Summary
Nous présentons ici une méthode d’étude de l’hibernation du doryphore de la pomme de terre dans les conditions naturelles de la zone tempérée ainsi qu’une technique de collecte des coléoptères en hiver. Cette méthode permet d’obtenir le nombre souhaité d’individus hivernants pour diverses analyses à n’importe quel stade d’hibernation.
Abstract
L’un des principaux ravageurs de la pomme de terre Solanum tuberosum L. dans la zone tempérée est l’insecte doryphore de la pomme de terre (CPB). La plupart des études sur l’immunité et les maladies du doryphore sont menées pendant les phases d’alimentation active. Néanmoins, il existe moins d’études sur les stades de repos, bien que ces coléoptères passent la majeure partie de leur cycle de vie dans un état de diapause hivernale (hibernation). Dans le cadre de ce travail, une méthode d’étude de l’hibernation du doryphore dans des conditions naturelles a été mise au point et mise à l’essai, offrant ainsi la possibilité de capturer un nombre suffisant d’individus en hiver. Dans cet article, la survie du doryphore a été évaluée et des agents infectieux à différents stades d’hibernation ont été identifiés. La mortalité des doryphores a augmenté pendant l’hibernation, atteignant un maximum en avril-mai. Des champignons entomopathogènes (Beauveria, Isaria et Lecanicillium) et des bactéries Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas et Serratia ont été isolés des insectes morts. Le taux de survie des coléoptères pendant toute la période d’hibernation était de 61 %. Aucun coléoptère congelé ou desséché n’a été trouvé, ce qui indique le succès de la méthode présentée.
Introduction
Le doryphore de la pomme de terre Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) est un ravageur important des plantes Solanacées, principalement de la pomme de terre Solanum tuberosum L. L’aire de répartition géographique de cette espèce est de plus de 16 millions dekm2 et ne cesse de s’étendre1. Le doryphore a une diapause hivernale facultative et l’hibernation est obligatoire dans la zone tempérée. La diapause est induite par une photopériode de jour court et modulée par la température1. Ces coléoptères hivernent au stade adulte en s’enfouissant dans le sol. Avec l’augmentation des latitudes, la durée de la période d’hibernation s’allonge. Dans la zone tempérée, en particulier sur les territoires septentrionaux de son aire de répartition, l’hivernage dure jusqu’à 9 mois : d’août-septembre à mai-juin (Noskov et al., observations personnelles). Pendant cette période, le doryphore - comme tout autre insecte de la zone tempérée - est exposé à des conditions hivernales défavorables et doit augmenter sa tolérance au froid. Dans le même temps, le contact des coléoptères avec le sol augmente le risque d’infection par divers micro-organismes opportunistes et pathogènes2. Par conséquent, ces coléoptères doivent maintenir un certain niveau d’activité du système immunitaire pendant l’hibernation, ce qui est également coûteux sur le plan énergétique. Néanmoins, même si l’insecte survit à une infection, la maladie peut réduire sa résistance au froid3. Il est à noter que les basses températures ne sont pas la seule cause de mortalité hivernale du doryphore. Le manque d’oxygène joue également un rôle important et, dans certaines conditions, il pourrait être le principal facteur de mortalité hivernale 4,5.
On sait que la mortalité hivernale naturelle du doryphore peut être très élevée, atteignant 100 % dans les sols limoneux argileux6. Ainsi, l’hivernage est l’une des périodes les plus cruciales du cycle de vie de l’OEC. Néanmoins, les données sur la physiologie, l’activité du système immunitaire, la survie et d’autres paramètres de l’hibernation du doryphore dans des conditions naturelles sont encore limitées. Il existe des études sur l’expression différentielle des gènes et divers paramètres physiologiques chez les adultes atteints de doryphore pendant la diapause et en réponse à un choc thermique 7,8,9,10,11,12 ; Cependant, ces analyses ont principalement été effectuées par induction de diapause ou de stress dû au froid dans des conditions de laboratoire sans fluctuations naturelles de température, d’humidité et de charge pathogène native. Néanmoins, la recherche sur la physiologie de ces coléoptères collectés par excavation dans le sol dans des conditions naturelles est importante. Différents aspects de l’hivernage du doryphore dans des conditions naturelles ont été activement étudiés dans les années 1970-1980 13,14,15,16,17,18. D’autre part, ces études n’ont pas impliqué l’excavation du doryphore dans le sol en hiver. De plus, une technique d’hibernation contrôlée du doryphore et une description des cages ne sont pas fournies en détail. Il est donc nécessaire d’étudier la physiologie des doryphores hivernant en milieu naturel19.
L’objectif de cette étude était de mettre au point et de mettre à l’essai une méthode d’hibernation contrôlée des adultes atteints de doryphores dans des conditions naturelles. La méthode proposée permet d’obtenir un nombre souhaité d’individus de doryphores pour des tests microbiologiques, immunologiques et autres pendant l’hibernation dans les conditions de terrain d’un climat continental. Cette méthode peut être adaptée et appliquée à d’autres espèces d’insectes hivernant dans le sol sous la neige.
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Protocol
1. Description des cages d’hibernation
REMARQUE : Selon les objectifs de l’expérience, le nombre de cages varie. Utiliser au moins trois cages par date d’échantillonnage. Pour estimer le nombre de coléoptères qui émergeront, préparez au moins trois cages supplémentaires, qui ne seront pas retirées du sol avant le printemps.
