Summary
यहां हम समशीतोष्ण क्षेत्र की प्राकृतिक परिस्थितियों के तहत कोलोराडो आलू बीटल हाइबरनेशन का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और साथ ही सर्दियों में बीटल एकत्र करने के लिए एक तकनीक भी प्रस्तुत करते हैं। यह विधि हाइबरनेशन के किसी भी चरण में विभिन्न विश्लेषणों के लिए वांछित संख्या में ओवरविंटरिंग व्यक्तियों को प्राप्त करने की अनुमति देती है।
Abstract
समशीतोष्ण क्षेत्र में आलू सोलनम ट्यूबरोसम एल के प्रमुख कीटों में से एक कीट कोलोराडो आलू बीटल (सीपीबी) है। सीपीबी की प्रतिरक्षा और रोगों पर अधिकांश अध्ययन सक्रिय भोजन चरणों के दौरान आयोजित किए जाते हैं। बहरहाल, आराम करने के चरणों पर कम अध्ययन हैं, हालांकि ये बीटल अपने जीवन चक्र का अधिकांश हिस्सा सर्दियों के डायपॉज (हाइबरनेशन) की स्थिति में बिताते हैं। इस काम में, प्राकृतिक परिस्थितियों में सीपीबी हाइबरनेशन की जांच के लिए एक विधि विकसित और परीक्षण की गई थी, जिससे सर्दियों में पर्याप्त संख्या में व्यक्तियों को इकट्ठा करने का अवसर मिला। इस लेख में, सीपीबी अस्तित्व का आकलन किया गया था, और हाइबरनेशन के विभिन्न चरणों में संक्रामक एजेंटों की पहचान की गई थी। सीपीबी मृत्यु दर हाइबरनेशन के दौरान बढ़ी, अप्रैल-मई में अधिकतम तक पहुंच गई। एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ब्यूवेरिया, इसारिया और लेकेनिसिलियम) और बैक्टीरिया बेसिलस, स्फिंगोबैक्टीरियम, पेरिबैसिलस, स्यूडोमोनास और सेराटिया को मृत कीड़ों से अलग किया गया था। पूरे हाइबरनेशन अवधि के लिए बीटल की जीवित रहने की दर 61% थी। प्रस्तुत विधि की सफलता का संकेत देते हुए कोई जमे हुए या विकृत बीटल नहीं पाए गए।
Introduction
कोलोराडो आलू बीटल लेप्टिनोटार्सा डेसेम्लिनेटा से (सीपीबी) सोलानासी पौधों का एक महत्वपूर्ण कीट है, मुख्य रूप से आलू सोलनम ट्यूबरोसम एल। इस प्रजाति की भौगोलिक सीमा 16 मिलियन किमी2 से अधिक है और लगातार1 का विस्तार करती है। सीपीबी में शीतकालीन डायपॉज संकाय है, और शीतोष्ण क्षेत्र में हाइबरनेशन अनिवार्य है। डायपॉज एक छोटे दिन की फोटोअवधि से प्रेरित होता है और तापमान1 द्वारा नियंत्रित होता है। ये भृंग वयस्क अवस्था में मिट्टी में डूब जाते हैं। बढ़ते अक्षांशों के साथ, हाइबरनेशन अवधि की अवधि बढ़ जाती है। समशीतोष्ण क्षेत्र में, विशेष रूप से इसकी सीमा के उत्तरी क्षेत्रों पर, ओवरविंटरिंग 9 महीने तक रहती है: अगस्त-सितंबर से मई-जून तक (नोस्कोव एट अल। इस अवधि के दौरान, सीपीबी-समशीतोष्ण क्षेत्र में किसी भी अन्य कीट की तरह- प्रतिकूल सर्दियों की स्थिति के संपर्क में आता है और इसकी ठंड सहिष्णुता में वृद्धि करनी चाहिए। इसी समय, मिट्टी के साथ बीटल के संपर्क में विभिन्न अवसरवादी और रोगजनक सूक्ष्मजीवों द्वारा संक्रमण का खतरा बढ़जाता है। इसलिए, इन भृंगों को हाइबरनेशन के दौरान प्रतिरक्षा-प्रणाली गतिविधि के एक निश्चित स्तर को बनाए रखने की आवश्यकता होती है, जो ऊर्जावान रूप से महंगा भी है। बहरहाल, भले ही कीट संक्रमण से बच जाए, बीमारी इसकी ठंड कठोरता को कम कर सकतीहै। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम तापमान सीपीबी की सर्दियों की मृत्यु दर का एकमात्र कारण नहीं है। ऑक्सीजन की कमी से भी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जाती है, और कुछ स्थितियों के तहत, यह सर्दियों की मृत्यु दरका मुख्य कारक हो सकता है4,5.
