Summary
כאן אנו מציגים שיטה לחקר תרדמת חורף של חיפושיות תפוחי אדמה בקולורדו בתנאים הטבעיים של האזור הממוזג, כמו גם טכניקה לאיסוף חיפושיות בחורף. שיטה זו מאפשרת להשיג מספר רצוי של אנשים חורפים עבור ניתוחים שונים בכל שלב של תרדמה.
Abstract
אחד המזיקים העיקריים של תפוח אדמה Solanum tuberosum L. באזור ממוזג הוא חרק חיפושית תפוחי אדמה קולורדו (CPB). רוב המחקרים על חסינות ומחלות של CPB נערכים במהלך שלבי האכלה פעילה. עם זאת, ישנם פחות מחקרים על שלבי מנוחה, אם כי חיפושיות אלה מבלות את רוב מחזור חייהן במצב של דיאפאוזה חורפית (תרדמת חורף). בעבודה זו פותחה ונבחנה שיטה לחקר תרדמת CPB בתנאים טבעיים, המציעה הזדמנות לאסוף מספר מספיק של פרטים בחורף. במאמר זה הוערכה הישרדות CPB, וזוהו סוכנים זיהומיים בשלבים שונים של תרדמת חורף. התמותה מ-CPB עלתה במהלך תרדמת החורף, והגיעה למקסימום באפריל-מאי. מהחרקים המתים בודדו פטריות אנטומופתוגניות (Beauveria, Isaria ו-Lecanicillium) והחיידקים Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas ו-Serratia . שיעור ההישרדות של החיפושיות במשך כל תקופת תרדמת החורף היה 61%. לא נמצאו חיפושיות קפואות או מיובשות, דבר המעיד על הצלחת השיטה המוצגת.
Introduction
חיפושית תפוחי אדמה מקולורדו Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) היא מזיק חשוב של צמחי Solanaceae, בעיקר תפוח אדמה Solanum tuberosum L. הטווח הגיאוגרפי של מין זה הוא יותר מ -16 מיליון ק"מ2 ומתרחב כל הזמן1. ל- CPB יש דיאפאוזה חורפית פקולטטיבית, ותרדמת חורף היא חובה באזור הממוזג. הדיאפאוזה נגרמת על ידי פוטופריוד קצר של יום ומווסתת על ידי טמפרטורה1. חיפושיות אלה חורפות בשלב הבוגר על ידי התחפרות באדמה. עם קווי רוחב הולכים וגדלים, משך תקופת תרדמת החורף מתארך. באזור הממוזג, במיוחד בשטחים הצפוניים של טווח התפוצה שלו, החורף נמשך עד 9 חודשים: מאוגוסט-ספטמבר עד מאי-יוני (Noskov et al., תצפיות אישיות). במהלך תקופה זו, CPB - בדיוק כמו כל חרק אחר באזור ממוזג - חשוף לתנאי חורף שליליים חייב להגביר את סובלנותו לקור. יחד עם זאת, מגע של החיפושיות עם הקרקע מגביר את הסיכון לזיהום על ידי מיקרואורגניזמים אופורטוניסטיים ופתוגניים שונים2. לכן, חיפושיות אלה צריכות לשמור על רמה מסוימת של פעילות מערכת החיסון במהלך תרדמת החורף, שגם היא יקרה מבחינה אנרגטית. עם זאת, גם אם החרק שורד זיהום, המחלה עשויה להפחית את קשיות הקור שלו3. יש לציין כי טמפרטורה נמוכה אינה הסיבה היחידה לתמותה בחורף של CPB. תפקיד חשוב הוא גם שיחק על ידי חוסר חמצן, ובתנאים מסוימים, זה יכול להיות הגורם העיקרי של תמותה החורף 4,5.
