedynan på under hela experimentets längd. Temperaturmätningar gjordes i början och slutet av experimentet. Även om temperaturen varierade med ± 2 °C, var det fortfarande minst 8 °C temperaturskillnad mellan varma och kalla förhållanden.
    3. Placera röret upp och ner med en dräktig hona i öppningen i mitten av varje kors. När honan har gått in i korset tar du bort röret och stänger öppningen med det lilla locket. När du har stängt alla kryss placerar du en svart kartong på framsidan av hyllan för att omsluta experimentuppställningen. Låt experimentet pågå i 4 timmar.
    4. Ta sedan bort honan genom att försiktigt fånga den med ett rör och kontrollera om det fanns några ägg på substraten.
    5. Identifiera locket på varje petriskål med substrattyp från varje kors. Använd 70 % etanol för att rengöra korsen (inuti korset och locket) från lukt från testet.
      OBS: Om äggen inte kan räknas direkt efter experimentet kan petriskålarna med substrat förvaras vid -20 °C.
  4. Antal ägg
    OBS: Om substraten i petriskålarna var frysta, tina dem innan du räknar.
    1. Använd ett stereomikroskop för att räkna antalet ägg som läggs i varje substrat. Använd en borste och vatten för att separera äggen för att räkna dem.

3. Dataanalys och statistik

  1. Beräkning av preferensindex
    1. För varje replikat av larvtest (n = 36) och hontest (n = 30) beräknas preferensindexet för kött (betecknas somPI-kött) genom att bestämma förhållandet mellan larver eller ägg på färska substrat (färskt varmt och färskt kallt) och det totala antalet larver eller ägg på alla substrat (färskt varmt + färskt kallt + ruttet varmt + ruttet kallt).
      PI-kött = (# larver eller ägg på färska substrat) / # Totalt antal larver eller ägg
      OBS: Termerna "Varm" och "Kallt" indikerar temperaturförhållanden på 33 ± 2 °C respektive 25 ± 2 °C.
    2. På samma sätt beräknas preferensindexet för temperatur (PI-temp) för varje replikat av larv- och hontester som antalet larver eller ägg som finns på heta substrat (färska varma och ruttna varma) dividerat med det totala antalet larver eller ägg på alla substrat (färsk varm + färsk kall + rutten varm + rutten kall).
      PItemp = (# larver eller ägg på Heta substrat) / # Totalt antal larver eller ägg
      OBS: Värden nära 1 återspeglar en preferens för färska eller varma substrat och värden nära noll indikerar en preferens för ruttna eller kalla substrat. PI:erna kan beräknas manuellt eller med hjälp av den angivna koden (Supplemental Files S1 och Supplemental Files S2).
  2. Jämförelse av den observerade preferensen för simulerade slumpmässiga data
    1. Kör den angivna koden (Supplementary File S1 och Supplementary File S1) för att generera simulerade data och jämföra dem med observerade data.
      OBS: Denna kod genererar 1000 simulerade slumpmässiga datauppsättningar för larver och honor och beräknar preferensindex (PI) för varje replikat av det simulerade och observerade data för L. cuprina. Simuleringarna utgår från att både larver och honor inte uppvisar någon substratpreferens och gör slumpmässiga val. Simuleringarna innehåller viktiga beteendeaspekter hos djuren, som omfattar olika scenarier såsom: sannolikheten för att larverna inte väljer något substrat och att vuxna honor koncentrerar sin äggläggning på ett enda substrat eller fördelar sina ägg antingen jämnt eller inte mellan olika substrat. Generaliserade linjära modeller (GLM, familj: kvasibinomial; länk: logit) användes för att jämföra observerade data från beteendeanalyserna med simulerade slumpmässiga data. Den GLM som användes var väl lämpad för denna analys på grund av preferensindexets (PI) begränsade karaktär, som sträcker sig mellan 0 och 1. GLM är skickliga på att hantera icke-normalfördelade responsvariabler och möjliggör robusta statistiska jämförelser. Detta val underlättade meningsfulla insikter genom att göra det möjligt att effektivt jämföra observerade data från beteendeanalyser med komplexa mönster som genererats av simulerade slumpmässiga data. Mindre justeringar av koden kan behövas för andra strukturerade datamängder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera effektiviteten av de presenterade metoderna utfördes experimenten med hjälp av en laboratoriepopulation av Lucilia cuprina (familj: Calliphoridae), en fakultativ parasitisk blåsfluga2. Hela den rådata som erhållits för denna art finns i tilläggsfil S3 tillsammans med resultaten från testerna av larver och honor av substrat. För att bedöma om larverna och honorna visar en preferens för något substrat jämfördes de observerade uppgifterna med 1000 simulerade datauppsättningar, som var och en representerar ett slumpmässigt val (se kod i tilläggsfil S1). Andelen statistiskt signifikanta jämförelser (p < 0,05) användes som ett mått för att bedöma preferens. Från denna analys var det uppenbart att larverna uppvisade en markant preferens för det ruttna substratet vid 25 °C (figur 6A, tabell 1) eftersom alla 1000 jämförelser mellan de observerade uppgifterna och var och en av de simulerade datauppsättningarna för slumpmässiga val visade sig skilja sig signifikant åt för kött- och temperaturförhållandena. På samma sätt uppvisade kvinnor också en märkbar preferens för 25 °C: 69,7 % av jämförelserna mellan observerade data och det slumpmässiga valet visade sig skilja sig signifikant från varandra (figur 6B, tabell 1). Deras preferens för ruttet kött var dock mer nyanserad (Figur 6B, tabell 1) eftersom endast 27,1 % av de observerade jämförelserna jämfört med slumpmässiga val var signifikanta. En annan observation från denna studie var att larver av L. cuprina vanligtvis gjorde ett snabbt val och grävde ner sig i köttsubstratet inom de första 2 minuterna av experimentet. De bytte sällan till ett annat tillstånd under det 10 minuter långa experimentet.