यह ज्ञात है कि सीपीबी की प्राकृतिक सर्दियों की मृत्यु दर बहुत अधिक हो सकती है, जो मिट्टी की दोमट मिट्टी में 100% तक पहुंच जातीहै। इस प्रकार, सीपीबी जीवन चक्र में ओवरविंटरिंग सबसे महत्वपूर्ण अवधियों में से एक है। फिर भी, प्राकृतिक परिस्थितियों में सीपीबी हाइबरनेशन के शरीर विज्ञान, प्रतिरक्षा-प्रणाली गतिविधि, अस्तित्व और अन्य मापदंडों पर डेटा अभी भी सीमित है। डायपॉज के दौरान और ठंड के झटके 7,8,9,10,11,12 के जवाब में सीपीबी वयस्कों में अंतर जीन अभिव्यक्ति और विभिन्न शारीरिक मापदंडों पर अध्ययन हैं; हालांकि, ये विश्लेषण मुख्य रूप से तापमान, आर्द्रता और देशी रोगज़नक़ भार के प्राकृतिक उतार-चढ़ाव के बिना प्रयोगशाला स्थितियों के तहत डायपॉज या ठंडे तनाव के प्रेरण द्वारा किए गए हैं। बहरहाल, प्राकृतिक परिस्थितियों में मिट्टी से खुदाई द्वारा एकत्र किए गए इन बीटल के शरीर विज्ञान पर शोध महत्वपूर्ण है। प्राकृतिक परिस्थितियों में सीपीबी ओवरविंटरिंग के विभिन्न पहलुओं का 1970-1980 के दशक में सक्रिय रूप से अध्ययन किया गया था 13,14,15,16,17,18। दूसरी ओर, इन अध्ययनों में सर्दियों में मिट्टी से सीपीबी खुदाई शामिल नहीं थी। इसके अलावा, सीपीबी के नियंत्रित हाइबरनेशन के लिए एक तकनीक और पिंजरों का विवरण विस्तार से प्रदान नहीं किया गया है। इस प्रकार, प्राकृतिक सेटिंग्स में सीपीबी के शरीर विज्ञान की जांचकी आवश्यकता है।
इस अध्ययन का उद्देश्य प्राकृतिक परिस्थितियों में सीपीबी वयस्कों के नियंत्रित हाइबरनेशन के लिए एक विधि विकसित और परीक्षण करना था। प्रस्तावित विधि एक महाद्वीपीय जलवायु की क्षेत्र स्थितियों के तहत हाइबरनेशन के दौरान सूक्ष्मजीवविज्ञानी, प्रतिरक्षाविज्ञानी और अन्य परख के लिए सीपीबी व्यक्तियों की वांछित संख्या प्राप्त करने की अनुमति देती है। इस विधि को बर्फ के नीचे मिट्टी में ओवरविंटरिंग करने वाली अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित और लागू किया जा सकता है।
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Protocol
1. हाइबरनेशन के लिए पिंजरों का विवरण
नोट: प्रयोग के उद्देश्यों के आधार पर, पिंजरों की संख्या भिन्न होती है। प्रति नमूना तिथि कम से कम तीन पिंजरों का उपयोग करें। उभरने वाले भृंगों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, कम से कम तीन अतिरिक्त पिंजरे तैयार करें, जिन्हें वसंत तक मिट्टी से बाहर नहीं निकाला जाएगा।
- 25 × 25 × 40 सेमी (एल × डब्ल्यू × एच) के आकार के साथ एक कठोर लकड़ी के फ्रेम से बने पिंजरों का उपयोग करें।
- पिंजरे के लिए एक फ्रेम बनाने के लिए, कम से कम 2 सेमी मोटी और 4 सेमी चौड़ी लकड़ी की स्लैट का उपयोग करें।
- पिंजरे के अंदर को स्टेनलेस-स्टील जाल के साथ कवर करें जिसमें 5 मिमी × 3 मिमी से बड़ा उद्घाटन का आकार नहीं है। जाल को ठीक करने के लिए लकड़ी के स्टेपलर का उपयोग करें।
- स्टेपलर के साथ नीचे के बाहर स्टेनलेस-स्टील जाल को ठीक करें।
- पिंजरे के अंदर 60 ग्राम / मीटर2 के घनत्व के साथ एक काले सिंथेटिक जियोटेक्सटाइल के साथ लाइन करें।