ידוע כי תמותה טבעית בחורף של CPB יכולה להיות גבוהה מאוד, ולהגיע ל -100% בקרקעות חרסיתיות6. לכן, חורף יתר הוא אחת התקופות המכריעות ביותר במחזור החיים של CPB. עם זאת, נתונים על הפיזיולוגיה, פעילות מערכת החיסון, הישרדות ופרמטרים אחרים של תרדמת CPB בתנאים טבעיים עדיין מוגבלים. ישנם מחקרים על ביטוי גנים דיפרנציאלי ופרמטרים פיזיולוגיים שונים במבוגרים CPB במהלך הדיאפאוזה ובתגובה להלם קור 7,8,9,10,11,12; עם זאת, ניתוחים אלה בוצעו בעיקר על ידי השראת דיאפאוזה או לחץ קר בתנאי מעבדה ללא תנודות טבעיות של טמפרטורה, לחות ועומס פתוגן טבעי. עם זאת, יש חשיבות למחקר על הפיזיולוגיה של חיפושיות אלה שנאספו בחפירה מהקרקע בתנאים טבעיים. היבטים שונים של CPB חורף בתנאים טבעיים נחקרו באופן פעיל בשנות השבעים והשמונים 13,14,15,16,17,18. מצד שני, מחקרים אלה לא כללו חפירת CPB מהאדמה בחורף. בנוסף, טכניקה לתרדמה מבוקרת של CPB ותיאור הכלובים אינם מסופקים בפירוט. לפיכך, יש צורך לחקור את הפיזיולוגיה של CPBs החורפים בסביבה טבעית19.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח ולבדוק שיטה לתרדמה מבוקרת של מבוגרים CPB בתנאים טבעיים. השיטה המוצעת מאפשרת להשיג מספר רצוי של אנשים CPB עבור בדיקות מיקרוביולוגיות, אימונולוגיות ואחרות במהלך תרדמת החורף בתנאי שדה של אקלים יבשתי. שיטה זו ניתנת להתאמה וליישום על מיני חרקים אחרים החורפים באדמה תחת שלג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תיאור הכלובים לתרדמת חורף
הערה: בהתאם למטרות הניסוי, מספר הכלובים משתנה. יש להשתמש לפחות בשלושה כלובים בכל תאריך דגימה. כדי להעריך את מספר החיפושיות שיצאו, הכינו לפחות שלושה כלובים נוספים, שלא יוצאו מהאדמה עד האביב.
- השתמשו בכלובים העשויים מסגרת עץ קשיחה בגודל 25 × 25 × 40 ס"מ (L × W × H).
- לבניית מסגרת לכלוב יש להשתמש בלוחות עץ בעובי 2 ס"מ לפחות וברוחב 4 ס"מ.
- כסו את פנים הכלוב ברשת נירוסטה בגודל פתחים שאינו עולה על 5 מ"מ × 3 מ"מ. השתמש מהדק עץ כדי לתקן את הרשת.
- קבע את רשת הנירוסטה לחלק החיצוני של התחתית באמצעות המהדק.
- רפדו את פנים הכלוב בגיאוטקסטיל סינתטי שחור בצפיפות של 60 גרם/מ"ר2.
הערה: הגיאוטקסטיל משמש מחסום נוסף למניעת בריחת החיפושיות. אין להשתמש בו בניסויים הקשורים לתנועה פעילה של אנטומופתוגנים וטפילים. - חברו בחוזקה צינור של בד סינתטי שקוף ונושם בגובה של כ-60 ס"מ לחלק העליון של הכלוב.
- חוצים ומקבעים שני חבלים חזקים לתחתית הכלוב כדי למשוך אותו מהאדמה בעת הצורך.
2. התקנת הכלובים
- חופרים בור בעומק 40 ס"מ באדמה ומניחים את הכלוב בתוכו.
- הניחו דשא יבש או חציר על החור.
- הניחו את הכלוב בתוכו כך שהחציר או העשב היבש יהיו בין דפנות הכלוב לאדמה.
- מלאו את הכלובים באדמה מאותו שדה תפוחי אדמה שבו נאספים החרקים.
- התקינו אוגרי נתוני טמפרטורה ולחות עמידים למים בכלובים בעומקים הנדרשים.
הערה: ניתן להשתמש באוגרי נתונים מכל יצרן ועליהם להיות מסוגלים לפעול בטמפרטורות נמוכות. - שתול שתילי תפוחי אדמה בתוך כל כלוב 3-4 שבועות לפני כניסת החיפושיות והשקו אותם במתינות.
- מקבעים צינור בד סינטטי במאונך למקל מכל חומר המותקן בצד החיצוני של הכלוב.
3. גידול חרקים לפני חורף
- אספו ידנית חיפושיות בוגרות בשדות תפוחי אדמה ללא חומרי הדברה לקראת סוף צמחיית תפוחי האדמה.
