Summary
Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Winterschlafs des Kartoffelkäfers unter den natürlichen Bedingungen der gemäßigten Zone sowie eine Technik zum Sammeln von Käfern im Winter vor. Diese Methode ermöglicht es, eine gewünschte Anzahl von überwinternden Individuen für verschiedene Analysen in jedem Stadium des Winterschlafs zu erhalten.
Abstract
Einer der Hauptschädlinge der Kartoffel Solanum tuberosum L. in der gemäßigten Zone ist das Schadinsfest Kartoffelkäfer (CPB). Die meisten Studien zur Immunität und zu Erkrankungen des CPB werden während der aktiven Fütterungsphasen durchgeführt. Dennoch gibt es weniger Studien zu Ruhestadien, obwohl diese Käfer den größten Teil ihres Lebenszyklus in einem Zustand der Winterpause (Winterschlaf) verbringen. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Untersuchung des CPB-Winterschlafs unter natürlichen Bedingungen entwickelt und getestet, die die Möglichkeit bietet, eine ausreichende Anzahl von Individuen im Winter zu sammeln. In diesem Artikel wurde das CPB-Überleben bewertet und Infektionserreger in verschiedenen Stadien des Winterschlafs identifiziert. Die CPB-Mortalität stieg während des Winterschlafs an und erreichte im April-Mai ein Maximum. Aus den toten Insekten wurden entomopathogene Pilze (Beauveria, Isaria und Lecanicillium) und die Bakterien Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas und Serratia isoliert. Die Überlebensrate der Käfer über den gesamten Winterschlaf lag bei 61%. Es wurden keine gefrorenen oder getrockneten Käfer gefunden, was auf den Erfolg der vorgestellten Methode hindeutet.
Introduction
Der Kartoffelkäfer Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) ist ein wichtiger Schädling von Solanaceae-Pflanzen, vorwiegend Kartoffel Solanum tuberosum L. Das geografische Verbreitungsgebiet dieser Art beträgt mehr als 16 Millionenkm2 und erweitert sich ständig1. Das CPB hat fakultative Winterdiapause, und in der gemäßigten Zone ist der Winterschlaf obligatorisch. Die Diapause wird durch eine kurztägige Photoperiode induziert und durch Temperatur1 moduliert. Diese Käfer überwintern im erwachsenen Stadium, indem sie sich in den Boden eingraben. Mit zunehmenden Breitengraden verlängert sich die Dauer des Winterschlafs. In der gemäßigten Zone, vor allem in den nördlichen Territorien ihres Verbreitungsgebietes, dauert die Überwinterung bis zu 9 Monate: von August-September bis Mai-Juni (Noskov et al., persönliche Beobachtungen). In dieser Zeit ist das CPB – wie jedes andere Insekt in der gemäßigten Zone auch – ungünstigen Winterbedingungen ausgesetzt und muss seine Kältetoleranz erhöhen. Gleichzeitig erhöht der Kontakt der Käfer mit dem Boden das Risiko einer Infektion durch verschiedene opportunistische und pathogene Mikroorganismen2. Daher müssen diese Käfer während des Winterschlafs ein gewisses Maß an Aktivität des Immunsystems aufrechterhalten, was auch energetisch kostspielig ist. Doch selbst wenn das Insekt eine Infektion überlebt, kann die Krankheit seine Kältehärte verringern3. Es sollte beachtet werden, dass niedrige Temperaturen nicht der einzige Grund für die Wintersterblichkeit des CPB sind. Eine wichtige Rolle spielt auch der Sauerstoffmangel, der unter bestimmten Bedingungen der Hauptfaktor für die Wintersterblichkeit seinkönnte 4,5.