नोट: भृंगों के भागने को रोकने के लिए जियोटेक्सटाइल एक अतिरिक्त बाधा के रूप में कार्य करता है। सक्रिय रूप से एंटोमोपैथोजेन ्स और पैरासाइटोइड्स को स्थानांतरित करने से संबंधित प्रयोगों में इसका उपयोग न करें। - पिंजरे के शीर्ष पर लगभग 60 सेमी ऊंचे सिंथेटिक पारभासी सांस लेने योग्य कपड़े की एक ट्यूब को कसकर संलग्न करें।
- जरूरत पड़ने पर मिट्टी से बाहर खींचने के लिए पिंजरे के तल पर दो मजबूत रस्सियों को पार करें और ठीक करें।
2. पिंजरों की स्थापना
- मिट्टी में 40 सेमी गहरा छेद खोदें और पिंजरे को अंदर रखें।
- छेद पर सूखी घास या घास बिछाएं।
- पिंजरे को अंदर रखें ताकि घास या सूखी घास पिंजरे की दीवारों और मिट्टी के बीच हो।
- पिंजरों को उसी आलू के खेत की मिट्टी से भर दें जहां कीड़े एकत्र किए जाते हैं।
- आवश्यक गहराई पर पिंजरों में जलरोधक तापमान और आर्द्रता डेटा लॉगर स्थापित करें।
नोट: किसी भी निर्माता से डेटा लॉगर का उपयोग किया जा सकता है और कम तापमान पर काम करने में सक्षम होना चाहिए। - बीटल के परिचय से 3-4 सप्ताह पहले प्रत्येक पिंजरे के अंदर आलू के पौधे लगाएं और उन्हें मध्यम रूप से पानी दें।
- पिंजरे के बाहर स्थापित किसी भी सामग्री की छड़ी पर लंबवत सिंथेटिक कपड़े की एक ट्यूब ठीक करें।
3. अधिक सर्दियों से पहले कीड़ों का पालन
- आलू वनस्पति के अंत में कीटनाशक मुक्त आलू के खेतों में वयस्क बीटल को मैन्युअल रूप से इकट्ठा करें।
नोट: वयस्क बीटल लार्वा से काफी भिन्न होते हैं और धारीदार एलिट्रा की विशेषता होती है, जबकि लार्वा लाल होते हैं। - एकत्रित भृंगों को पिंजरों में रखने से पहले कीड़ों को खिलाने के लिए आलू के शीर्ष वाले 15-20 लीटर प्लास्टिक की बाल्टी (अधिकतम 200 व्यक्ति प्रति बाल्टी) में रखें।
- बाल्टी को सांस लेने योग्य कपड़े से ढक दें।
नोट: 12 घंटे से अधिक समय तक बाल्टी में कीड़े न रखें। बाल्टी के तल पर बीटल के संचय को रोकने के लिए पर्याप्त आलू के टॉप का उपयोग करें। - सिंथेटिक कपड़े की जाली से ढके आलू के पौधों पर 200 से अधिक सीपीबी व्यक्तियों को न रखें।
- जब आलू के टॉप का सेवन किया जाता है, तो पानी युक्त प्लास्टिक के जार में सेट किए गए ताजा जोड़ें और बाद में आलू के टॉप को दैनिक रूप से बदलें।
नोट: एक जार में तनों को ठीक करने के लिए, कपास ऊन और पैराफिल्म का उपयोग करें। उन्हें हटाते समय बीटल के लिए पुराने तनों की सावधानीपूर्वक जांच करें। - एक बार जब सभी भृंग ों को ओवरविंटरिंग के लिए मिट्टी में डुबो दिया जाता है, तो छड़ी से सिंथेटिक कपड़े की ट्यूब को खोल दें और कपड़े को नीचे रख दें।
4. सर्दियों के मौसम के दौरान कीड़ों का संग्रह
- पिंजरे की सतह के ऊपर बर्फ हटा दें।
- एक मजबूत फावड़े के साथ प्रत्येक तरफ पिंजरे को ढीला करें।
- रस्सियों का उपयोग करके पिंजरे को मिट्टी से बाहर खींचें।
- पिंजरे को प्रयोगशाला में लाएं।
नोट: प्रयोग के उद्देश्यों के आधार पर, विश्लेषण से पहले हाइबरनेटिंग बीटल को निष्क्रिय होना पड़ सकता है। इस मामले में, मिट्टी से बीटल के अलगाव के दौरान प्रयोगशाला में तापमान ~ 2-5 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए। - बॉक्स से मिट्टी को छोटे हिस्सों में निकालें, मिट्टी के बड़े टुकड़ों को सावधानी से तोड़ें, और चिमटी का उपयोग करके बीटल को अलग करें।
