Summary
وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .
Abstract
يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.
Introduction
تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)1. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RPE ، والخلايا السلفية للشبكية (RPCs) 4،5،6،7،8 لاستعادة الخلايا المستقبلة للضوء التالفة. يعد الفضاء تحت الشبكية ، وهو مساحة محصورة بين الشبكية و RPE ، موقعا جذابا لإيداع هذه الخلايا لتحل محل الخلايا المستقبلة للضوء التالفة ، RPE ، وخلايا مولر نظرا لجوارها9،10،11.
تستخدم العلاجات الجينية والخلوية المساحة تحت الشبكية للطب التجديدي لمختلف أمراض الشبكية في الدراسات قبل السريرية. ويشمل ذلك تسليم نسخ وظيفية من أدوات تحرير الجينات أو الجينات في شكل إما علاج قليل النوكليوتيد المضاد للإحساس12،13 أو CRISPR / Cas9 أو تحرير القاعدة عبر الإستراتيجية القائمة على الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV)14،15،16 ، وزرع المواد (على سبيل المثال ، ورقة RPE ، الأطراف الاصطناعية للشبكية17،18،19) وعضويات الشبكية المتمايزة المشتقة من الخلايا الجذعية20، 21,22 لعلاج أمراض الشبكية والأمراض المرتبطة ب RPE. التجارب السريرية باستخدام hESC-RPE31 في الفضاء تحت الشبكية لعلاج داء ليبر الخلقي المرتبط ب RPE65 (LCA)23,24, أكروماتوبسيا25 المرتبط ب CNGA3, التهاب الشبكية الصباغي26 المرتبط ب MERTK, المشيمية 27,28,29,30 ثبت أنه نهج فعال. الحقن المباشر للخلايا بالقرب من المنطقة المتضررة يحسن بشكل كبير من فرصة استقرار الخلايا في المنطقة المناسبة ، والتكامل المشبكي ، والتحسن البصري في نهاية المطاف.
على الرغم من أن الحقن تحت الشبكية في النماذج البشرية والعيون الكبيرة (أي الخنزير32،33،34،35 ، الأرنب36،37،38،39،40 ، والرئيسيات غير البشرية41،42،43) قد تم تأسيسه ، إلا أن هذا الحقن في نموذج الفئران لا يزال يمثل تحديا بسبب قيود حجم مقلة العين وهائلة. عدسة تحتل عين الفأر44،45،46. ومع ذلك ، فإن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة فقط في الصغيرة وليس في الكبيرة (أي الأرانب والرئيسيات غير البشرية) ، وبالتالي فإن الحقن تحت الشبكية في الفئران يلفت الانتباه إلى التحقيق في الأساليب العلاجية الجديدة في الاضطرابات الوراثية للشبكية. يتم استخدام ثلاثة طرق رئيسية لتوصيل الخلايا أو AAVs إلى الفضاء تحت الشبكية ، وهي الطريق عبر القرنية ، والطريق عبر الصلبة ، وطريق pars plana (انظر الشكل 2). ترتبط الطرق عبر القرنية وعبر الصلبة بتكوين إعتام عدسة العين ، وتزامن ، ونزيف المشيمية ، والارتجاع من موقع الحقن11،44،45،47،48،49. اعتمدنا نهج pars plana كتصور مباشر لعملية الحقن ، ويمكن تحقيق موقع الحقن في الوقت الفعلي تحت المجهر.