הערה: חיפושיות בוגרות שונות באופן מהותי מהזחלים ומאופיינות באליטה מפוספסת, בעוד שהזחלים אדומים. - שמרו את החיפושיות שנאספו בדליים מפלסטיק של 15-20 ליטר (מקסימום 200 פרטים לכל דלי) המכילים צמרות תפוחי אדמה להאכלת החרקים לפני הכנסתם לכלובים.
- מכסים את הדליים בבד נושם.
הערה: אין להחזיק חרקים בדליים במשך יותר מ-12 שעות. השתמשו בצמרות תפוחי אדמה גדולות מספיק כדי למנוע הצטברות של חיפושיות בתחתית הדליים. - הניחו לא יותר מ-200 CPB על צמחי תפוחי האדמה המכוסים ברשת הבד הסינתטי.
- לאחר צריכת צמרות תפוחי האדמה, הוסיפו את הטריות המונחות בצנצנת פלסטיק המכילה מים והחליפו את צמרות תפוחי האדמה מדי יום לאחר מכן.
הערה: כדי לתקן גבעולים בצנצנת, השתמש בצמר גפן ופרפילם. בדוק בזהירות גבעולים ישנים עבור החיפושיות בעת הסרתם. - לאחר שכל החיפושיות מתחפרות באדמה לחורף, התירו את צינור הבד הסינתטי מהמקל והניחו את הבד.
4. איסוף חרקים בעונת החורף
- יש להסיר שלג מעל פני הכלוב.
- שחררו את הכלוב מכל צד עם חפירה חזקה.
- משכו את הכלוב מהאדמה בעזרת החבלים.
- הביאו את הכלוב למעבדה.
הערה: בהתאם למטרות הניסוי, חיפושיות בתרדמת חורף עשויות להיות לא פעילות לפני הניתוח. במקרה זה, הטמפרטורה במעבדה במהלך בידוד של חיפושיות מן הקרקע צריך להיות ~ 2-5 ° C. - מוציאים את האדמה מהקופסה במנות קטנות, מפרקים בזהירות חתיכות אדמה גדולות ומבודדים חיפושיות באמצעות פינצטה.
- להפריד חיפושיות חיות מגופות. חיפושיות חיות ובריאות יוצרות סביבן אדמה קומפקטית, יוצרות חלל אוויר (מה שנקרא עריסה), ולכן הן מופרדות בקלות מהאדמה. חיפושיות שנהרגות על ידי פטריות נחנטות או שיש להן תפטיר גלוי על פני השטח. חרקים המתפרקים חיידקים הם כהים.
- לנפות את הקרקע דרך מסננת כדי לוודא שכל החיפושיות מבודדות ולא ניזוקו.
- מניחים גופות עם תסמינים של זיהום פטרייתי או פירוק חיידקי בצינור צנטריפוגה סטרילי בודד של 15 מ"ל לזיהוי עתידי.
- אחסנו חיפושיות חיות במקרר בטמפרטורה של 0-2 מעלות צלזיוס עד לניתוח במיכל מאוורר סגור המכיל כדור צמר גפן לח.
5. הכנת דגימות איברים ורקמות
- כדי לאסוף hemolymph, לעשות נקב בחלק הצדדי של הבטן תחת אליטרה באמצעות מחט אינסולין.
הערה: במהלך החורף, כמות ההמולימפה מופחתת באופן משמעותי, מה שמקשה על איסוף נוזל זה. - כדי לבודד את המעיים, חתכו את קפסולת הראש, סחטו את כל התוכן לתוך צלחת פטרי עם חיץ פוספט, הפרידו את המעי ונקו אותו משומן וכלי דם מלפיגיים.
- הפרידו בין החלק הרצוי של המעי, כמו המעי הקדמי, המעי האמצעי או המעי האחורי.
- כדי לבודד את גוף השומן, להפריד אותו מרקמות אחרות לאחר בידוד של המעיים.
הערה: הרקמות המבודדות יכולות לשמש למדידת הפעילות של אנזימים נוגדי חמצון ומסלקי רעלים (דוגמה: איור משלים 1), ניתוח של ויסות גנים של מסלול איתות חיסוני (דוגמה: איור משלים 2), או מטא-ברקוד של תכולת מעיים של חרקים וכו'.
6. בידוד מיקרואורגניזמים מן הגופות
- כדי לבודד פטריות אנטומופתוגניות מהגופות, הכניסו את החרקים החנוטים לתא לחות סטרילי.