Es ist bekannt, dass die natürliche Wintersterblichkeit des CPB sehr hoch sein kann und in tonigen Lehmböden 100 % erreicht6. Daher ist die Überwinterung eine der wichtigsten Phasen im CPB-Lebenszyklus. Dennoch sind die Daten über die Physiologie, die Aktivität des Immunsystems, das Überleben und andere Parameter des CPB-Winterschlafs unter natürlichen Bedingungen noch begrenzt. Es gibt Studien zur differentiellen Genexpression und verschiedenen physiologischen Parametern bei CPB-Erwachsenen während der Diapause und als Reaktion auf einen Kälteschock 7,8,9,10,11,12; Diese Analysen wurden jedoch hauptsächlich durch Induktion von Diapause oder Kältestress unter Laborbedingungen ohne natürliche Schwankungen von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und nativer Erregerlast durchgeführt. Nichtsdestotrotz ist die Erforschung der Physiologie dieser Käfer, die durch Ausgrabung aus dem Boden unter natürlichen Bedingungen gesammelt wurden, wichtig. In den 1970er bis 1980er Jahren wurden verschiedene Aspekte der CPB-Überwinterung unter natürlichen Bedingungen aktiv untersucht 13,14,15,16,17,18. Andererseits wurde in diesen Studien kein CPB-Aushub aus dem Boden im Winter durchgeführt. Darüber hinaus werden eine Technik zur kontrollierten Überwinterung des CPB und eine Beschreibung der Käfige nicht im Detail bereitgestellt. Daher ist es notwendig, die Physiologie von CPBs zu untersuchen, die in natürlichen Umgebungen überwintern19.
Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur kontrollierten Überwinterung von CPB-Erwachsenen unter natürlichen Bedingungen zu entwickeln und zu testen. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht es, eine gewünschte Anzahl von CPB-Individuen für mikrobiologische, immunologische und andere Assays während des Winterschlafs unter Feldbedingungen eines kontinentalen Klimas zu erhalten. Diese Methode kann angepasst und auf andere Insektenarten angewendet werden, die in Böden unter Schnee überwintern.
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Protocol
1. Beschreibung der Käfige für den Winterschlaf
HINWEIS: Je nach Ziel des Experiments variiert die Anzahl der Käfige. Verwenden Sie mindestens drei Käfige pro Probenahmedatum. Um die Anzahl der Käfer abzuschätzen, die schlüpfen werden, bereiten Sie mindestens drei zusätzliche Käfige vor, die erst im Frühjahr aus dem Boden geholt werden.
- Verwenden Sie Käfige aus einem starren Holzrahmen mit einer Größe von 25 × 25 × 40 cm (L × B × H).
- Um einen Rahmen für den Käfig zu bauen, verwenden Sie Holzlatten, die mindestens 2 cm dick und 4 cm breit sind.
- Das Innere des Käfigs wird mit einem Edelstahlgitter mit einer Öffnungsgröße von nicht mehr als 5 mm × 3 mm abgedeckt. Verwende einen Holzhefter, um das Netz zu fixieren.
- Befestigen Sie das Edelstahlgitter mit dem Hefter an der Außenseite des Bodens.
- Die Innenseite des Käfigs mit einem schwarzen synthetischen Geotextil mit einer Dichte von 60 g/m2 auskleiden.
HINWEIS: Das Geotextil dient als zusätzliche Barriere, um das Entweichen der Käfer zu verhindern. Verwenden Sie es nicht in Experimenten, die sich auf aktiv bewegende Entomopathogene und Parasitoide beziehen. - Befestigen Sie einen ca. 60 cm hohen Schlauch aus synthetischem, durchscheinendem, atmungsaktivem Stoff fest an der Oberseite des Käfigs.
- Kreuzen Sie zwei starke Seile und befestigen Sie sie am Boden des Käfigs, um ihn bei Bedarf aus dem Boden zu ziehen.
2. Einbau der Käfige
- Graben Sie ein 40 cm tiefes Loch in die Erde und stellen Sie den Käfig hinein.
- Lege trockenes Gras oder Heu auf das Loch.