لقد وصفنا مؤخرا طريقة يمكنها التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف مستقبلات ضوئية في ظل ظروف xenofree ومحددة كيميائيا باستخدام شكل LN523 من الصفيحة البشرية المؤتلف الخاص بشبكية العين. منذ العثور على LN523 ليكون موجودا في شبكية العين ، افترضنا أن مكانة المصفوفة خارج الخلية لشبكية العين البشرية يمكن تلخيصها في المختبر وبالتالي دعم تمايز المستقبلات الضوئية من hESCs36. أظهر تحليل النسخ أحادي الخلية أن أسلاف المستقبلات الضوئية التي تشارك في التعبير عن القضيب المخروطي و recoverin تم إنشاؤها بعد 32 يوما. تم استخدام نموذج فأر متحور تنكس الشبكية 10 (rd10) يحاكي التهاب الشبكية الصباغي البشري الصبغي الجسدي لتقييم فعالية اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في الجسم الحي. تم حقن الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC في الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 في P20 ، حيث يستمر خلل وتنكس المستقبلات الضوئية36. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد وتسليمها إلى الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 . يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإدارة AAVs أو معلقات الخلايا أو الببتيدات أو المواد الكيميائية في الفضاء تحت الشبكية في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء التجارب في الجسم الحي وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في SingHealth (IACUC) وبيان جمعية الأبحاث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تثبيط مناعة الجراء من P17 (قبل الزرع) إلى P30 (بعد الزرع) عن طريق إطعامهم مياه الشرب التي تحتوي على السيكلوسبورين (260 جم / لتر).
1. تحضير أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في اليوم 32 بعد الحفظ بالتبريد
- وسط تمايز المستقبلات الضوئية قبل التسخين (PRDM) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
- استرجع كريوفيال يحتوي على اليوم 32 خلية سلف مستقبلات ضوئية مشتقة من hESC من النيتروجين السائل. الحفاظ على الثلج الجاف.
- قم بإذابة الجليد على حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-5 دقائق. إعادة تعليق اليوم 32 خلية في 1 مل من PRDM وأجهزة الطرد المركزي في 130 × غرام لمدة 4 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PRDM.
- إزالة 10 ميكرولتر من الخليط لعد الخلايا. امزج الخلايا باستخدام 0.2٪ تريبان بلو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. خليط خلية ماصة في شريحة غرفة عد الخلايا. تحديد رقم الخلية وصلاحيتها بواسطة عداد الخلايا الآلي.
- انتقل إلى الخطوة التالية عندما تكون صلاحية الخلية أعلى من 70٪. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية في 130 × ز لمدة 4 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في PRDM بتركيز 3 × 105 خلايا / ميكرولتر للزرع.
- راقب كتل الخلايا المرئية. أعد تعليق كتل الخلايا بشكل متكرر باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر في أنبوب الميكروفوج حتى لا يلاحظ أي تكتل خلوي مرئي. قم بالتحميل في حقنة الحقن 33G لمراقبة قذف محلول الخلية من خلال الإبرة.
2. توصيل تحت الشبكية ل hESCs في الفئران rd10
- تحضير
- تخدير الفأر (P20، ذكر/أنثى، 3-6 جم) باستخدام مزيج من الكيتامين (20 ملغ/كغ من وزن الجسم) والزيلازين (2 ملغ/كغ من وزن الجسم) في حقنة سل سعة 1 مل متصلة بإبرة 27 غرام بالنهج داخل الصفاق. تطبيق حقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) للفأر كمسكن وقائي.
- بعد إعطاء التخدير ، غرس قطرة من كل من 1 ٪ تروبيكاميد و 2.5 ٪ فينيليفرين لتوسيع حدقة العين. ضع جل العيون على القرنية لمنع العين من الجفاف وإعتام عدسة العين المرتبط بالتخدير.
- ضع الماوس في قفص فارغ حتى يتم تخديره بالكامل. تقييم مستوى التخدير المناسب عن طريق الضغط على وسادة مخلب وتأكيد ما إذا كان لا يتفاعل مع قرصة الصلبة.
- عندما يتم تخدير الفأر بالكامل ، ضع على وسادة دافئة عند 38 درجة مئوية.
- توصيل الخلايا تحت الشبكية
- لاستخدام نهج pars plana عبر 1 منفذ عبر الجسم الزجاجي ، كما هو الحال هنا ، قم بإجراء حقن تحت الشبكية في بيئة معقمة. استخدم مجهر تشغيل مستقيم مع مسار ضوئي مباشر لإجراء الحقن.