Figure 1
Figur 1: Larvernas födosöksmönster för petriskålar med agar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Toppvydiagram över layouten för larvens födosökspreferensanalys. Valen placerades slumpmässigt och testerna utfördes vid RT (25 ± 2 °C). Den svarta rektangeln representerar värmedynan, som håller temperaturen på 33 ± 2 °C. Röda och blå cirklar representerar färskt kött som tillförs utspätt blod (50 %) respektive ruttet kött som tillförs vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Diagram som illustrerar hur larvexperimentet ska placeras under ljuskällan för att undvika förskjutningar mot eller emot ljus. Ljuskällan som användes var vitt lågvärmeemitterande ljus (neonrör). Värmedynan placerades på ett bord precis under taklampan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Toppvydiagram över layouten för preferensanalysen för honans äggläggningsställe. Valen placerades slumpmässigt och testerna utfördes vid RT (25 ± 2 °C). Den svarta rektangeln representerar värmedynan som håller temperaturen på 33 ± 2 °C. Röda cirklar representerar färskt kött med utspätt blod (50 %) och blå cirklar, ruttet kött med vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Fotografi av en gravid (höger) jämfört med en icke-gravid (vänster) hona. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Genomsnittligt preferensindex (PI) för kötttyp och temperatur för larver (A) och honor (B) visade på ett kartesiskt plan. De svarta cirklarna representerar medelvärdet för PI med hänsyn tagen till alla experimentella replikat (n = 36 för larver och n = 30 för honförsök) som erhållits för L. cuprina. Var och en av de grå cirklarna betecknar medelvärdet för PI för kött och temperatur för en simulerad datauppsättning med liknande egenskaper som den observerade datauppsättningen (t.ex. samma antal replikat) men som representerar ett slumpmässigt val. De färgade rutorna fungerar som ett visuellt hjälpmedel för att föreställa sig PI-områdena för vart och ett av de fyra alternativen, där blått indikerar ruttet kött vid 25 ± 2 °C, grönt som ruttet kött vid 33 ± 2 °C, gult som färskt kött vid 25 ± 2 °C och orange som färskt kött vid 33 ± 2 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Etapp Jämförelse Signifikanta jämförelser för PImeat Signifikanta jämförelser för PItemp
Larver Simulerad hypotes kontra nollhypotes (p < 0,05) 3.8% 2.1%
Observerad vs. simulerad (p < 0,05) 100.0% 100.0%
Hondjur Simulerad hypotes kontra nollhypotes (p < 0,05) 3.3% 4.6%
Observerad vs. simulerad (p < 0,05) 27.1% 69.7%

Tabell 1. Procentandel signifikantPI-kött ochPI-temp (p-värden < 0,05) av jämförelserna mellan (i) simulerade slumpmässiga data (ingen preferens) och den statistiska nollhypotesen, och (ii) observerade data och simulerade slumpmässiga data. Resultaten presenteras separat för larver och honor.