- Stellen Sie den Käfig so hinein, dass sich das Heu oder das trockene Gras zwischen den Wänden des Käfigs und der Erde befindet.
- Füllen Sie die Käfige mit Erde aus demselben Kartoffelfeld, auf dem die Insekten gesammelt werden.
- Installieren Sie wasserdichte Temperatur- und Feuchtigkeits-Datenlogger in den Käfigen in den erforderlichen Tiefen.
HINWEIS: Datenlogger beliebiger Hersteller können verwendet werden und müssen bei niedrigen Temperaturen betrieben werden können. - Pflanzen Sie die Kartoffelsetzlinge 3-4 Wochen vor der Einführung der Käfer in jeden Käfig und gießen Sie sie mäßig.
- Befestigen Sie einen Schlauch aus synthetischem Gewebe senkrecht an einem Stab aus einem beliebigen Material, der an der Außenseite des Käfigs angebracht ist.
3. Aufzucht von Insekten vor der Überwinterung
- Sammeln Sie erwachsene Käfer gegen Ende der Kartoffelvegetation manuell auf pestizidfreien Kartoffelfeldern.
HINWEIS: Ausgewachsene Käfer unterscheiden sich wesentlich von Larven und zeichnen sich durch gestreifte Flügeldecken aus, während die Larven rot sind. - Bewahren Sie die gesammelten Käfer in 15-20 l Plastikeimern (max. 200 Individuen pro Eimer) mit Kartoffelspitzen auf, um die Insekten zu füttern, bevor Sie sie in die Käfige setzen.
- Decken Sie die Eimer mit atmungsaktivem Stoff ab.
HINWEIS: Halten Sie Insekten nicht länger als 12 Stunden in Eimern. Verwenden Sie Kartoffelspitzen, die groß genug sind, um die Ansammlung von Käfern am Boden der Eimer zu verhindern. - Setzen Sie nicht mehr als 200 CPB-Individuen auf die Kartoffelpflanzen, die mit dem synthetischen Gewebe abgedeckt sind.
- Wenn die Kartoffelspitzen verzehrt sind, geben Sie frische Kartoffeln in ein Plastikglas mit Wasser und wechseln Sie die Kartoffelspitzen danach täglich.
HINWEIS: Um Stiele in einem Glas zu fixieren, verwenden Sie Watte und Parafilm. Kontrollieren Sie alte Stängel sorgfältig auf die Käfer, wenn Sie sie entfernen. - Sobald alle Käfer zum Überwintern in die Erde eingegraben sind, lösen Sie den Schlauch mit dem synthetischen Stoff vom Stock und legen Sie den Stoff ab.
4. Sammeln von Insekten während der Wintersaison
- Entfernen Sie den Schnee über der Oberfläche des Käfigs.
- Lockern Sie den Käfig auf jeder Seite mit einer starken Schaufel.
- Ziehe den Käfig mit den Seilen aus der Erde.
- Bringen Sie den Käfig ins Labor.
HINWEIS: Abhängig von den Zielen des Experiments müssen überwinternde Käfer vor der Analyse inaktiv sein. In diesem Fall sollte die Temperatur im Labor während der Isolierung der Käfer aus dem Boden ~2-5 °C betragen. - Entferne die Erde in kleinen Portionen aus der Box, zerkleinere vorsichtig große Erdstücke und isoliere Käfer mit einer Pinzette.
- Trennen Sie lebende Käfer von Kadavern. Lebende, gesunde Käfer bilden einen kompakten Boden um sich herum, bilden einen Lufthohlraum (eine sogenannte Wiege) und lassen sich daher leicht vom Boden trennen. Käfer, die von Pilzen getötet wurden, sind mumifiziert oder haben sichtbares Myzel auf der Oberfläche. Bakteriell zersetzende Insekten sind dunkel.
- Siebe die Erde durch ein Sieb, um sicherzustellen, dass alle Käfer isoliert und nicht beschädigt sind.