- قم بإعداد المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر عن طريق إزالة محور الإبرة. قم بتركيب الإبرة الحادة 33G على المحقنة الزجاجية. خذ غطاء المحور المعدني وقم بتأمين الإبرة بعناية على المحقنة.
- اغسله بالماء المقطر للتحقق من وجود أي علامات تسرب وسالكية الإبرة. أفرغ المحقنة وضعها على الجانب بعناية.
- ضع الفأر المخدر على وسادة ، مع نظر عين العلاج مباشرة إلى هدف المجهر. تطبيق 0.5 ٪ بروباراكايين هيدروكلوريد وانتظر لمدة 30 ثانية. ضع 150 ميكرولتر من جل العيون على العين وضع غطاء دائري عليه.
- قم بإجراء فحص تقريبي للعين من خلال مراقبة القرنية والقزحية والبؤبؤ والعدسة والملتحمة. من خلال التلميذ ، تصور قاع عين الماوس عن طريق ضبط المستوى البؤري. اضبط الرأس حتى يتم وضع الرأس البصري في وسط التلميذ وتقليل حركة الرأس عن طريق وضعه بشكل صحيح على الوسادة.
- اضغط برفق على قاعدة الأنبوب باستخدام hESCs عدة مرات للحصول على تعليق خلية موحد. باستخدام حقنة زجاجية ميكرولتر سعة 10 ميكرولتر بإبرة حادة 33 جيجا ، اسحب 2 ميكرولتر من الخلايا / الوسائط. اسحب الخلايا قبل الحقن مباشرة لتجنب استقرار / تكتل الخلايا في المحقنة.
- باستخدام إبرة 30G يمكن التخلص منها ، قم بعمل جرح استئصال الصلبة 2 مم خلف الليمبوس. حافظ على زاوية الإبرة عند ~ 45 درجة لتجنب لمس العدسة. بمجرد تصور طرف الإبرة في العين ، اسحب الإبرة برفق. تخلص من الإبرة في الحاوية الحادة بعد الاستخدام لتجنب إصابة وخز الإبرة.
- خذ المحقنة الزجاجية وأدخل الإبرة الحادة في جرح استئصال الصلبة. دون لمس العدسة ، قم بدفع الإبرة الحادة حتى تصل إلى شبكية العين المقابلة لجرح الدخول. تأكد من أن منطقة الحقن خالية من الأوعية الدموية الرئيسية في شبكية العين لتجنب النزيف.
- اخترق الشبكية برفق حتى يظهر فرع ضغط على الصلبة. حافظ على الطرف الحاد للإبرة موازيا للصلبة لتجنب تسرب الخلايا إلى الفضاء الزجاجي.
- حقن ببطء 2 ميكرولتر من تعليق الخلية أو وسائط PRDM (التحكم) في الفضاء تحت الشبكية مع الحفاظ على الضغط اللطيف على المحقنة. مع الحقن الناجح ، يجب تشكيل فقاعة مرئية (أي شبكية مرتفعة مع تعليق / وسائط الخلية فيها) في موقع الحقن.
ملاحظة: يجب استخدام الضغط اللطيف فقط أثناء الحقن لتجنب تمزق الشبكية وانسداد الخلايا عند طرف الإبرة. - بعد التأكد من الفقاعة ، انتظر لمدة 10 ثوان للسماح للخلايا بالاستقرار. اسحب الإبرة برفق من العين.
- التصوير المقطعي للتماسك البصري أثناء العملية (OCT) مسح الفقاعة (اختياري)
- ضع عين الماوس لتصور الفقاعة تحت المجهر عن طريق تحريك الرأس ببطء. تأمين الموقف عن طريق عقد الرأس برفق. لا يلزم توسيع حدقة العين الإضافي. لا تقم بإزالة زلة الغطاء والهلام على العين. يعطي وسائط بصرية واضحة لتصور الفقاعة.
- قم بإجراء OCT أثناء العملية باستخدام وظيفة iOCT المدمجة في مجهر التشغيل.
- اضغط على خيار Cube على شاشة OCT وضع منطقة المسح الضوئي على الفقاعة بالضغط على أزرار السهم . اضبط OCT عن طريق تحريك التوسيط والتركيز للحصول على أفضل جودة OCT. اضغط على Capture/Scan للحصول على مسح OCT لمنطقة الفقاعة. راجع الصور للتحقق من جودة عمليات المسح.
- الانتعاش
- قم بإزالة قسيمة الغطاء وتنظيف الجل من العين بالشاش. تطبيق مرهم مضاد حيوي مرة واحدة بعد الحقن لمنع العدوى.
- اسمح للحيوان بالتعافي من التخدير تحت ضوء دافئ حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي والعودة إلى قفص المنزل. راقب لمدة 3 أيام على الأقل بعد الحقن بحثا عن علامات الالتهاب والعدوى والضيق.
ملاحظة: يجب أن يكون الضوء الدافئ 150 واط على بعد 30 سم على الأقل من قفص ، ويجب توخي الحذر لتجنب إصابة الحروق. - تطبيق حقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ) 8 كل ساعة لمدة 1 يوم أو حسب توصية الطبيب البيطري. إذا لوحظ التهاب أو عدوى في العين ، استشر أخصائي بيطري للحصول على العلاج المناسب.
- تنظيف وتعقيم الأدوات
- اغسل حقنة ميكرولتر زجاجية سعة 10 ميكرولتر وإبرة حادة 33G بإيثانول 100٪ 10x. اغسل الإيثانول عن طريق وميض المحقنة بالماء المقطر.
- قم بتفكيك المحقنة الزجاجية والإبرة. تجفيف حقنة للتخزين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تجميع المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1) ، وتظهر الإبرة الحادة المستخدمة لتوصيل تعليق / وسائط الخلية في الشكل 1 ب. يوضح الشكل 2 طرقا مختلفة للحقن تحت الشبكية. نصف نهج pars plana في هذا البروتوكول (الشكل 2C). تم إدخال الإبرة الحادة المثبتة على حقنة زجاجية من خلال جرح بضع التصلب والوصول إلى الفضاء تحت الشبكية في جميع أنحاء العالم. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تمت مراقبة مسار الإبرة ، والاختراق عبر الشبكية ، وتوصيل الخلايا مباشرة تحت المجهر عند إجراء الحقن. تم تأكيد التسليم الناجح للخلايا / الوسائط من خلال ملاحظة فقاعة في موقع الحقن (الشكل 3 ب). يمكن تحديد الفقاعة الناجحة على أنها لون أبيض فاتح يشبه بالون الماء. لوحظ فشل التسليم عن طريق تسرب الخلايا / الوسائط إلى الفضاء الزجاجي في موقع الحقن والفشل في تكوين فقاعة. تم إجراء فحص OCT على المنطقة المحقونة ، وأظهر الفحص hESCs فردية عائمة في العين المعالجة بالخلايا (الشكل 4 أ) ، بينما أظهرت العين المعالجة بالوسائط سائلا صافيا بدون خلايا في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 4 ب). يتم تحديد hESCs الفردية على أنها مواد مفرطة الانعكاس موزعة في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 4 أ). تم حساب معدل نجاح الحقن من خلال ملاحظة عدد العيون ذات التكوين الناجح للفقاعة. قمنا بتضمين التطبيقات التي اعتمدت هذا النهج في مختبرنا ومعدل نجاح الحقن (الجدول 1).
الشكل 1: الأدوات المستخدمة أثناء الحقن. (أ) المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر مثبتة بإبرة حادة 33 جرام. (ب) صورة تكبير للإبرة الحادة 33G. ج: وسادة يرتكز عليها رأس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: طرق مختلفة للحقن تحت الشبكية. أ: الطريق عبر القرنية: تمر إبرة الحقن عبر القرنية والبؤبؤ لتدخل الحيز تحت الشبكية. (ب) الطريق عبر الصلبة: يتم الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية مباشرة من خلال الصلبة. (ج) طريق بارس بلانا: يتم إدخال إبرة الحقن في الفضاء الزجاجي عن طريق شق في الطرف. تصل الإبرة إلى الفضاء تحت الشبكية عن طريق اختراق الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور قاع العين أثناء الحقن تحت الشبكية. (أ) قبل إجراء الحقن تحت الشبكية، كان من الممكن رؤية طرف الإبرة في الحيز الزجاجي يلامس الشبكية، مع تجنب الأوعية الدموية الرئيسية في الشبكية. (ب) بعد الحقن تحت الشبكية، تشكلت فقاعة مرئية في موقع الحقن (خط أصفر منقط). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فحوصات OCT أثناء العملية للعيون المحقونة. تم إجراء الفحوصات مباشرة بعد الحقن. (أ) العين المعالجة ب hESCs: أظهرت اللوحة العلوية موقع مسح OCT (خطوط المقطع العرضي السماوي والوردي) على العين ؛ لوحظت hESCs في العين المعالجة في الفضاء تحت الشبكية (الخط المنقط الأصفر والألواح الوسطى والسفلية). (ب) العين المعالجة بالوسائط: أظهرت اللوحة العلوية موقع مسح OCT (خطوط مقطعية سماوية وزهرية) على العين ؛ لوحظ وجود سائل صاف بدون خلايا في الفضاء تحت الشبكية في العين المحقونة بالوسائط (الخط المنقط الأصفر والألواح الوسطى والسفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| التطبيقات | سلالة المتلقي | نسبة النجاح |
| آف | Rpe65rd12 / J | 80% |
| آف | C57BL / 6 | 95% |
| الخلايا السلفية المشتقة من hESC | Rd10-/- | 95% |
الجدول 1: معدل نجاح الحقن تحت الشبكية في التطبيقات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية23،25،26،27،28،31،40. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العلاج الجيني ولكن أيضا لتقييم المركبات العلاجية الجديدة لأمراض الشبكية. حاليا ، يتم استخدام ثلاثة طرق رئيسية لتوصيل الخلايا أو AAVs إلى الفضاء تحت الشبكية ، أي الطريق عبر القرنية ، والطرق عبر الصلبة ، والطرق المسطحة.
في النهج عبر القرنية ، تمر إبرة الحقن عبر القرنية ، بؤبؤ العين ، وأخيرا الشبكية لتوصيل الخلايا إلى الفضاء تحت الشبكية وتشكيل فقاعة ناجحة. ميزة النهج عبر القرنية هي القدرة على إنشاء انفصال شبكي كامل في المتلقي47. يمكن أن تقدم عددا أكبر من الخلايا. ومع ذلك ، فإن الملاحظة الطولية لدراسة التشكل الهيكلي وتكامل الخلايا تمثل تحديا في هذا النهج. بالإضافة إلى ذلك ، تشمل المضاعفات تكوين إعتام عدسة العين ، وتزامن ، وعتامة القرنية ، مما يجعل الملاحظات الطولية تتحدى11،45،47،48. بدلا من ذلك ، يتم استخدام النهج عبر الصلبة أيضا لتوصيل AAV إلى الفضاء تحت الشبكية44,49. هذا النهج مفيد للفئران حديثي الولادة ويعتبر أكثر أمانا لأنه ليس من الضروري أن تمر الإبرة عبر وسائط العين. ومع ذلك ، لا ينبغي تجاهل النزيف المشيمي ، ارتداد المحلول من موقع الحقن ، ثقب الشبكية ، والتسرب إلى الفضاء الزجاجي.