Tilläggsfil S1: Kod som används för dataanalys och statistik i R-märkning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil S2: Rapport om den statistiska analysen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil S3: Råräkningar av Lucilia cuprina för larv- och honpreferenser på vart och ett av de fyra substratvalen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att förstå utvecklingen av födovanor, särskilt i samband med parasitism hos blåsflugor, krävs undersökning av substratpreferenser under olika livsstadier för utfodring eller äggläggning. Därför föreslogs i denna studie robusta och enkla metoder för att undersöka substratpreferenser hos larver och honor av blåsflugor. Dessa metoder testades i Lucilia cuprina, en fakultativ parasitisk blåsfluga2. Intressant nog avslöjade experimenten en tydlig benägenhet för ruttet kött vid 25 °C bland L. cuprina-larver , vilket är i linje med förhållanden som vanligtvis används av obdukerade arter. Detta skilde sig från en studie av Fouche et al40, som visade en preferens för färskt leversubstrat i Lucilia sericata och Calliphora vicina och visade att det ruttna substratet påverkade överlevnad och tillväxt negativt. Det är dock svårt att jämföra resultaten från de båda studierna eftersom graden av köttförruttnelse (sju dagar mot fem i vårt fall) och nedbrytningsprocessen (rent anaerob kontra aerob och anaerob i vårt fall) var olika. De arter som användes var också olika. Dessutom visade observationer från experimenten som presenteras här att honorna föredrog att lägga sina ägg vid 25 °C, medan de endast uppvisade en liten preferens för ruttet kött. Dessa resultat visar att larvernas och honornas val inte är samma sak och att honorna uppvisar ett mer varierat val för sitt val av äggläggningsplats än larverna för grävning och födoval. Detta tyder på att parasitvanan hos L. cuprina leds av förändringar i honans äggläggningsval och inte av larvernas födopreferenser. Dessa fynd fungerar som en proof-of-concept-demonstration av metodernas effektivitet och användbarhet för att belysa flugornas livsstil i olika utvecklingsstadier.

Distinkta kött- och temperaturförhållanden användes för att efterlikna parasitiska och obduka livsstilsfaktorer. Detta tillvägagångssätt underlättade utvärderingen av larvernas födosök och honornas äggläggningspreferenser i en fyrvalsanalys, med hjälp av två samverkande faktorer. De protokoll som antagits representerar ett tillvägagångssätt som avviker från den traditionella tvåvalstekniken som vanligtvis använts i tidigare studier 43,44,45,46,47,48,49,50. För att minimera variationer till följd av miljöfaktorer som kan påverka beteendet, såsom ljus, visuella eller luktsignaler, implementerades rigorösa kontrollåtgärder. Enhetlig och konsekvent belysning ovanifrån bibehölls i analyserna för att undvika bias mot eller mot ljus, kompletterat med användningen av en svart bakgrund för att förhindra potentiella visuella signalers inverkan på larv- och honpreferenser. Dessutom undveks risken för korskontaminering mellan ruttna och färska köttsubstrat genom att använda plastmaterial av glas eller engångsmaterial, handskar och separata redskap. Tillämpningen av dessa åtgärder visade sig vara avgörande för att upprätta en kontrollerad och tillförlitlig experimentell ram, vilket säkerställde robustheten och tillförlitligheten hos de erhållna resultaten.

Larvförsöksdesignen liknade den tidigare beskrivna tvåvalsanalysen40,42, med anpassningar gjorda för att inkludera temperaturfaktorn. Larvprotokollet som beskrivs här visade sig vara snabbt, robust och okomplicerat, med tanke på att larverna uppvisade en stark tendens att förbli nedgrävda i sitt valda substrat, vilket eliminerade risken för tvetydiga poängproblem som uppstod vid byte av substrat i slutet av experimentet. Denna speciella egenskap gör det möjligt för experimentatorn att utföra sex eller fler replikat samtidigt utan risk för otydliga eller osäkra resultat. Även om förekomsten av flera larver inom samma replikat kan påverka individuella val, tillåter protokollet bedömning av allmänna substratpreferenser genom oberoende replikat. I scenarier där möjligt aggregerande beteende måste undvikas eller kontrolleras, kan individuella tester eller införlivande av kontrollexperiment för att ta hänsyn till potentiella influenser mellan larver genomföras för att motverka eventuella snedvridningar.

Å andra sidan erbjuder protokollet för preferens av honäggläggningsplatser den anmärkningsvärda fördelen att det bedömer det individuella valet självständigt, fritt från påverkan av andra honors preferenser, och på så sätt undviker aggregerat beteende. Det är faktiskt känt att valet av äggläggning av kalliphoridhonor kan påverkas av närvaron av artfränder46,47. Icke desto mindre är det viktigt att erkänna den inneboende begränsningen i den experimentella analysen. Äggen kanske inte läggs inom 4-timmarsförsöket på grund av olämpliga förhållanden eller, mer troligt, på grund av att honorna är omogna. Denna osäkerhet resulterar i en undergrupp av replikaten utan ägg lagda (78 % av försöken). Dessutom medför den stora variationen i antalet ägg som läggs i varje replikat (26 till 208, medelvärde ± standardavvikelse = 132,4 ± 46,2) betydande variabilitet, vilket gör det svårt att skilja mellan variationer som drivs av honans preferenser och de som påverkas av faktorer som begränsade äggreserver eller sen äggläggning under experimentet. Trots dessa begränsningar är de föreslagna protokollen lämpliga för att effektivt bedöma preferenser på äggläggningsplatser.