- Leichen mit Symptomen einer Pilzinfektion oder bakterieller Zersetzung zur späteren Identifizierung in ein einzelnes steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen legen.
- Lebende Käfer bis zur Analyse im Kühlschrank bei einer Temperatur von 0-2 °C in einem geschlossenen, belüfteten Behälter mit einem feuchten Wattebausch lagern.
5. Aufbereitung von Organ- und Gewebeproben
- Um die Hämolymphe zu sammeln, machen Sie mit einer Insulinnadel eine Punktion im seitlichen Teil des Bauches unter den Flügeldecken.
HINWEIS: Während der Überwinterung wird die Menge der Hämolymphe deutlich reduziert, was das Auffangen dieser Flüssigkeit erschwert. - Um den Darm zu isolieren, schneiden Sie die Kopfkapsel ab, drücken Sie den gesamten Inhalt in eine Petrischale mit Phosphatpuffer, trennen Sie den Darm und reinigen Sie ihn von Fett und Malpighischen Gefäßen.
- Trennen Sie einen gewünschten Abschnitt des Darms ab, z. B. den Vorderdarm, Mitteldarm oder Hinterdarm.
- Um den Fettkörper zu isolieren, trennen Sie ihn nach der Isolierung des Darms von anderen Geweben.
HINWEIS: Die isolierten Gewebe können zur Messung der Aktivität von antioxidativen und entgiftenden Enzymen (ein Beispiel: Ergänzende Abbildung 1), zur Analyse der Regulation von Genen des Immunsignalwegs (ein Beispiel: Ergänzende Abbildung 2) oder zur Metabarcodierung von Insektendarminhalten usw. verwendet werden.
6. Isolierung von Mikroorganismen aus den Kadavern
- Um entomopathogene Pilze aus den Kadavern zu isolieren, legen Sie die mumifizierten Insekten in eine sterile Feuchtigkeitskammer.
- Verwenden Sie Luftkonidien (falls vorhanden) oder Sklerotien aus dem Inneren der Käfer zum Auftragen von Sabouraud-Dextrose-Agar mit 0,4%iger Milchsäure.
HINWEIS: Verwenden Sie Käfer mit Myzel und Konidien sofort zum Plattieren (ohne sie in Feuchtigkeitskammern zu stellen). - Isolieren Sie Bakterien aus den Kadavern mit Symptomen einer bakteriellen Zersetzung.
- Schneiden Sie einem Käfer den Kopf ab, drücken Sie den inneren Inhalt aus und sammeln Sie ihn in Röhrchen, um ihn anschließend auf Medien für Bakterien (Luria-Bertani-Agar, Endo-Agar und Gallen-Esculin-Agar) aufzutragen.
HINWEIS: Verwenden Sie Mikroskopie und molekulare Methoden, um Gattungen und Arten der Krankheitserreger zu identifizieren. Bei Bedarf kann eine Analyse auf das Vorhandensein anderer Parasiten durchgeführt werden.
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Representative Results
Die folgenden Ergebnisse zu überwinternden CPBs zeigen die Bodentemperatur, das Überleben und die Infektionen.
Dynamik der Bodentemperatur.
Von Ende November bis Anfang April wurden Minustemperaturen in den Käfigen in 30 cm Tiefe registriert (Abbildung 1). Die Durchschnittstemperatur lag in diesem Zeitraum bei minus 3,3 ± 0,1 °C (Mittelwert ± Standardfehler). Die niedrigste gemessene Temperatur lag Mitte Februar bei minus 7,9 °C.
Überleben von überwinternden CPBs.
Die Sterblichkeit der Insekten wurde während des Winterschlafs beobachtet und erreichte im Frühjahr vor dem Auflaufen ein Maximum. Die anfängliche Anzahl der Käfer betrug 2000, von denen 1470 Individuen bis Ende Mai überlebten. Die Überlebensrate der Käfer während des Winterschlafs lag bei 61% (Abbildung 2).
Infektionen in überwinternden CPBs.
Eine Analyse von 530 toten Käfern zeigte, dass 53 % von ihnen während des Winterschlafs Symptome einer bakteriellen Zersetzung und 25 % Symptome von Pilzinfektionen aufwiesen (Abbildung 3). Beauveria dominierte (45 Isolate) unter den isolierten Kulturen entomopathogener Pilze. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) und Lecanicillium waren deutlich seltener (jeweils zwei Isolate). Unter den aus den Kadavern isolierten Bakterien mit Symptomen bakterieller Zersetzung (n = 30) wurden Arten der Gattungen Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella und Glutamicibacter identifiziert (Ergänzende Tabelle 1).
Abbildung 1: Dynamik der Bodentemperatur. Bodentemperaturdynamik, gemessen mit einem wasserdichten Temperatur-Datenlogger, der in einer Tiefe von 30 cm installiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überleben von überwinternden Kartoffelkäfern in verschiedenen Winterschlafphasen. Die Käfige wurden ausgegraben und die überlebenden und toten Käfer im November, Januar, April und Mai gezählt. Die Balken stellen die Anzahl der überlebenden Käfer dar. Schnurrhaare zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Infektionen bei überwinternden Kartoffelkäferkadavern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Materialien: Bitte klicken Sie hier, um die folgenden ergänzenden Dateien herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1. Aktivität von unspezifischen Esterasen im Mitteldarm des CPB während des Winterschlafs. Schnurrhaare kennzeichnen den Standardfehler. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten hin (Dunn-Test, P < 0,05).
Ergänzende Abbildung 2: Veränderungen der Expression des Transkriptionsfaktors NFkB (IMD-Signalweg) im Darm und Fettkörper des CPB während des Winterschlafs. Die Daten werden als Faltungsänderungen relativ zu einem August-Zeitpunkt dargestellt. Als Referenzgene wurden Rp4, Rp18 und Arf19 verwendet. Die Schnurrhaare weisen einen Standardfehler auf.
Ergänzende Tabelle 1: Mutmaßliche Identifizierung von 16S rRNA (~800 bp) Gensequenzen von Bakterien, die während des Winterschlafs aus einem toten CPB isoliert wurden.
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Discussion
Diese Studie zeigt, dass die vorgeschlagene Methode zur Untersuchung der Überwinterung von CPBs es uns ermöglicht, eine ausreichende Anzahl von Insekten in verschiedenen Perioden des Winterschlafs zu erhalten. Der Erfolg der vorgestellten Technik hängt von mehreren unabhängigen Faktoren ab, von denen der wichtigste die Wetterbedingungen sind. In einem kalten, schneelosen Winter kann der Boden bis zur gesamten Tiefe des Käfigs gefrieren. In diesem Fall steigt das Sterberisiko aller Käfer deutlich an18. Das Überleben des Käfers hängt von einer Kombination vieler Faktoren ab, die von Jahr zu Jahr6 stark variieren können.
Im Experiment fiel die Bodentemperatur in den Käfigen im Winter nicht unter minus 7,9 °C. In einer Tiefe von mehr als 25 cm wurde kein Eis beobachtet, und der Boden blieb auch während der Zeit der größten Abkühlung (Januar-Februar) locker. Die meisten Käfer sammelten sich im unteren Teil jedes Käfigs in einer Tiefe von 30-40 cm. Die Käfer könnten sich mit einer größeren Tiefe der Käfige tiefer eingegraben haben. Auf der anderen Seite würde eine Vergrößerung der Tiefe des Käfigs zu einer Gewichtszunahme führen, was es schwierig macht, den Käfig vor allem im Winter aus dem Boden zu ziehen. Darüber hinaus gräbt sich der CPB nach unseren Beobachtungen auf Kartoffelfeldern der untersuchten Region nicht tiefer als 35 cm ein, um zu überwintern. Dieser Befund lässt sich durch die Lehmbodenschicht in 30-35 cm Tiefe erklären, die die Käfer nicht überwinden können. In unserem Experiment wurde sandige, lehmige Erde aus dem oberen 30 cm Horizont verwendet. Das ist wohl der Grund, warum sich die Käfer tiefer eingraben konnten als unter natürlichen Bedingungen. Die Tiefe, in der der CPB überwintert, beträgt typischerweise 10-25 cm (Ref. 1), aber dies kann je nach geografischer Region variieren. Im Nordosten der USA (New Jersey) zum Beispiel überwintern die meisten Käfer in einer Tiefe von 10-13 cm (Ref. 13). Ähnliche Überwinterungstiefen von Käfern (≤15 cm) wurden auch in Wisconsin, USAdokumentiert 18. Im südlichen Ural (Russland) liegt die Tiefe, in der sich der CPB zum Überwintern gräbt, im Bereich von 5-30 cm (Ref. 20). Dabei ist zu beachten, dass die Überlebensrate von Insekten nicht immer positiv mit einer Zunahme der Überwinterungstiefe korreliert1. Tatsächlich wurde in einem Überwinterungsversuch in Estland6 gezeigt, dass die Überlebensrate des CPB in einer Tiefe von 30 cm höher war als in einer Tiefe von 50 cm. Diese Autoren vermuten, dass dieser Befund auf den Sauerstoffmangel zurückzuführen sein könnte. Ähnliche Daten wurden in einem Feldexperiment in Wisconsin, USA18, gewonnen: Die höchste Überlebensrate (51,5%) von überwinternden CPBs wurde in einer Tiefe von 15-25 cm gemessen. Gleichzeitig wurdeeine 18,100%ige Sterblichkeit des Käfers in einer Tiefe von 25-35 cm festgestellt. Wir glauben, dass eine Tiefe von 40 cm für Experimente in der gemäßigten Zone ausreichend ist, da der Prozentsatz der überlebenden Käfer hoch war und sich die Bodenvereisung nicht auf die gesamte Tiefe des Käfigs erstreckte. Das Vorhandensein einer Schneedecke trägt zu einer geringeren Abkühlung des Bodens bei. Bei Bedarf kann die Dicke der Schneedecke über der Oberfläche der Käfige angepasst werden.
Ein weiterer wichtiger Punkt im Protokoll ist die möglicherweise unzureichende Überwinterungsbereitschaft des CPB aufgrund einer geringen Menge an gespeicherten Nährstoffen. Einige adulte CPBs blieben nach dem massenhaften Eingraben der Käfer in den Boden an der Bodenoberfläche. Es ist möglich, dass sie nicht genügend Fett gespeichert haben, da der Erfolg der Überwinterung auch von der Menge der angesammelten Nährstoffe abhängt21. Wenn die Käfige im Winter aus dem Boden geholt wurden, befanden sich einige der Käfer in gefrorenem Zustand auf der Bodenoberfläche oder in der oberflächennahen Schicht. Vielleicht waren es die Käfer, die aufgrund von Unterernährung, Infektionen oder anderen schädlichen Faktoren nicht genug Energie zum Graben hatten. Lashomb et al.13 stellten in Experimenten mit CPB-Überwinterung fest, dass ~15% der erwachsenen Tiere sich nicht in den Boden eingruben, um zu überwintern. Diese Autoren gingen nicht auf die Gründe ein. In jedem Fall ist es notwendig, den Käfern genügend Nahrung zur Verfügung zu stellen.