اعتمدنا نهج pars plana لإدخال أسلاف المستقبلات الضوئية المشتقة من hESC في الفضاء تحت الشبكية باستخدام إبرة حادة 33G. في هذا النهج ، تم إدخال إبرة الحقن عن طريق شق في منطقة الطرف. ثم تم تمرير الإبرة عبر التجويف الزجاجي وأخيرا وصلت إلى الفضاء تحت الشبكية من خلال الشبكية. غالبا ما لوحظت كتل الخلايا وقد تمنع توصيل الخلايا عند استخدام أحجام إبرة غير مناسبة. يجب إجراء إعادة تعليق الخلايا في أنبوب الميكروفوج بعناية باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر قبل التحميل في حقنة الحقن. حاولنا في البداية استخدام إبرة 34G ، حيث لوحظ انسداد الإبرة بواسطة الخلايا في كثير من الأحيان. يجب اختبار الحجم المناسب للإبرة لأنواع معينة من الخلايا ، خاصة الإبر ذات التجويف الضيق التي تميل إلى إعطاء خلايا أقل قابلية للحياة عند حقنها50. تتمثل إحدى مزايا هذا النهج في التصور المباشر أثناء الحقن ، مما يسمح للجراح بمراقبة الموقع المحدد لتوصيل الخلايا واختياره بعناية. يجب أن تكون منطقة الحقن والإبرة مرئية بوضوح أثناء العملية. يمكن أن يؤثر إعتام عدسة العين الناجم عن التخدير وعتامة القرنية بشكل كبير على التوصيل السليم للخلايا إلى مكان معين.
أثناء إجراء الحقن ، يجب أن تخترق الإبرة شبكية العين بشكل عمودي ، ويجب أن تكون النهاية الحادة للإبرة موازية للصلبة لتقليل تسرب الخلايا المحقونة إلى الفضاء الزجاجي (الشكل 3). يجب تطبيق ضغط لطيف فقط على المحقنة عند إجراء الحقن. يمكن أن يؤدي الضغط القوي إلى تمزق الشبكية ، والنزيف ، وتسرب الخلايا إلى الفضاء المشيمي ، وفشل الخلايا في المرور عبر الإبرة ، وثقب مقلة العين. يمكن ضمان الضغط الأمثل عندما يمر طرف الإبرة عبر الشبكية ، وترى نقطة ضغط بيضاء صغيرة عند طرف الإبرة. بعد الحقن ، يجب سحب الإبرة ببطء وبلطف من مكان الحقن لمنع تسرب الخلايا المحقونة إلى الفضاء الزجاجي.
الحد من هذا النهج هو منحنى التعلم الصعب. أظهرت دراسة أن طبيب عيون مدرب يحتاج إلى إجراء 364 حقنة في الفئران لتحقيق معدل نجاح بنسبة 95٪ ، بينما كان من المتوقع أن يحتاج المتدربون الأقل خبرة من ذوي الخبرة الجراحية إلى عدد أكبر من التدريبات46. تشمل مضاعفات هذا النهج مسار الإبرة في شبكية العين ، وارتجاع الخلايا إلى الفضاء الزجاجي ، والنزيف من المشيمية / الشبكية ، وإعتام عدسة العين علاجي المنشأ. ومع ذلك ، مع وجود قدر كاف من التدريب ، يتم ملاحظة هذه المضاعفات بشكل ملحوظ46.
في الختام ، يمكن لطريقتنا توصيل أسلاف المستقبلات الضوئية المشتقة من hESC إلى الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 ، كما هو موضح بوضوح في فحوصات OCT. يمكن اعتماد هذا النهج لاستكشاف مركبات علاجية جديدة ، وزرع أنواع مختلفة من الخلايا ، والعلاج الجيني لعلاج الشبكية الخارجية والأمراض المرتبطة ب RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
هوي غون تاي هو أحد مؤسسي شركة Alder Therapeutics AB. يعلن مؤلفون آخرون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر وي شنغ تان ولوان شيانغ شيويه ين وشيني لي وينغينغ تشونغ على تقديم المساعدة الفنية لإعداد اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC بعد الحفظ بالتبريد. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من جائزة منحة أبحاث الباحثين الشباب التابعة للمجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) ومنحة برنامج البحث التنافسي الرابع والعشرين لمؤسسة البحوث الوطنية (CRP24-2020-0083) إلى H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