- יש להשתמש בקונידיה אווירית (אם קיימת) או בסקלרוטיה מהתוכן הפנימי של החיפושיות לציפוי על אגר דקסטרוז Sabouraud עם 0.4% חומצה לקטית.
הערה: השתמש בחיפושיות עם תפטיר וקונידיה לציפוי באופן מיידי (מבלי למקם אותן בתאי לחות). - לבודד חיידקים מן הגופות עם סימפטומים של פירוק חיידקים.
- חתכו את ראשה של החיפושית, סחטו את התכולה הפנימית ואספו אותה לצינורות לציפוי הבא על מצע לחיידקים (אגר לוריא-ברטאני, אגר אנדו ואגר אסקולין מרה).
הערה: השתמש במיקרוסקופ ובשיטות מולקולריות כדי לזהות סוגים ומינים של פתוגנים. במידת הצורך, ניתוח לנוכחות של טפילים אחרים ניתן לבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות להלן על CPB חורף מראות טמפרטורת קרקע, הישרדות וזיהומים.
דינמיקה של טמפרטורת הקרקע.
טמפרטורות מתחת לאפס בכלובים בעומק של 30 ס"מ נרשמו מסוף נובמבר עד תחילת אפריל (איור 1). הטמפרטורה הממוצעת בתקופה זו הייתה מינוס 3.3 ± 0.1 °C (75 °F) (ממוצע ± שגיאת תקן). הטמפרטורה הנמוכה ביותר שנרשמה הייתה מינוס 7.9 °C (75 °F) באמצע פברואר.
הישרדות של CPB חורף.
תמותת חרקים נצפתה במהלך תרדמת החורף והגיעה למקסימום באביב לפני הופעתם. המספר הראשוני של חיפושיות היה 2000, מתוכם 1470 פרטים שרדו עד סוף מאי. שיעור ההישרדות של החיפושיות במהלך תרדמת החורף היה 61% (איור 2).
זיהומים ב- CPB חורף.
ניתוח של 530 חיפושיות מתות הראה שבמהלך תקופת תרדמת החורף, ל-53% מהן היו תסמינים של פירוק חיידקים, ול-25% היו תסמינים של זיהומים פטרייתיים (איור 3). בווריה שלטה (45 מבודדים) בין התרבויות המבודדות של פטריות אנטומופתוגניות. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) ו Lecanicillium היו הרבה פחות נפוצים (שני מבודדים כל אחד). בין החיידקים שבודדו מהגופות עם תסמינים של פירוק חיידקים (n = 30), זוהו מינים השייכים לסוגים Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella ו - Glutamicibacter (טבלה משלימה 1).
איור 1: דינמיקת טמפרטורת הקרקע. דינמיקת טמפרטורת הקרקע כפי שנמדדה על ידי אוגר נתוני טמפרטורה עמיד למים המותקן בעומק של 30 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הישרדות של חיפושיות תפוחי אדמה חורפיות בקולורדו בתקופות שונות של תרדמת חורף. הכלובים נחפרו, והחיפושיות ששרדו והמתות נספרו בנובמבר, ינואר, אפריל ומאי. ברים מייצגים את מספר החיפושיות ששרדו. שפם מציין שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהומים בגופות חיפושיות תפוחי אדמה בקולורדו בחורף יתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
חומרים משלימים: לחץ כאן כדי להוריד את הקבצים המשלימים שלהלן.
תרשים משלים 1. פעילות של אסטראזות לא ספציפיות באמצע המעי של CPB במהלך תרדמת החורף. שפם מציין שגיאת תקן. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן (מבחן דאן, P < 0.05).
איור משלים 2: שינויים בביטוי גורם השעתוק NFkB (מסלול IMD) במעיים ובגוף השומן של CPB במהלך תרדמת החורף. הנתונים מוצגים כשינויי קיפול ביחס לנקודת זמן של אוגוסט. Rp4, Rp18 ו-Arf19 שימשו כגני ייחוס. שפם להציג שגיאת תקן.
טבלה משלימה 1: זיהוי משוער של רצפי גנים 16S rRNA (~800 bp) של חיידקים שבודדו מ-CPB מת במהלך תרדמת החורף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מראה כי השיטה המוצעת לחקר חורף היתר של CPB מאפשרת לנו להשיג מספר מספיק של חרקים בתקופות שונות של תרדמת חורף. ההצלחה של הטכניקה המוצגת תלויה במספר גורמים עצמאיים, החשוב שבהם הוא תנאי מזג האוויר. בחורף קר ונטול שלג, הקרקע עלולה לקפוא לכל עומק הכלוב. במקרה זה, הסיכון למוות של כל החיפושיות עולה באופן משמעותי18. הישרדותה של החיפושית תלויה בשילוב של גורמים רבים, אשר יכולים להשתנות באופן משמעותי משנה לשנה6.
בניסוי, טמפרטורת הקרקע בתוך הכלובים בחורף לא ירדה מתחת למינוס 7.9 מעלות צלזיוס. לא נצפה קרח בעומק העולה על 25 ס"מ, והאדמה נותרה רופפת גם בתקופת ההתקררות הגדולה ביותר (ינואר-פברואר). רוב החיפושיות הצטברו בחלקו התחתון של כל כלוב, בעומק של 30-40 ס"מ. ייתכן שהחיפושיות התחפרו עמוק יותר עם עומק גדול יותר של הכלובים. מצד שני, הגדלת עומק הכלוב תוביל לעלייה במשקל, מה שיקשה על חילוץ הכלוב מהאדמה, במיוחד בחורף. יתר על כן, על פי התצפיות שלנו בשדות תפוחי אדמה באזור הנחקר, CPB אינו מתחפר עמוק יותר מ -35 ס"מ עבור חורף יתר. ממצא זה יכול להיות מוסבר על ידי שכבת הקרקע החרסיתית בעומק של 30-35 ס"מ, שהחיפושיות אינן יכולות להתגבר עליה. בניסוי שלנו נעשה שימוש באדמה חולית ודשנה מהאופק העליון של 30 ס"מ. זו כנראה הסיבה לכך שהחיפושיות הצליחו להתחפר עמוק יותר מאשר בתנאים טבעיים. העומק שבו CPB נכנס למצב שינה הוא בדרך כלל 10-25 ס"מ (ref. 1), אבל זה עשוי להשתנות בין אזורים גיאוגרפיים. לדוגמה, בצפון מזרח ארצות הברית (ניו ג'רזי), רוב החיפושיות נכנסות לתרדמת חורף בעומק של 10-13 ס"מ (ref. 13). עומקים דומים של חיפושיות חורף (≤15 ס"מ) תועדו גם בוויסקונסין, ארה"ב18. בדרום אוראל (רוסיה), העומק שבו CPB מתחפר עבור החורף הוא בטווח של 5-30 ס"מ (ref. 20). יש לציין כי שיעור ההישרדות של חרקים לא תמיד בקורלציה חיובית עם עלייה בעומק החורף1. ואכן, בניסוי חורף שדה באסטוניה6, הוכח כי שיעור ההישרדות של CPB היה גבוה יותר בעומק של 30 ס"מ מאשר בעומק של 50 ס"מ. מחברים אלה מציעים כי ממצא זה עשוי להיות בשל חוסר חמצן. נתונים דומים התקבלו בניסוי שדה בוויסקונסין, ארה"ב18: שיעור ההישרדות הגבוה ביותר (51.5%) של CPB חורף נרשם בעומק של 15-25 ס"מ. במקביל18, 100% תמותה של החיפושית צוין בעומק של 25-35 ס"מ. אנו מאמינים שעומק של 40 ס"מ מספיק לניסויים באזור הממוזג מכיוון שאחוז החיפושיות ששרדו היה גבוה, והקפאת הקרקע לא הגיעה לכל עומק הכלוב. נוכחותו של כיסוי שלג תורמת לקירור פחות של הקרקע. במידת הצורך, ניתן להתאים את עובי כיסוי השלג מעל פני הכלובים.
נקודת מפתח נוספת בפרוטוקול היא המוכנות הלא מספקת של CPB לחורף יתר בגלל כמות קטנה של חומרים מזינים מאוחסנים. חלק מה-CPB הבוגרים נשארו על פני הקרקע לאחר ההתחפרות ההמונית של החיפושיות בקרקע. ייתכן שהם לא אגרו מספיק שומן מכיוון שהצלחת החורף תלויה גם בכמות החומרים המזינים המצטברים21. בנוסף, כאשר הוצאו הכלובים מהאדמה בחורף, חלק מהחיפושיות היו במצב קפוא על פני הקרקע או בשכבה הקרובה לפני השטח. אולי אלה החיפושיות שלא הייתה להן מספיק אנרגיה להתחפר בגלל תת-תזונה, זיהומים או גורמים מזיקים אחרים. Lashomb et al.13 ציינו בניסויים עם CPB overwintering כי ~ 15 % מהבוגרים לא התחפרו באדמה עבור חורף יתר. מחברים אלה לא דנו בסיבות. בכל מקרה, יש צורך לספק חיפושיות עם מספיק מזון.
בהתאם למטרות המחקר, ייתכן שיהיה צורך לשמור על חיפושיות במצב תרדמה לאחר שהן נאספות מהאדמה. לשם כך, טמפרטורת המעבדה צריכה להיות קרירה, ואת החיפושיות צריך להיות ממוקם מיד בתנאים של 0-2 מעלות צלזיוס לאחר מיצוי מן הקרקע. נצפה בעבודתנו כי בסתיו ובאביב, CPBs מתחילים כמעט מיד בפעילות מוטורית לאחר שנחפרו מהאדמה; תהליך זה מתרחש הרבה יותר לאט באמצע החורף.
מחקר זה לא לקח בחשבון אנטומופתוגנים וטפילים הנעים באופן פעיל. השתמשנו בגיאוטקסטיל כמחסום נוסף נגד התפשטות ה-CPB. שים לב כי אין להשתמש בגיאוטקסטיל במחקר על אנטומופתוגנים הנעים באופן פעיל (למשל, נמטודות אנטומופתוגניות), טורפים או טפילים מכיוון שזה יעכב את תנועתם דרכו.
חשוב לציין כי מחקרים על חסינות ומחלות של CPB נערכים בעיקר בשלבי הזנה פעילה. שלבי המנוחה נחקרים פחות ונבדקו בעיקר בתנאי מעבדה. בתנאים אלה, עם זאת, קשה לדמות את תנודות הטמפרטורה, הלחות והאוורור המתרחשות באתרי רבייה טבעיים. לפיכך, ניסויי שדה עדיפים22. כדי לקבוע את הגורמים לתמותה בחורף CPB בשדה בתקופות תרדמה שונות, יש צורך לחפור חיפושיות חורף מהקרקע. מחקרים על CPB overwintering בתנאים טבעיים נערכו באופן פעיל בשנות השבעים והשמונים. השיטות המתוארות במאמרים אלה כוללות בעיקר איסוף וספירה של פרטים המופיעים באביב13, הערכת היעילות של שימוש בפטריות אנטומופתוגניות 14,15,16 או נמטודות אנטומופתוגניות 15 לפני חורף יתר, ואיסוף חיפושיות חורף מהקרקע באביב ובסתיו כדי לקבוע תמותה טבעית בחורף 17. יחד עם זאת, הגדלים והצורות של הכלובים ששימשו בניסויים אלה נעו בין 20×20 ס"מ ל-90×90×90 ס"מ (ref.13) או 180×60×30 ס"מ (ref.18). יש לציין כי המחקרים הנ"ל לא נועדו לפתח את המתודולוגיה עבור CPB overwintering עם אפשרות של איסוף חרקים בחורף. בניגוד לשיטות הקיימות, הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשרת לחקור אוכלוסיות CPB טבעיות בתקופת שלג.
לסיכום, השיטה המוצעת מאפשרת לחוקרים להשיג את המספר הרצוי של פרטים החורפים CPB בתנאים טבעיים עם תמותה נמוכה יחסית של החרקים ובעלות נמוכה. חקירת היבטים שונים של תרדמת CPB חיונית הן מנקודת מבט מחקרית בסיסית והן מנקודת מבט יישומית: לשיפור הגישות להדברת מזיק זה. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת למיני חרקים אחרים החורפים באדמה. חוקרים עתידיים עשויים ליישם שיטה זו כדי לחקור פיזיולוגיה כללית וביוכימיה - כולל חסינות של שלבי חורף יתר - של מיני חרקים שונים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש לחיזוי שפע המזיקים המעניינים, על בסיס תמותתם בחורף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לעמיתינו ולדימיר שילה, ורה מורוזובה, אוליאנה רוטסקאיה, אולגה פולנוגובה ואוקסנה טומילובה על עזרתם בארגון וביצוע נהלי השטח והמעבדה.
המחקר נתמך על ידי הקרן הרוסית למדע, פרויקט מס '22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