Je nach Ziel einer Studie kann es notwendig sein, die Käfer im Winterschlaf zu halten, nachdem sie aus dem Boden geholt wurden. Zu diesem Zweck sollte die Labortemperatur kühl sein und die Käfer sofort nach der Entnahme aus dem Boden in Bedingungen von 0-2 °C versetzt werden. In unserer Arbeit wurde beobachtet, dass CPBs im Herbst und Frühjahr fast sofort mit der Bewegungsaktivität beginnen, nachdem sie aus dem Boden ausgegraben wurden. Dieser Prozess läuft mitten im Winter viel langsamer ab.
In dieser Studie wurden aktiv bewegende Entomopathogene und Parasitoide nicht berücksichtigt. Wir haben ein Geotextil als zusätzliche Barriere gegen die Ausbreitung des CPB verwendet. Beachten Sie, dass ein Geotextil nicht in der Forschung an sich aktiv bewegenden Entomopathogenen (z. B. entomopathogenen Nematoden), Räubern oder Parasitoiden verwendet werden sollte, da es deren Bewegung durch das Geotextil behindert.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass Studien über die Immunität und Krankheiten des CPB meist während der aktiven Fütterungsphasen durchgeführt werden. Ruhestadien sind weniger erforscht und wurden hauptsächlich unter Laborbedingungen untersucht. Unter diesen Bedingungen ist es jedoch schwierig, die Schwankungen von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Belüftung zu simulieren, die an natürlichen Brutstätten auftreten. Daher sind Feldexperimente vorzuziehen22. Um die Ursachen für die CPB-Wintersterblichkeit auf dem Feld in verschiedenen Winterüberwinterungsperioden zu ermitteln, ist es notwendig, überwinternde Käfer aus dem Boden zu graben. In den 1970er und 1980er Jahren wurden aktiv Studien zur CPB-Überwinterung unter natürlichen Bedingungen durchgeführt. Die in diesen Arbeiten beschriebenen Methoden bestehen hauptsächlich aus dem Sammeln und Zählen von Individuen, die im Frühjahr schlüpfen13, der Bewertung der Wirksamkeit des Einsatzes von entomopathogenen Pilzen 14,15,16 oder entomopathogenen Nematoden15 vor der Überwinterung und dem Sammeln von überwinternden Käfern aus dem Boden im Frühjahr und Herbst, um die natürliche Wintersterblichkeit zu bestimmen 17. Gleichzeitig variierten die Größen und Formen der Käfige, die in diesen Experimenten verwendet wurden, von 20×20 cm bis 90×90×90 cm (Ref.13) oder 180×60×30 cm (Ref.18). Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die oben genannten Studien nicht darauf abzielten, die Methodik für die CPB-Überwinterung mit der Möglichkeit des Sammelns von Insekten im Winter zu entwickeln. Im Gegensatz zu bestehenden Methoden ermöglicht es die in diesem Artikel beschriebene Technik, natürliche CPB-Populationen in einer Schneeperiode zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagene Methode es den Forschern ermöglicht, die gewünschte Anzahl von überwinternden CPB-Individuen unter natürlichen Bedingungen mit relativ geringer Sterblichkeit der Insekten und zu geringen Kosten zu erhalten. Die Untersuchung verschiedener Aspekte des CPB-Winterschlafs ist sowohl aus Sicht der Grundlagenforschung als auch aus angewandter Sicht unerlässlich, um Ansätze zur Bekämpfung dieses Schädlings zu verbessern. Diese Technik kann an andere Insektenarten angepasst werden, die im Boden überwintern. Zukünftige Forscher könnten diese Methode anwenden, um die allgemeine Physiologie und Biochemie - einschließlich der Immunität von Überwinterungsphasen - verschiedener Insektenarten zu untersuchen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Häufigkeit von Schädlingen von Interesse auf der Grundlage ihrer Wintersterblichkeit vorherzusagen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Acknowledgments
Wir danken unseren Kollegen Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova und Oksana Tomilova für ihre Hilfe bei der Organisation und Durchführung der Feld- und Laborverfahren.
Die Forschung wurde von der Russischen Wissenschaftsstiftung unterstützt, Projekt Nr. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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