Summary
Aqui apresentamos um método para estudar a hibernação de besouros da batata Colorado sob as condições naturais da zona temperada, bem como uma técnica para coletar besouros no inverno. Este método permite obter um número desejado de indivíduos invernantes para várias análises em qualquer estágio de hibernação.
Abstract
Uma das principais pragas da batata Solanum tuberosum L. na zona temperada é o inseto besouro da batata Colorado (CEC). A maioria dos estudos sobre a imunidade e as doenças da CEC é realizada durante a fase de alimentação ativa. No entanto, há menos estudos sobre estágios de repouso, embora esses besouros passem a maior parte de seu ciclo de vida em um estado de diapausa (hibernação) de inverno. Neste trabalho, um método para investigar a hibernação da CEC em condições naturais foi desenvolvido e testado, oferecendo a oportunidade de coletar um número suficiente de indivíduos no inverno. Neste artigo, avaliou-se a sobrevida da CEC e identificaram-se agentes infecciosos em diferentes estágios de hibernação. A mortalidade da CEC aumentou durante a hibernação, atingindo um máximo em abril-maio. Fungos entomopatogênicos (Beauveria, Isaria e Lecanicillium) e bactérias Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas e Serratia foram isolados dos insetos mortos. A taxa de sobrevivência dos besouros durante todo o período de hibernação foi de 61%. Não foram encontrados besouros congelados ou dessecados, indicando o sucesso do método apresentado.
Introduction
O besouro da batata Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) é uma importante praga de plantas Solanaceae, predominantemente batata Solanum tuberosum L. A distribuição geográfica desta espécie é de mais de 16 milhões de km2 e se expande constantemente1. A CEC tem diapausa facultativa de inverno, e a hibernação é obrigatória na zona temperada. A diapausa é induzida por um fotoperíodo de dias curtos e modulada pela temperatura1. Estes besouros passam o inverno na fase adulta, escavando-se no solo. Com o aumento das latitudes, a duração do período de hibernação se estende. Na zona temperada, especialmente nos territórios setentrionais de sua distribuição, o inverno dura até 9 meses: de agosto-setembro até maio-junho (Noskov et al., observações pessoais). Durante esse período, a CEC - assim como qualquer outro inseto da zona temperada - é exposta a condições desfavoráveis de inverno e deve aumentar sua tolerância ao frio. Ao mesmo tempo, o contato dos besouros com o solo aumenta o risco de infecção por vários microrganismos oportunistas e patogênicos2. Portanto, esses besouros precisam manter um certo nível de atividade do sistema imunológico durante a hibernação, o que também é energeticamente caro. No entanto, mesmo que o inseto sobreviva a uma infecção, a doença pode reduzir sua rusticidade ao frio3. Deve-se notar que a baixa temperatura não é a única razão para a mortalidade de inverno da CEC. Um papel importante também é desempenhado pela falta de oxigênio e, em algumas condições, pode ser o principal fator de mortalidade no inverno 4,5.
Sabe-se que a mortalidade natural de inverno da CEC pode ser muito alta, chegando a 100% em solos franco-argilosos6. Assim, o inverno excessivo é um dos períodos mais cruciais no ciclo de vida da CEC. No entanto, dados sobre fisiologia, atividade do sistema imunológico, sobrevida e outros parâmetros da hibernação da CEC em condições naturais ainda são limitados. Há estudos sobre a expressão gênica diferencial e vários parâmetros fisiológicos em adultos com CEC durante a diapausa e em resposta ao choque frio 7,8,9,10,11,12; no entanto, essas análises têm sido realizadas principalmente por indução de diapausa ou estresse ao frio em condições de laboratório, sem flutuações naturais de temperatura, umidade e carga de patógenos nativos. No entanto, pesquisas sobre a fisiologia desses besouros coletados por escavação do solo em condições naturais são importantes. Diferentes aspectos da superinvernada da CEC em condições naturais foram ativamente estudados nas décadas de 1970-1980 13,14,15,16,17,18. Por outro lado, esses estudos não envolveram escavação da CEC do solo no inverno. Além disso, uma técnica de hibernação controlada da CEC e uma descrição das gaiolas não são fornecidas em detalhes. Assim, é necessária investigação sobre a fisiologia da invernada das CECs em ambientes naturais19.
O objetivo deste estudo foi desenvolver e testar um método de hibernação controlada de adultos com CEC em condições naturais. O método proposto permite obter um número desejado de indivíduos com CEC para ensaios microbiológicos, imunológicos e outros durante a hibernação em condições de campo de clima continental. Este método pode ser adaptado e aplicado a outras espécies de insetos que passam o inverno em solo sob neve.
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Protocol
1. Descrição das gaiolas para hibernação
NOTA: Dependendo dos objetivos do experimento, o número de gaiolas varia. Utilizar pelo menos três gaiolas por data de amostragem. Para estimar o número de besouros que surgirão, prepare pelo menos três gaiolas adicionais, que não serão retiradas do solo até a primavera.
- Use gaiolas feitas de uma estrutura rígida de madeira com um tamanho de 25 × 25 × 40 cm (L × W × H).
- Para construir uma armação para a gaiola, use ripas de madeira com pelo menos 2 cm de espessura e 4 cm de largura.
- Cobrir o interior da gaiola com uma malha de aço inoxidável com um tamanho de abertura não superior a 5 mm × 3 mm. Use um grampeador de madeira para fixar a malha.
- Fixe a malha de aço inoxidável na parte externa do fundo com o grampeador.
- Forre o interior da gaiola com um geotêxtil sintético preto com uma densidade de 60 g/m2.
OBS: O geotêxtil serve como uma barreira adicional para impedir a fuga dos besouros. Não usá-lo em experimentos relacionados a entomopatógenos e parasitoides em movimento ativo. - Fixe firmemente um tubo de tecido sintético translúcido respirável de aproximadamente 60 cm de altura ao topo da gaiola.
- Atravesse e fixe duas cordas fortes no fundo da gaiola para retirá-la do solo quando necessário.
2. Instalação das gaiolas
- Cavar um buraco de 40 cm de profundidade no solo e colocar a gaiola dentro.
- Coloque grama seca ou feno no buraco.
- Coloque a gaiola dentro de modo que o feno ou grama seca fique entre as paredes da gaiola e o solo.
- Encha as gaiolas com terra do mesmo campo de batata onde os insetos são coletados.
- Instale registradores de dados de temperatura e umidade à prova d'água nas gaiolas nas profundidades necessárias.
NOTA: Os registadores de dados de qualquer fabricante podem ser utilizados e devem poder funcionar a baixas temperaturas. - Plante mudas de batata dentro de cada gaiola 3-4 semanas antes da introdução dos besouros e regue-as moderadamente.
- Fixe um tubo de tecido sintético verticalmente a um bastão de qualquer material instalado na parte externa da gaiola.
3. Criação de insetos antes do inverno
- Coletar manualmente besouros adultos em campos de batata livres de pesticidas no final da vegetação de batata.
NOTA: Os besouros adultos diferem substancialmente das larvas e são caracterizados por élitras listradas, enquanto as larvas são vermelhas. - Mantenha os besouros coletados em baldes plásticos de 15-20 L (máximo de 200 indivíduos por balde) contendo tampas de batata para alimentar os insetos antes de colocá-los nas gaiolas.
- Cubra os baldes com tecido respirável.
OBS: Não mantenha insetos em baldes por mais de 12 h. Use tampos de batata grandes o suficiente para evitar o acúmulo de besouros no fundo dos baldes. - Coloque no máximo 200 indivíduos com CEC sobre as plantas de batata cobertas com a malha de tecido sintético.
- Quando as tampas de batata forem consumidas, adicione as frescas colocadas em um pote plástico contendo água e troque as tampas de batata diariamente depois.
OBS: Para fixar hastes em um frasco, use algodão e parafilme. Verifique cuidadosamente os caules velhos para os besouros ao removê-los. - Depois que todos os besouros forem escavados no solo para passar o inverno, desamarre o tubo de tecido sintético do bastão e coloque o tecido para baixo.
4. Coleta de insetos durante o inverno
- Remova a neve acima da superfície da gaiola.
- Solte a gaiola de cada lado com uma pá forte.
- Puxe a gaiola para fora do solo usando as cordas.
- Traga a gaiola para o laboratório.
NOTA: Dependendo dos objetivos do experimento, os besouros hibernantes podem ter que estar inativos antes da análise. Neste caso, a temperatura em laboratório durante o isolamento dos besouros do solo deve ser de ~2-5 °C. - Retire a terra da caixa em pequenas porções, quebre cuidadosamente grandes pedaços de terra e isole os besouros usando uma pinça.
- Separe os besouros vivos dos cadáveres. Os besouros vivos e saudáveis criam solo compacto ao seu redor, formando uma cavidade de ar (o chamado berço), sendo, portanto, facilmente separados do solo. Os besouros mortos por fungos são mumificados ou têm micélio visível na superfície. Os insetos em decomposição bacteriana são escuros.
- Peneire o solo através de uma peneira para garantir que todos os besouros estejam isolados e não danificados.
- Coloque cadáveres com sintomas de infecção fúngica ou decomposição bacteriana em um tubo centrífugo estéril individual de 15 mL para identificação futura.
- Armazenar besouros vivos em um refrigerador a uma temperatura de 0-2 °C até a análise em um recipiente ventilado fechado contendo uma bola de algodão úmida.
5. Preparação de amostras de órgãos e tecidos
- Para coletar hemolinfa, faça uma punção na parte lateral do abdome sob elytra usando uma agulha de insulina.
OBS: Durante o inverno, a quantidade de hemolinfa é significativamente reduzida, o que dificulta a coleta desse líquido. - Para isolar o intestino, corte a cápsula da cabeça, esprema todo o conteúdo em uma placa de Petri com tampão fosfato, separe o intestino e limpe-o de gordura e vasos malpighianos.
- Separe uma seção desejada do intestino, como o intestino anterior, o intestino médio ou o intestino posterior.
- Para isolar o corpo gordo, separe-o de outros tecidos após o isolamento do intestino.
NOTA: Os tecidos isolados podem ser usados para medir a atividade de enzimas antioxidantes e desintoxicantes (um exemplo: Figura Suplementar 1), análise da regulação de genes de vias de sinalização imune (um exemplo: Figura Suplementar 2), ou metabarcoding do conteúdo intestinal de insetos, etc.
6. Isolamento de microrganismos dos cadáveres
- Para isolar fungos entomopatogênicos dos cadáveres, coloque os insetos mumificados em uma câmara de umidade estéril.
- Use conídios aéreos (se disponíveis) ou escleródios do conteúdo interno dos besouros para plaquear em ágar Sabouraud dextrose com ácido lático a 0,4%.
NOTA: Use besouros com micélio e conídios para plaqueamento imediato (sem colocá-los em câmaras de umidade). - Isolar bactérias dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana.
- Corte a cabeça de um besouro, esprema o conteúdo interno e colete-os em tubos para posterior revestimento em meios para bactérias (ágar Luria-Bertani, ágar endo e ágar esculina biliar).
NOTA: Utilizar microscopia e métodos moleculares para identificar gêneros e espécies dos patógenos. Se necessário, uma análise para a presença de outros parasitas pode ser realizada.
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Representative Results
Os resultados abaixo sobre CECs durante o inverno mostram temperatura, sobrevivência e infecções do solo.
Dinâmica da temperatura do solo.
Temperaturas abaixo de zero nas gaiolas a 30 cm de profundidade foram registradas do final de novembro ao início de abril (Figura 1). A temperatura média nesse período foi de menos 3,3 ± 0,1 °C (média ± erro padrão). A menor temperatura registrada foi de -7,9 °C em meados de fevereiro.
Sobrevida de CECs invernadas.
A mortalidade dos insetos foi observada durante a hibernação e atingiu um máximo na primavera antes da emergência. O número inicial de besouros era de 2000, dos quais 1470 indivíduos sobreviveram até o final de maio. A taxa de sobrevivência dos besouros durante a hibernação foi de 61% (Figura 2).
Infecções em CECs de inverno excessivo.
Uma análise de 530 besouros mortos mostrou que, durante o período de hibernação, 53% deles apresentaram sintomas de decomposição bacteriana e 25% apresentaram sintomas de infecções fúngicas (Figura 3). Beauveria dominou (45 isolados) entre as culturas isoladas de fungos entomopatogênicos. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) e Lecanicillium foram muito menos comuns (dois isolados cada). Entre as bactérias isoladas dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana (n = 30), foram identificadas espécies pertencentes aos gêneros Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter (Tabela Suplementar 1).
Figura 1: Dinâmica da temperatura do solo. Dinâmica da temperatura do solo medida por um registrador de dados de temperatura à prova d'água instalado a uma profundidade de 30 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sobrevivência de besouros de batata Colorado durante o inverno em diferentes períodos de hibernação. As gaiolas foram escavadas, e os besouros sobreviventes e mortos foram contados em novembro, janeiro, abril e maio. As barras representam o número de besouros sobreviventes. Bigodes indicam erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Infecções em cadáveres de besouros de batata Colorado durante o inverno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Materiais Suplementares: Clique aqui para baixar os Arquivos Suplementares abaixo.
Figura suplementar 1. Atividade de esterases inespecíficas no intestino médio da CEC durante a hibernação. Bigodes denotam erro padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os momentos (teste de Dunn, P < 0,05).
Figura 2 Suplementar: Alterações da expressão do fator de transcrição NFkB (via IMD) no intestino e corpo adiposo da CEC durante a hibernação. Os dados são apresentados como alterações de dobra em relação a um ponto de tempo de agosto. Rp4, Rp18 e Arf19 foram utilizados como genes de referência. Bigodes mostram erro padrão.
Tabela suplementar 1: Identificação putativa de sequências gênicas do gene 16S rRNA (~800 pb) de bactérias isoladas de uma CEC morta durante a hibernação.
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Discussion
Este estudo mostra que o método proposto para o estudo da sobreinverno de CECs permite obter um número suficiente de insetos em diferentes períodos de hibernação. O sucesso da técnica apresentada depende de vários fatores independentes, sendo o mais importante das condições climáticas. Em um inverno frio e sem neve, o solo pode congelar até toda a profundidade da gaiola. Nesse caso, o risco de morte de todos os besouros aumenta significativamente18. A sobrevivência do besouro depende de uma combinação de muitos fatores, que podem variar significativamente de ano para ano6.
No experimento, a temperatura do solo no interior das gaiolas durante o inverno não caiu abaixo de -7,9 °C. Não foi observado gelo a uma profundidade superior a 25 cm, e o solo permaneceu solto mesmo durante o período de maior resfriamento (janeiro a fevereiro). A maioria dos besouros se acumulou na parte inferior de cada gaiola, a uma profundidade de 30-40 cm. Os besouros podem ter cavado mais fundo com uma profundidade maior das gaiolas. Por outro lado, o aumento da profundidade da gaiola levaria a um aumento de peso, tornando difícil extrair a gaiola do solo, especialmente no inverno. Além disso, de acordo com nossas observações em campos de batata da região em estudo, a CEC não escava mais profundamente do que 35 cm para o inverno. Esse achado pode ser explicado pela camada de solo argiloso na profundidade de 30-35 cm, que os besouros não conseguem superar. Em nosso experimento, foi utilizado solo arenoso e argiloso do horizonte superior de 30 cm. Esta é provavelmente a razão pela qual os besouros foram capazes de escavar mais profundamente do que em condições naturais. A profundidade em que a CEC hiberna é tipicamente de 10-25 cm (ref. 1), mas isso pode variar entre as regiões geográficas. Por exemplo, no nordeste dos Estados Unidos (Nova Jersey), a maioria dos besouros hiberna a uma profundidade de 10-13 cm (ref. 13). Profundidades semelhantes de besouros durante o inverno (≤15 cm) também foram documentadas em Wisconsin, EUA18. Nos Urais do sul (Rússia), a profundidade em que a CEC escava para o inverno está na faixa de 5-30 cm (ref. 20). Deve-se notar que a taxa de sobrevivência dos insetos nem sempre se correlaciona positivamente com o aumento da profundidade de invernada1. De fato, em um experimento de campo durante o inverno na Estônia6, demonstrou-se que a taxa de sobrevivência da CEC foi maior a uma profundidade de 30 cm do que a uma profundidade de 50 cm. Os autores propõem que esse achado pode ser devido à falta de oxigênio. Dados semelhantes foram obtidos em um experimento de campo em Wisconsin, EUA18: a maior taxa de sobrevivência (51,5%) de CEC invernada foi registrada a uma profundidade de 15-25 cm. Ao mesmo tempo,18, 100% de mortalidade do besouro foi observada a uma profundidade de 25-35 cm. Acreditamos que uma profundidade de 40 cm é suficiente para experimentos na zona temperada, pois a porcentagem de besouros sobreviventes foi alta, e o congelamento do solo não se estendeu a toda a profundidade da gaiola. A presença de cobertura de neve contribui para o menor resfriamento do solo. Se necessário, a espessura da cobertura de neve acima da superfície das gaiolas pode ser ajustada.
Outro ponto fundamental do protocolo é a possível prontidão insuficiente da CEC para o inverno devido à pequena quantidade de nutrientes armazenados. Alguns CECs adultos permaneceram na superfície do solo após a escavação em massa dos besouros no solo. É possível que não armazenem gordura suficiente, pois o sucesso do inverno depende também da quantidade de nutrientes acumulados21. Além disso, quando as gaiolas foram removidas do solo no inverno, alguns dos besouros estavam congelados na superfície do solo ou na camada próxima à superfície. Talvez esses fossem os besouros que não tinham energia suficiente para escavar devido à desnutrição, infecções ou outros fatores prejudiciais. Lashomb et al.13 observaram, em experimentos com CEC durante o inverno, que ~15% dos adultos não escavavam no solo por excesso de inverno. Esses autores não discutiram os motivos. Em qualquer caso, é necessário fornecer aos besouros comida suficiente.
Dependendo dos objetivos de um estudo, pode ser necessário manter os besouros em estado de hibernação após serem coletados do solo. Para este fim, a temperatura de laboratório deve ser fria, e os besouros devem ser imediatamente colocados em condições de 0-2 °C após a extração do solo. Observou-se em nosso trabalho que, no outono e na primavera, as CECs iniciam quase imediatamente a atividade locomotora após serem escavadas do solo; Esse processo ocorre muito mais lentamente no meio do inverno.
Este estudo não levou em consideração entomopatógenos e parasitoides em movimento ativo. Utilizou-se um geotêxtil como barreira adicional contra a propagação da CEC. Observe que um geotêxtil não deve ser usado em pesquisas sobre entomopatógenos em movimento ativo (por exemplo, nematoides entomopatogênicos), predadores ou parasitoides, porque impedirá seu movimento através dele.
É importante ressaltar que os estudos sobre a imunidade e as doenças da CEC são realizados, em sua maioria, durante a fase de alimentação ativa. Os estágios de repouso são menos investigados e têm sido examinados principalmente em condições de laboratório. Nessas condições, no entanto, é difícil simular as flutuações de temperatura, umidade e aeração que ocorrem nos criadouros naturais. Assim, experimentos de campo são preferíveis22. Para determinar as causas de mortalidade de inverno da CEC no campo em diferentes períodos de hibernação, é necessário escavar besouros invernantes do solo. Estudos sobre o excesso de CEC no inverno em condições naturais foram ativamente conduzidos nas décadas de 1970-1980. Os métodos descritos nesses trabalhos consistem principalmente em coletar e contar indivíduos que emergem na primavera 13, avaliar a eficácia do uso de fungos entomopatogênicos 14,15,16 ou nematoides entomopatogênicos15 antes do inverno excessivo e coletar besouros invernantes do solo na primavera e no outono para determinar a mortalidade natural no inverno 17. Ao mesmo tempo, os tamanhos e formatos das gaiolas utilizadas nesses experimentos variaram de 20×20 cm a 90×90×90 cm (ref.13) ou 180×60×30 cm (ref.18). Ressalta-se que os estudos supracitados não tiveram como objetivo desenvolver a metodologia para a superinvernada da CEC com a possibilidade de coleta de insetos no inverno. Diferentemente dos métodos existentes, a técnica descrita neste artigo possibilita investigar populações naturais de CEC em período de neve.
Em conclusão, o método proposto permite aos pesquisadores obter o número desejado de indivíduos com CEC invernando em condições naturais, com mortalidade relativamente baixa dos insetos e baixo custo. A investigação de vários aspectos da hibernação da CEC é essencial tanto do ponto de vista da pesquisa básica quanto da aplicada: para melhorar as abordagens para o controle dessa praga. Esta técnica pode ser adaptada a outras espécies de insetos que passam o inverno no solo. Futuros pesquisadores podem aplicar este método para estudar a fisiologia geral e bioquímica - incluindo a imunidade de fases de inverno - de várias espécies de insetos. Além disso, este método pode ser usado para prever a abundância de pragas de interesse, com base em sua mortalidade de inverno.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos colegas Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova e Oksana Tomilova por sua ajuda na organização e execução dos procedimentos de campo e laboratório.
A pesquisa foi apoiada pela Fundação Russa de Ciência, projeto No. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
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