- जीवित भृंगों को शवों से अलग करें। जीवित स्वस्थ भृंग अपने चारों ओर कॉम्पैक्ट मिट्टी बनाते हैं, एक वायु गुहा (एक तथाकथित पालना) बनाते हैं, और इसलिए, आसानी से मिट्टी से अलग हो जाते हैं। कवक द्वारा मारे गए भृंग ममीकृत होते हैं या सतह पर दिखाई देने वाले माइसेलियम होते हैं। बैक्टीरियल रूप से विघटित कीड़े गहरे रंग के होते हैं।
- यह सुनिश्चित करने के लिए छलनी के माध्यम से मिट्टी को छानें कि सभी बीटल अलग हैं और क्षतिग्रस्त नहीं हैं।
- भविष्य की पहचान के लिए एक व्यक्तिगत बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फंगल संक्रमण या जीवाणु अपघटन के लक्षणों वाले शवों को रखें।
- लाइव बीटल को एक रेफ्रिजरेटर में 0-2 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर स्टोर करें जब तक कि नम कपास की गेंद वाले एक बंद हवादार कंटेनर में विश्लेषण न हो।
5. अंग और ऊतक के नमूने तैयार करना
- हेमोलिम्फ को इकट्ठा करने के लिए, इंसुलिन सुई का उपयोग करके एलेट्रा के नीचे पेट के पार्श्व भाग में पंचर बनाएं।
नोट: ओवरविंटरिंग के दौरान, हेमोलिम्फ की मात्रा काफी कम हो जाती है, जिससे इस तरल को इकट्ठा करना मुश्किल हो जाता है। - आंत को अलग करने के लिए, सिर के कैप्सूल को काट दें, फॉस्फेट बफर के साथ पेट्री डिश में सभी सामग्री को निचोड़ें, आंत को अलग करें, और इसे वसा और माल्पीघियन वाहिकाओं से साफ करें।
- आंत के एक वांछित खंड को अलग करें, जैसे कि फोरगट, मिडगट, या हिंडगट।
- वसा शरीर को अलग करने के लिए, आंत के अलगाव के बाद इसे अन्य ऊतकों से अलग करें।
नोट: पृथक ऊतकों का उपयोग एंटीऑक्सिडेंट और डिटॉक्सिफाइंग एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है (एक उदाहरण: पूरक चित्रा 1), प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मार्ग जीन के विनियमन का विश्लेषण (एक उदाहरण: पूरक चित्रा 2), या कीट आंत सामग्री का मेटाबारकोडिंग, आदि।
6. शवों से सूक्ष्मजीवों का अलगाव
- शवों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक को अलग करने के लिए, ममीकृत कीड़ों को एक बाँझ आर्द्रता कक्ष में रखें।
- 0.4% लैक्टिक एसिड के साथ सबौड डेक्सट्रोज एगर पर चढ़ाना के लिए बीटल की आंतरिक सामग्री से हवाई कोनिडिया (यदि उपलब्ध हो) या स्क्लेरोटिया का उपयोग करें।
नोट: तुरंत चढ़ाना के लिए माइसेलियम और कोनिडिया के साथ बीटल का उपयोग करें (उन्हें आर्द्रता कक्षों में रखे बिना)। - जीवाणु अपघटन के लक्षणों के साथ शवों से बैक्टीरिया को अलग करें।
- एक बीटल के सिर को काट दें, आंतरिक सामग्री को निचोड़ लें, और उन्हें बैक्टीरिया (लुरिया-बर्टानी एगर, एंडो एगर और पित्त एस्कुलिन एगर) के लिए मीडिया पर बाद में चढ़ाना के लिए ट्यूबों में इकट्ठा करें।
नोट: रोगजनकों के जेनेरा और प्रजातियों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोपी और आणविक विधियों का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो अन्य परजीवियों की उपस्थिति के लिए एक विश्लेषण किया जा सकता है।
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Representative Results
सीपीबी के ओवरविंटरिंग पर नीचे दिए गए परिणाम मिट्टी के तापमान, अस्तित्व और संक्रमण दिखाते हैं।
मिट्टी के तापमान की गतिशीलता।
30 सेमी की गहराई पर पिंजरों में शून्य से नीचे का तापमान नवंबर के अंत से अप्रैल की शुरुआत तक दर्ज किया गया था (चित्र 1)। इस अवधि के दौरान औसत तापमान शून्य से 3.3 ± 0.1 डिग्री सेल्सियस (औसत ± मानक त्रुटि) था। फरवरी के मध्य में सबसे कम तापमान शून्य से 7.9 डिग्री सेल्सियस नीचे दर्ज किया गया था।
ओवरविंटरिंग सीपीबी का अस्तित्व।
कीट मृत्यु दर हाइबरनेशन के दौरान देखी गई थी और उद्भव से पहले वसंत में अधिकतम तक पहुंच गई थी। भृंगों की प्रारंभिक संख्या 2000 थी, जिनमें से 1470 व्यक्ति मई के अंत तक बच गए। हाइबरनेशन के दौरान बीटल की जीवित रहने की दर 61% थी (चित्रा 2)।
ओवरविंटरिंग सीपीबी में संक्रमण।
530 मृत भृंगों के विश्लेषण से पता चला है कि हाइबरनेशन अवधि के दौरान, उनमें से 53% में जीवाणु अपघटन के लक्षण थे, और 25% में फंगल संक्रमण के लक्षण थे (चित्रा 3)। एंटोमोपैथोजेनिक कवक की पृथक संस्कृतियों के बीच ब्यूवेरिया का प्रभुत्व (45 आइसोलेट्स) था। मेटारिज़ियम, कॉर्डिसेप्स (= इसारिया), और लेकेनिसिलियम बहुत कम आम थे (प्रत्येक दो आइसोलेट्स)। जीवाणु अपघटन (एन = 30) के लक्षणों के साथ शवों से अलग किए गए बैक्टीरिया में, जेनेरा बैसिलस, स्फिंगोबैक्टीरियम, पेरिबैसिलस, स्यूडोमोनास, सेराटिया, राहनेला और ग्लूटामिसिबैक्टर से संबंधित प्रजातियों की पहचान की गई (पूरक तालिका 1)।
चित्र 1: मिट्टी के तापमान की गतिशीलता। 30 सेमी की गहराई पर स्थापित जलरोधक तापमान डेटा लॉगर द्वारा मापा गया मिट्टी के तापमान की गतिशीलता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: हाइबरनेशन की विभिन्न अवधियों में कोलोराडो आलू बीटल का अस्तित्व। पिंजरों को खोद दिया गया था, और जीवित और मृत भृंगों की गणना नवंबर, जनवरी, अप्रैल और मई में की गई थी। सलाखों जीवित भृंगों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। मूंछें मानक त्रुटि का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: कोलोराडो आलू बीटल कैडेवर में संक्रमण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक सामग्री: कृपया नीचे पूरक फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक चित्र 1. हाइबरनेशन के दौरान सीपीबी के मिडगट में निरर्थक एस्टरेज़ की गतिविधि। मूंछें मानक त्रुटि को दर्शाती हैं। विभिन्न अक्षर समय बिंदुओं (डन का परीक्षण, पी < 0.05) के बीच महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देते हैं।
पूरक चित्रा 2: हाइबरनेशन के दौरान सीपीबी के आंत और वसा शरीर में प्रतिलेखन कारक एनएफकेबी (आईएमडी मार्ग) की अभिव्यक्ति में परिवर्तन। डेटा को अगस्त समय बिंदु के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। आरपी 4, आरपी 18, और एआरएफ 1 9 का उपयोग संदर्भ जीन के रूप में किया गया था। मूंछें मानक त्रुटि दिखाती हैं।
पूरक तालिका 1: हाइबरनेशन के दौरान एक मृत सीपीबी से अलग बैक्टीरिया के 16 एस आरआरएनए (~ 800 बीपी) जीन अनुक्रमों की कथित पहचान।
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Discussion
इस अध्ययन से पता चलता है कि सीपीबी के ओवरविंटरिंग का अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित विधि हमें हाइबरनेशन की विभिन्न अवधियों में पर्याप्त संख्या में कीड़े प्राप्त करने में सक्षम बनाती है। प्रस्तुत तकनीक की सफलता कई स्वतंत्र कारकों पर निर्भर करती है, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण मौसम की स्थिति है। ठंडी, बर्फ रहित सर्दियों में, मिट्टी पिंजरे की पूरी गहराई तक जम सकती है। इस मामले में, सभी भृंगों की मृत्यु काखतरा काफी बढ़ जाता है। बीटल का अस्तित्व कई कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है, जो वर्ष-दर-वर्ष6 में काफी भिन्न हो सकते हैं।
प्रयोग में, सर्दियों के दौरान पिंजरों के अंदर मिट्टी का तापमान शून्य से 7.9 डिग्री सेल्सियस नीचे नहीं गया। 25 सेमी से अधिक गहराई पर कोई बर्फ नहीं देखी गई थी, और मिट्टी सबसे बड़ी शीतलन (जनवरी-फरवरी) की अवधि के दौरान भी ढीली रही। अधिकांश बीटल प्रत्येक पिंजरे के निचले हिस्से में 30-40 सेमी की गहराई पर जमा होते हैं। हो सकता है कि पिंजरों की अधिक गहराई के साथ भृंग गहरे हो गए हों। दूसरी ओर, पिंजरे की गहराई बढ़ने से वजन में वृद्धि होगी, जिससे मिट्टी से पिंजरे को निकालना चुनौतीपूर्ण हो जाएगा, खासकर सर्दियों में। इसके अलावा, अध्ययन के तहत क्षेत्र के आलू के खेतों में हमारे अवलोकनों के अनुसार, सीपीबी ओवरविंटरिंग के लिए 35 सेमी से अधिक गहरा नहीं है। इस खोज को 30-35 सेमी की गहराई पर मिट्टी की मिट्टी की परत द्वारा समझाया जा सकता है, जिसे बीटल दूर नहीं कर सकते हैं। हमारे प्रयोग में, ऊपरी 30 सेमी क्षितिज से रेतीली, दोमट मिट्टी का उपयोग किया गया था। शायद यही कारण है कि बीटल प्राकृतिक परिस्थितियों की तुलना में गहरे बिलों में सक्षम थे। जिस गहराई पर सीपीबी हाइबरनेट होता है वह आमतौर पर 10-25 सेमी (रेफरी 1) होता है, लेकिन यह भौगोलिक क्षेत्रों के बीच भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, पूर्वोत्तर संयुक्त राज्य अमेरिका (न्यू जर्सी) में, अधिकांश बीटल 10-13 सेमी (रेफरी 13) की गहराई पर हाइबरनेट करते हैं। विस्कॉन्सिन, यूएसए 18 में बीटल (≤15 सेमी) की इसी तरह की ओवरविंटरिंग गहराई का दस्तावेजीकरण भी किया गया है। दक्षिणी यूराल (रूस) में, जिस गहराई पर सीपीबी ओवरविंटरिंग के लिए बिलों को दबाता है, वह 5-30 सेमी (रेफरी 20) की सीमा में है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कीटों की जीवित रहने की दर हमेशा ओवरविंटरिंग गहराई1 में वृद्धि के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित नहीं होती है। दरअसल, एस्टोनिया6 में एक क्षेत्र ओवरविंटरिंग प्रयोग में, यह दिखाया गया था कि सीपीबी की जीवित रहने की दर 50 सेमी की गहराई की तुलना में 30 सेमी की गहराई पर अधिक थी। उन लेखकों का प्रस्ताव है कि यह खोज ऑक्सीजन की कमी के कारण हो सकती है। इसी तरह के डेटा विस्कॉन्सिन, यूएसए18 में एक क्षेत्र प्रयोग में प्राप्त किए गए थे: ओवरविंटरिंग सीपीबी की उच्चतम जीवित रहने की दर (51.5%) 15-25 सेमी की गहराई पर दर्ज की गई थी। उसी समय बीटल की18, 100% मृत्यु दर 25-35 सेमी की गहराई पर नोट की गई थी। हमारा मानना है कि समशीतोष्ण क्षेत्र में प्रयोगों के लिए 40 सेमी की गहराई पर्याप्त है क्योंकि जीवित बीटल का प्रतिशत अधिक था, और मिट्टी की ठंड पिंजरे की पूरी गहराई तक नहीं फैली थी। बर्फ के आवरण की उपस्थिति मिट्टी के कम ठंडा होने में योगदान देती है। यदि आवश्यक हो, तो पिंजरों की सतह के ऊपर बर्फ के आवरण की मोटाई को समायोजित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण बिंदु संग्रहीत पोषक तत्वों की एक छोटी मात्रा के कारण ओवरविंटरिंग के लिए सीपीबी की संभावित अपर्याप्त तत्परता है। कुछ वयस्क सीपीबी मिट्टी में भृंगों के बड़े पैमाने पर बिलों के बाद मिट्टी की सतह पर बने रहे। यह संभव है कि उन्होंने पर्याप्त वसा संग्रहीत नहीं की क्योंकि ओवरविंटरिंग की सफलता संचित पोषक तत्वों की मात्रा पर भी निर्भर करतीहै21. इसके अतिरिक्त, जब सर्दियों में मिट्टी से पिंजरों को हटा दिया गया था, तो कुछ बीटल मिट्टी की सतह पर या निकट-सतह परत में जमे हुए अवस्था में थे। शायद ये बीटल थे जिनके पास कुपोषण, संक्रमण या अन्य हानिकारक कारकों के कारण बिलों के लिए पर्याप्त ऊर्जा नहीं थी। लाशोम्ब एट अल.13 ने सीपीबी ओवरविंटरिंग के साथ प्रयोगों में उल्लेख किया कि ~ 15 % वयस्कों ने ओवरविंटरिंग के लिए मिट्टी में नहीं डूबा था। उन लेखकों ने कारणों पर चर्चा नहीं की। किसी भी मामले में, बीटल को पर्याप्त भोजन प्रदान करना आवश्यक है।
एक अध्ययन के उद्देश्यों के आधार पर, मिट्टी से एकत्र होने के बाद बीटल को हाइबरनेशन स्थिति में रखना आवश्यक हो सकता है। इसके लिए, प्रयोगशाला का तापमान ठंडा होना चाहिए, और मिट्टी से निष्कर्षण के बाद बीटल को तुरंत 0-2 डिग्री सेल्सियस की स्थिति में रखा जाना चाहिए। यह हमारे काम में देखा गया था कि शरद ऋतु और वसंत में, सीपीबी मिट्टी से खुदाई के बाद लगभग तुरंत लोकोमोटर गतिविधि शुरू करते हैं; यह प्रक्रिया सर्दियों के बीच में बहुत धीरे-धीरे होती है।
इस अध्ययन ने सक्रिय रूप से एंटोमोपैथोजेन्स और पैरासाइटोइड्स को स्थानांतरित करने पर ध्यान नहीं दिया। हमने सीपीबी के प्रसार के खिलाफ एक अतिरिक्त बाधा के रूप में एक जियोटेक्सटाइल का उपयोग किया। ध्यान दें कि सक्रिय रूप से चलने वाले एंटोमोपैथोजेन्स (जैसे, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड), शिकारियों, या पैरासाइटोइड्स पर अनुसंधान में एक जियोटेक्सटाइल का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह इसके माध्यम से उनके आंदोलन को बाधित करेगा।
यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि सीपीबी की प्रतिरक्षा और रोगों पर अध्ययन ज्यादातर सक्रिय भोजन चरणों के दौरान आयोजित किए जाते हैं। आराम के चरणों की कम जांच की जाती है और मुख्य रूप से प्रयोगशाला स्थितियों के तहत जांच की गई है। इन परिस्थितियों में, हालांकि, प्राकृतिक प्रजनन स्थलों पर होने वाले तापमान, आर्द्रता और वातन के उतार-चढ़ाव का अनुकरण करना मुश्किल है। इस प्रकार, क्षेत्र प्रयोग बेहतर हैं22. विभिन्न हाइबरनेशन अवधियों में खेत में सीपीबी सर्दियों की मृत्यु दर के कारणों को निर्धारित करने के लिए, मिट्टी से ओवरविंटरिंग बीटल की खुदाई करना आवश्यक है। प्राकृतिक परिस्थितियों में सीपीबी ओवरविंटरिंग पर अध्ययन 1970-1980 के दशक में सक्रिय रूप से आयोजित किए गए थे। उन पत्रों में वर्णित विधियों में मुख्य रूप से वसंत13 में उभरने वाले व्यक्तियों को इकट्ठा करना और गिनना, एंटोमोपैथोजेनिक कवक14,15,16 या एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड 15 का उपयोग करने की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करना और प्राकृतिक सर्दियोंकी मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए वसंत और शरद ऋतु में मिट्टी से ओवरविंटरिंग बीटल एकत्र करना शामिल है।. उसी समय, उन प्रयोगों में उपयोग किए गए पिंजरों के आकार और आकार 20×20 सेमी से 90×90×90 सेमी (रेफरी .13) या 180×60×30 सेमी (रेफरी .18) तक भिन्न थे। यह बताया जाना चाहिए कि उपरोक्त अध्ययनों का उद्देश्य सर्दियों में कीड़ों को इकट्ठा करने की संभावना के साथ सीपीबी ओवरविंटरिंग के लिए कार्यप्रणाली विकसित करना नहीं था। मौजूदा तरीकों के विपरीत, इस लेख में वर्णित तकनीक बर्फ की अवधि में प्राकृतिक सीपीबी आबादी की जांच करना संभव बनाती है।
निष्कर्ष में, प्रस्तावित विधि शोधकर्ताओं को कीड़ों की अपेक्षाकृत कम मृत्यु दर और कम लागत के साथ प्राकृतिक परिस्थितियों में ओवरविंटरिंग सीपीबी व्यक्तियों की वांछित संख्या प्राप्त करने में सक्षम बनाती है। सीपीबी हाइबरनेशन के विभिन्न पहलुओं की जांच बुनियादी-अनुसंधान और लागू दोनों दृष्टिकोणों से आवश्यक है: इस कीट के नियंत्रण के दृष्टिकोण में सुधार के लिए। इस तकनीक को मिट्टी में ओवरविंटरिंग करने वाली अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। भविष्य के शोधकर्ता इस विधि को सामान्य शरीर विज्ञान और जैव रसायन का अध्ययन करने के लिए लागू कर सकते हैं - जिसमें विभिन्न कीट प्रजातियों के ओवरविंटरिंग चरणों की प्रतिरक्षा शामिल है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग उनकी सर्दियों की मृत्यु दर के आधार पर रुचि के कीटों की बहुतायत की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
हम अपने सहयोगियों व्लादिमीर शिलो, वेरा मोरोज़ोव, उल्याना रोट्स्काया, ओल्गा पोलेनोगोवा, और ओक्साना टोमिलोवा को क्षेत्र और प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के आयोजन और निष्पादन में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं।
अनुसंधान रूसी विज्ञान फाउंडेशन, परियोजना संख्या 22-14-00309 द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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