Sammantaget har de utvecklade protokollen en betydande potential för ett brett spektrum av tillämpningar för att studera blåsflugors beteende. För det första kan dessa tester användas för att undersöka effekterna av olika behandlingar, såsom olika djurhållnings- eller utvecklingsförhållanden, på larv- eller honpreferenser inom samma art. Detta skulle potentiellt kunna avslöja de underliggande mekanismerna som driver beteendepreferenser och deras genetiska grund, särskilt i kombination med sekvenseringstekniker. Dessutom kan dessa tester utvidgas till att undersöka substratpreferenser hos olika blåsflugearter, vilket ger värdefulla insikter om evolutionen av parasitism inom denna grupp. Genom att fördjupa sig i de olika preferenser som blåsflugor uppvisar kan man få en djupare förståelse för deras ekologiska anpassningar, vilket ger värdefull kunskap för framtida hantering och bekämpning av skadedjursarter.

Slutligen sträcker sig protokollens potential bortom studiet av enbart blåsflugor. Med mindre modifieringar kan dessa protokoll lätt tillämpas för att bedöma flugarter från andra familjer, såsom husflugor och köttflugor, eller till och med insekter av liknande storlek. Protokollens anpassningsförmåga gör det också möjligt att välja olika substrat för att matcha målen för specifika vetenskapliga undersökningar. Till exempel kan forskare modifiera graden av köttförruttnelse eller ersätta nötkött med alternativa animaliska källor (t.ex. fisk, fläsk) eller icke-animaliska substrat (t.ex. frukt) för att ta itu med olika ekologiska frågor. Dessa anpassningar ökar inte bara protokollens mångsidighet, utan möjliggör också utforskning av preferenser i ett brett spektrum av insektsarter och ekologiska sammanhang, vilket ökar förmågan att belysa grundläggande aspekter av insekters beteende och ekologiska anpassning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen deklarerad.

Acknowledgments

Vi tackar Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim och Lucas de Almeida Carvalho för att ha tillhandahållit L. cuprina-kolonin och för deras hjälp med att sätta upp experimentet. Vi vill också tacka Rafael Barros de Oliveira för att ha filmat och redigerat videon. Denna forskning stöddes av Developing Nation Research Grant från Animal Behavior Society till V.A.S.C. och av ett FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo-bidrag till T.T.T. (20/05636-4). S.T. och D.L.F. stöddes av en FAPESP (19/07285-7 postdoktoralt stipendium respektive 21/10022-8 doktorandstipendium). V.A.S.C. och A.V.R. stöddes av CNPq PhD-stipendier (141391/2019-7, 140056/2019-0, respektive). T.T.T. stöddes av CNPq (310906/2022-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich 05038-500G For microbiology
Black cardboards - - 70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat  - - 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat - - Around 7-8% of fat
Brush - - Made with plastic
Conical tube Falcon or Generic - 50 mL
Cross-shaped glass containers Handmade NA 48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer Vidrolabor NA 500 mL
70% Ethanol Synth A1084.01.BL 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder Nalgon or Generic - 500 mL and 50 mL
Heating pad Thermolux - 30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer HeTaiDa HTD8808 Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S,
Accuracy: ±0.2 °C,
Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass) Precision NA 150x20 mm dimensions
             (Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS Cralplast 18130 60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette - - 3 mL (total volume)
Sodium citrate Synth C11033.01.AG 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons - - More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula Generic - Flat end and spoon end
Stereomicroscope Bioptika - WF10X/22 lenses
Tweezer - - Metal made and fine point
White led light strips NA NA 4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
  2. Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
  3. Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
  4. Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
  5. Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
  6. Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
  7. Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
  8. Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
  9. World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
  10. Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
  11. Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
  12. Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
  13. Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
  14. Greenberg, B. Flies as forensic indicators. Journal of Medical Entomology. 28 (5), 565-577 (1991).
  15. Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
  16. Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
  17. McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
  18. Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
  19. Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
  20. Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
  21. Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
  22. Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
  23. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  24. Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
  25. Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
  26. Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
  27. Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
  28. Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
  29. Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
  30. Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
  31. Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
  32. Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
  33. CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
  34. Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
  35. Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
  36. Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
  37. Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
  38. Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
  39. Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
  40. Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
  41. Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
  42. Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
  43. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  44. Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
  45. Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
  46. Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
  47. Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
  48. Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
  49. Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
  50. Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 201
Utforska livshistorieval: Att använda temperatur och substrattyp som samverkande faktorer för blåsfluglarver och honpreferenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cunha, V. A. S., Tandonnet, S.,… More

Cunha, V. A. S., Tandonnet, S., Ferreira, D. L., Rodrigues, A. V., Torres, T. T. Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences. J. Vis. Exp. (201), e65835, doi:10.3791/65835 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter