Summary
Здесь мы представляем метод изучения зимней спячки колорадского жука в естественных условиях умеренного пояса, а также методику сбора жуков в зимний период. Этот метод позволяет получить нужное количество зимующих особей для различных анализов на любой стадии зимовки.
Abstract
Одним из основных вредителей картофеля Solanum tuberosum L. в умеренном поясе является насекомое колорадский жук (CPB). Большинство исследований иммунитета и заболеваний КПБ проводятся во время активных фаз кормления. Тем не менее, исследований стадий покоя меньше, хотя большую часть своего жизненного цикла эти жуки проводят в состоянии зимней диапаузы (спячки). В данной работе был разработан и апробирован метод исследования зимней спячки CPB в естественных условиях, дающий возможность собирать достаточное количество особей в зимний период. В данной статье была проведена оценка выживаемости при СЛБ, а также выявлены инфекционные агенты на разных стадиях спячки. Смертность КПБ увеличивалась во время зимней спячки, достигая максимума в апреле-мае. Из мертвых насекомых выделяли энтомопатогенные грибы (Beauveria, Isaria, Lecanicillium) и бактерии Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas и Serratia . Выживаемость жуков за весь период зимней спячки составила 61%. Замерзших или высохших жуков обнаружено не было, что свидетельствует об успешности представленного способа.
Introduction
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) является важным вредителем пасленовых растений, преимущественно картофеля Solanum tuberosum L. Ареал этого вида составляет более 16 млн.км2 и постояннорасширяется1. У ЦПБ факультативная зимняя диапауза, а зимняя спячка обязательна в умеренном поясе. Диапауза индуцируется фотопериодом короткого дня и модулируется температурой1. Зимуют эти жуки во взрослой стадии, закапываясь в почву. С увеличением широт продолжительность периода спячки увеличивается. В умеренном поясе, особенно на северных территориях ареала, зимовка длится до 9 месяцев: с августа-сентября по май-июнь (Носков и др., личные наблюдения). В этот период КПБ, как и любое другое насекомое умеренного пояса, подвергается воздействию неблагоприятных зимних условий и должен повысить свою холодостойкость. В то же время контакт жуков с почвой повышает риск заражения различными условно-патогенными микроорганизмами2. Поэтому этим жукам необходимо поддерживать определенный уровень активности иммунной системы во время зимней спячки, что также является энергетически затратным. Тем не менее, даже если насекомое переживет инфекцию, болезнь может снизить его морозостойкость3. Следует отметить, что низкая температура – не единственная причина зимней смертности ЦПБ. Немаловажную роль играет и недостаток кислорода, а при некоторых условиях он может быть основным фактором зимней смертности 4,5.
Известно, что естественная зимняя смертность ЦПБ может быть очень высокой, достигая 100% на глинистых суглинистых почвах6. Таким образом, перезимовка является одним из самых ответственных периодов в жизненном цикле ЦПБ. Тем не менее, данные о физиологии, активности иммунной системы, выживаемости и других параметрах спячки КПБ в естественных условиях все еще ограничены. Имеются исследования дифференциальной экспрессии генов и различных физиологических параметров у взрослых с СЛБ в период диапаузы и в ответ на холодовой шок 7,8,9,10,11,12; Тем не менее, эти анализы в основном проводились путем индукции диапаузы или холодового стресса в лабораторных условиях без естественных колебаний температуры, влажности и нативной патогенной нагрузки. Тем не менее, исследования физиологии этих жуков, собранных при выкапывании из почвы в естественных условиях, являются важными. В 1970-1980-е гг. активно изучались различные аспекты зимовки ЦПБ в естественных условиях 13,14,15,16,17,18. С другой стороны, эти исследования не предполагали выемки КПБ из почвы в зимний период. Кроме того, подробно не приведена методика контролируемой спячки КПБ и описание клеток. Таким образом, необходимо изучение физиологии зимовки КПБ в естественных условиях19.
Целью данного исследования являлась разработка и апробация метода контролируемой спячки взрослых особей КПБ в естественных условиях. Предложенный метод позволяет получить желаемое количество особей КПБ для микробиологических, иммунологических и других исследований в период зимней спячки в полевых условиях континентального климата. Этот метод может быть адаптирован и применен к другим видам насекомых, зимующих в почве под снегом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Описание клеток для зимней спячки
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента количество клеток варьируется. Используйте не менее трех клеток на одну дату отбора проб. Чтобы оценить количество жуков, которые всплывут, подготовьте не менее трех дополнительных клеток, которые не будут извлечены из почвы до весны.
- Используйте клетки из жесткого деревянного каркаса размером 25 × 25 × 40 см (Д × Ш × В).
- Чтобы соорудить каркас для клетки, используйте деревянные рейки толщиной не менее 2 см и шириной 4 см.
- Накройте внутреннюю часть клетки сеткой из нержавеющей стали, имеющей размер отверстий не более 5 мм × 3 мм. Используйте степлер по дереву, чтобы закрепить сетку.
- Закрепите сетку из нержавеющей стали с внешней стороны дна степлером.
- Выстелите внутреннюю часть клетки черным синтетическим геотекстилем плотностью 60 г/м2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Геотекстиль служит дополнительным барьером для предотвращения побега жуков. Не используйте его в экспериментах, связанных с активно движущимися энтомопатогенами и паразитоидами. - Плотно прикрепите к верхней части клетки трубку из синтетической полупрозрачной дышащей ткани высотой примерно 60 см.
- Скрестите и закрепите две прочные веревки на дне клетки, чтобы при необходимости вытащить ее из почвы.
2. Установка клеток
- Выкопайте яму глубиной 40 см в почве и поместите внутрь клетку.
- На лунку постелите сухую траву или сено.
- Поместите клетку внутрь так, чтобы сено или сухая трава оказались между стенками клетки и почвой.
- Засыпьте клетки грунтом с того же картофельного поля, где собраны насекомые.
- Установите водонепроницаемые регистраторы данных температуры и влажности в клетках на необходимой глубине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать регистраторы данных любого производителя, которые должны работать при низких температурах. - Сажайте рассаду картофеля в каждую клетку за 3-4 недели до появления жуков и умеренно поливайте.
- Закрепите трубку из синтетической ткани вертикально к палке из любого материала, установленной с внешней стороны клетки.
3. Выращивание насекомых перед зимовкой
- Вручную собирайте взрослых жуков на картофельных полях, свободных от пестицидов, ближе к концу вегетации картофеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые жуки существенно отличаются от личинок и характеризуются полосатыми надкрыльями, тогда как личинки красные. - Собранных жуков держать в пластиковых ведрах объемом 15-20 л (максимум 200 особей в ведре) с картофельной ботвой для кормления насекомых перед помещением в клетки.
- Накройте ведра дышащей тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите насекомых в ведрах более 12 часов. Используйте достаточно крупную картофельную ботву, чтобы предотвратить скопление жуков на дне ведер. - На картофельные растения, покрытые синтетической тканевой сеткой, размещают не более 200 особей CPB.
- Когда картофельная ботва будет съедена, добавьте свежую, помещенную в пластиковую банку с водой, и после этого ежедневно меняйте картофельную ботву.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы зафиксировать стебли в банке, используйте вату и парапленку. Тщательно проверяйте старые стебли на наличие жуков при их удалении. - Как только все жуки зарылись в почву на зимовку, отвяжите трубку из синтетической ткани от палки и уложите ткань вниз.
4. Сбор насекомых в зимний период
- Убирайте снег над поверхностью клетки.
- Разрыхлите клетку с каждой стороны сильной лопатой.
- Вытащите клетку из почвы с помощью веревок.
- Принесите клетку в лабораторию.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента, зимующие жуки, возможно, должны быть неактивны до проведения анализа. При этом температура в лаборатории при изоляции жуков от почвы должна быть ~2-5 °С. - Вынимайте грунт из ящика небольшими порциями, аккуратно разбивайте крупные куски почвы и изолируйте жуков с помощью пинцета.
- Отделите живых жуков от трупов. Живые здоровые жуки создают вокруг себя плотную почву, образуя воздушную полость (так называемую колыбель), и поэтому легко отделяются от почвы. Жуки, убитые грибами, мумифицируются или имеют видимый мицелий на поверхности. Бактерионно разлагающиеся насекомые имеют темный цвет.
- Просейте почву через сито, чтобы убедиться, что все жуки изолированы и не повреждены.
- Трупы с симптомами грибковой инфекции или бактериального разложения помещают в индивидуальную стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл для последующей идентификации.
- Хранят живых жуков в холодильнике при температуре 0-2 °С до анализа в закрыто-вентилируемой таре, содержащей влажный ватный тампон.
5. Подготовка образцов органов и тканей
- Для сбора гемолимфы делают прокол в боковой части живота под надкрыльями с помощью инсулиновой иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время зимовки количество гемолимфы значительно уменьшается, что затрудняет сбор этой жидкости. - Чтобы изолировать кишечник, отрежьте головную капсулу, выдавите все содержимое в чашку Петри с фосфатным буфером, отделите кишечник и очистите его от жира и мальпигиевых сосудов.
- Отделите нужный отдел кишечника, например переднюю, среднюю или заднюю кишку.
- Чтобы изолировать жировое тело, отделите его от других тканей после выделения кишечника.
Примечание: Изолированные ткани могут быть использованы для измерения активности антиоксидантных и детоксикационных ферментов (пример: дополнительный рисунок 1), анализа регуляции генов иммунного сигнального пути (пример: дополнительный рисунок 2) или метабаркодирования содержимого кишечника насекомых и т. д.
6. Выделение микроорганизмов из трупов
- Чтобы изолировать энтомопатогенные грибы от трупов, мумифицированных насекомых поместили в стерильную камеру влажности.
- Используйте воздушные конидии (при наличии) или склероции из внутреннего содержимого жуков для покрытия на декстрозном агаре Сабуро с 0,4% молочной кислотой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте жуков с мицелием и конидиями для покрытия сразу (не помещая их во влажные камеры). - Выделите бактерии из трупов с симптомами бактериального разложения.
- У жука отрезают голову, выдавливают внутреннее содержимое и собирают в пробирки для последующего нанесения на среды для бактерий (агар Лурии-Бертани, эндоагар и желчный эскулиновый агар).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроскопию и молекулярные методы для определения родов и видов патогенов. При необходимости может быть проведен анализ на наличие других паразитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Приведенные ниже результаты по зимующим КПБ показывают температуру почвы, выживаемость и инфекции.
Динамика температуры почвы.
Отрицательные температуры в садках на глубине 30 см регистрировались с конца ноября до начала апреля (рис. 1). Средняя температура за этот период составила минус 3,3 ± 0,1 °С (средняя ± стандартной ошибки). Самая низкая зарегистрированная температура составила минус 7,9 °C в середине февраля.
Выживаемость зимующих ЦПБ.
Смертность насекомых наблюдалась во время зимней спячки и достигала максимума весной перед выходом на поверхность. Первоначальная численность жуков составляла 2000 особей, из которых к концу мая выжило 1470 особей. Выживаемость жуков во время зимней спячки составила 61% (рис. 2).
Инфекции у зимующих КПБ.
Анализ 530 мертвых жуков показал, что в период спячки у 53% из них наблюдались симптомы бактериального разложения, а у 25% — симптомы грибковых инфекций (рис. 3). Среди выделенных культур энтомопатогенных грибов доминировала боверия (45 изолятов). Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) и Lecanicillium встречались гораздо реже (по два изолята). Среди бактерий, выделенных из трупов с симптомами бактериального разложения (n = 30), были идентифицированы виды, принадлежащие к родам Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella и Glutamicibacter (дополнительная табл. 1).
Рисунок 1: Динамика температуры почвы. Динамика температуры почвы, измеренная водонепроницаемым регистратором данных температуры, установленным на глубине 30 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выживаемость зимующих колорадских жуков в разные периоды спячки. Клетки выкапывали, а выживших и мертвых жуков подсчитывали в ноябре, январе, апреле и мае. Столбиками обозначено количество выживших жуков. Усы указывают на стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Инфекции у зимующих трупов колорадского жука. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные материалы: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить следующие дополнительные файлы.
Дополнительный рисунок 1. Активность неспецифических эстераз в средней кишке ЦПБ в период спячки. Усы обозначают стандартную ошибку. Разные буквы указывают на существенные различия между временными точками (критерий Данна, P < 0,05).
Дополнительный рисунок 2: Изменения экспрессии транскрипционного фактора NFkB (путь IMD) в кишечнике и жировом теле CPB во время спячки. Данные представлены в виде изменений свертки относительно момента времени августа. В качестве референсных генов использовали Rp4, Rp18 и Arf19 . Усы показывают стандартную ошибку.
Дополнительная таблица 1: Предполагаемая идентификация последовательностей генов 16S рРНК (~800.н.) бактерий, выделенных из мертвого CPB во время спячки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проведенное исследование показывает, что предложенный метод изучения зимовки ЦПБ позволяет получить достаточное количество насекомых в разные периоды спячки. Успех представленной техники зависит от нескольких независимых факторов, важнейшим из которых являются погодные условия. В холодную бесснежную зиму почва может промерзнуть на всю глубину клетки. В этом случае риск гибели всех жуков значительно возрастает18. Выживаемость жука зависит от совокупности многих факторов, которые могут значительно меняться от годак году.
В эксперименте температура почвы внутри клеток зимой не опускалась ниже минус 7,9 °С. На глубине более 25 см льда не наблюдалось, а почва оставалась рыхлой даже в период наибольшего похолодания (январь-февраль). Большинство жуков скапливалось в нижней части каждой клетки, на глубине 30-40 см. Жуки могли зарываться глубже с большей глубиной клеток. С другой стороны, увеличение глубины клетки приведет к увеличению веса, что затруднит извлечение клетки из почвы, особенно зимой. Более того, по нашим наблюдениям, на картофельных полях исследуемого региона КПБ не зарывается на зимовку глубже 35 см. Эту находку можно объяснить глинистым слоем почвы на глубине 30-35 см, который жуки не могут преодолеть. В нашем опыте использовалась песчаная, суглинистая почва с верхнего горизонта 30 см. Вероятно, именно поэтому жуки смогли зарываться глубже, чем в естественных условиях. Глубина, на которой CPB впадает в спячку, обычно составляет 10-25 см (ссылка 1), но она может варьироваться в зависимости от географического региона. Например, на северо-востоке США (штат Нью-Джерси) большая часть жуков зимует на глубине 10-13 см (ссылка 13). Аналогичная глубина зимовки жуков (≤15 см) также была задокументирована в Висконсине,США 18. На Южном Урале (Россия) глубина, на которой ЦПБ зарывается на зимовку, находится в пределах 5-30 см (ссылка 20). Следует отметить, что выживаемость насекомых не всегда положительно коррелирует с увеличением глубины зимовки1. Действительно, в полевом эксперименте по зимовке в Эстонии6 было показано, что выживаемость КПБ была выше на глубине 30 см, чем на глубине 50 см. Эти авторы предполагают, что это открытие может быть связано с недостатком кислорода. Аналогичные данные были получены в полевом эксперименте в штате Висконсин, США18: самая высокая выживаемость (51,5%) зимующих КПБ была зафиксирована на глубине 15-25 см. При этом на глубине 25-35 см отмечалась18, 100% гибель жука. Мы считаем, что глубины в 40 см достаточно для экспериментов в умеренном поясе, потому что процент выживших жуков был высок, а промерзание почвы не распространялось на всю глубину клетки. Наличие снежного покрова способствует меньшему охлаждению почвы. При необходимости толщину снежного покрова над поверхностью клеток можно регулировать.
Еще одним ключевым моментом в протоколе является возможная недостаточная готовность ЦПБ к зимовке из-за малого количества запасенных питательных веществ. Часть взрослых особей КПБ осталась на поверхности почвы после массового закапывания жуков в почву. Возможно, что они не накопили достаточного количества жира, потому что успех перезимовки зависит также от количества накопленных питательных веществ21. Кроме того, когда клетки извлекали из почвы зимой, часть жуков находилась в замороженном состоянии на поверхности почвы или в приповерхностном слое. Возможно, это были жуки, которым не хватило энергии, чтобы зарыться в нору из-за недоедания, инфекций или других повреждающих факторов. Lashomb et al.13 отметили в экспериментах с перезимовкой CPB, что ~15% взрослых особей не закапывались в почву для зимовки. Эти авторы не обсуждали причины. В любом случае необходимо обеспечить жуков достаточным количеством пищи.
В зависимости от целей исследования, может потребоваться содержание жуков в состоянии спячки после того, как они будут собраны из почвы. Для этого лабораторная температура должна быть прохладной, а жуков сразу после извлечения из почвы помещать в условия 0-2 °С. В нашей работе было замечено, что осенью и весной КПБ почти сразу после выемки из почвы начинают двигательную активность; В середине зимы этот процесс протекает гораздо медленнее.
В данном исследовании не учитывались активно движущиеся энтомопатогены и паразитоиды. В качестве дополнительного барьера против распространения ЦПБ мы использовали геотекстиль. Обратите внимание, что геотекстиль не следует использовать в исследованиях активно движущихся энтомопатогенов (например, энтомопатогенных нематод), хищников или паразитоидов, поскольку он будет препятствовать их передвижению через него.
Важно отметить, что исследования иммунитета и заболеваний КПБ в основном проводятся во время активных фаз кормления. Стадии покоя менее изучены и исследованы в основном в лабораторных условиях. Однако в этих условиях трудно смоделировать колебания температуры, влажности и аэрации, которые происходят в естественных местах размножения. Таким образом, предпочтительны полевые опыты22. Для определения причин зимней гибели КПБ в полевых условиях в разные периоды спячки необходимо выкапывать из почвы зимующих жуков. В 1970-1980-е гг. активно велись исследования по зимовке ЦПБ в естественных условиях. Методы, описанные в этих работах, в основном заключаются в сборе и подсчете особей, появившихся весной 13, оценке эффективности использования энтомопатогенных грибов 14,15,16 или энтомопатогенных нематод 15 перед зимовкой и сборе зимующих жуков из почвы весной и осенью для определения естественной зимней гибели 17. При этом размеры и формы клеток, использованных в этих экспериментах, варьировались от 20×20 см до 90×90×90 см (ссылка 13) или 180×60×30 см (ссылка 18). Следует отметить, что вышеупомянутые исследования не были направлены на разработку методики зимовки КПБ с возможностью сбора насекомых в зимний период. В отличие от существующих методов, методика, описанная в данной статье, позволяет исследовать естественные популяции КПБ в снежный период.
В заключение можно сказать, что предложенный метод позволяет исследователям получить нужное количество зимующих особей КПБ в естественных условиях с относительно низкой смертностью насекомых и при небольших затратах. Изучение различных аспектов зимней спячки КПБ необходимо как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения: для совершенствования подходов к борьбе с этим вредителем. Этот метод может быть адаптирован к другим видам насекомых, зимующих в почве. Будущие исследователи могут применить этот метод для изучения общей физиологии и биохимии, в том числе иммунитета зимующих фаз различных видов насекомых. Кроме того, этот метод может быть использован для прогнозирования численности интересующих вредителей, исходя из их зимней гибкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Благодарим наших коллег Владимира Шило, Веру Морозову, Ульяну Роцкую, Ольгу Поленогову и Оксану Томилову за помощь в организации и проведении полевых и лабораторных процедур.
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, проект No 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