- Utilisez des cages constituées d’un cadre rigide en bois d’une taille de 25 × 25 × 40 cm (L × l × H).
- Pour construire un cadre pour la cage, utilisez des lattes de bois d’au moins 2 cm d’épaisseur et 4 cm de largeur.
- Recouvrez l’intérieur de la cage d’un treillis en acier inoxydable dont la taille des ouvertures ne dépasse pas 5 mm × 3 mm. Utilisez une agrafeuse à bois pour fixer le maillage.
- Fixez le treillis en acier inoxydable à l’extérieur du fond avec l’agrafeuse.
- Tapisser l’intérieur de la cage d’un géotextile synthétique noir d’une densité de 60 g/m2.
REMARQUE : Le géotextile sert de barrière supplémentaire pour empêcher les coléoptères de s’échapper. Ne l’utilisez pas dans des expériences liées à des entomopathogènes et des parasitoïdes en mouvement actif. - Fixez fermement un tube de tissu synthétique translucide respirant d’environ 60 cm de haut au sommet de la cage.
- Croisez et fixez deux cordes solides au fond de la cage pour la sortir du sol en cas de besoin.
2. Installation des cages
- Creusez un trou de 40 cm de profondeur dans le sol et placez la cage à l’intérieur.
- Posez de l’herbe sèche ou du foin sur le trou.
- Placez la cage à l’intérieur de manière à ce que le foin ou l’herbe sèche se trouve entre les parois de la cage et le sol.
- Remplissez les cages avec de la terre provenant du même champ de pommes de terre où les insectes sont collectés.
- Installez des enregistreurs de données de température et d’humidité étanches dans les cages aux profondeurs requises.
REMARQUE : Les enregistreurs de données de n’importe quel fabricant peuvent être utilisés et doivent pouvoir fonctionner à basse température. - Plantez les plants de pommes de terre à l’intérieur de chaque cage 3 à 4 semaines avant l’introduction des coléoptères et arrosez-les modérément.
- Fixez un tube de tissu synthétique verticalement à un bâton de n’importe quel matériau installé à l’extérieur de la cage.
3. Élevage d’insectes avant l’hivernage
- Ramasser manuellement les coléoptères adultes dans les champs de pommes de terre exempts de pesticides vers la fin de la végétation des pommes de terre.
REMARQUE : Les coléoptères adultes diffèrent considérablement des larves et sont caractérisés par des élytres rayés, tandis que les larves sont rouges. - Conservez les coléoptères collectés dans des seaux en plastique de 15 à 20 L (200 individus maximum par seau) contenant des fanes de pommes de terre pour nourrir les insectes avant de les placer dans les cages.
- Couvrez les seaux avec un tissu respirant.
REMARQUE : Ne gardez pas les insectes dans des seaux pendant plus de 12 h. Utilisez des fanes de pommes de terre suffisamment grandes pour éviter l’accumulation de coléoptères au fond des seaux. - Ne placez pas plus de 200 individus de doryphores sur les plants de pommes de terre recouverts du treillis en tissu synthétique.
- Lorsque les fanes de pommes de terre sont consommées, ajoutez-en de nouvelles placées dans un bocal en plastique contenant de l’eau et changez les fanes de pommes de terre tous les jours par la suite.
REMARQUE : Pour fixer les tiges dans un bocal, utilisez du coton et du parafilm. Vérifiez soigneusement les vieilles tiges pour les coléoptères lorsque vous les enlevez. - Une fois que tous les coléoptères sont enfouis dans le sol pour l’hivernage, détachez le tube de tissu synthétique du bâton et posez le tissu.
4. Collecte d’insectes pendant la saison hivernale
- Enlevez la neige au-dessus de la surface de la cage.
- Desserrez la cage de chaque côté à l’aide d’une pelle solide.
- Sortez la cage du sol à l’aide des cordes.
- Apportez la cage au laboratoire.
REMARQUE : Selon les objectifs de l’expérience, il se peut que les coléoptères en hibernation doivent être inactifs avant l’analyse. Dans ce cas, la température dans le laboratoire pendant l’isolement des coléoptères du sol doit être de ~2-5 °C. - Retirez la terre de la boîte en petites portions, brisez soigneusement les gros morceaux de terre et isolez les coléoptères à l’aide d’une pince à épiler.
- Séparez les coléoptères vivants des cadavres. Les coléoptères vivants et sains créent un sol compact autour d’eux, formant une cavité d’air (ce que l’on appelle un berceau) et sont donc facilement séparés du sol. Les coléoptères tués par des champignons sont momifiés ou ont un mycélium visible à la surface. Les insectes en décomposition bactérienne sont sombres.
- Tamisez le sol à travers un tamis pour vous assurer que tous les coléoptères sont isolés et non endommagés.
- Placer les cadavres présentant des symptômes d’infection fongique ou de décomposition bactérienne dans un tube à centrifuger stérile individuel de 15 ml pour une identification future.
- Conservez les coléoptères vivants au réfrigérateur à une température de 0 à 2 °C jusqu’à ce qu’ils soient analysés dans un récipient fermé et ventilé contenant une boule de coton humide.
5. Préparation d’échantillons d’organes et de tissus
- Pour prélever l’hémolymphe, faites une ponction dans la partie latérale de l’abdomen sous les élytres à l’aide d’une aiguille à insuline.
REMARQUE : Pendant l’hivernage, la quantité d’hémolymphe est considérablement réduite, ce qui rend difficile la collecte de ce liquide. - Pour isoler l’intestin, coupez la capsule de tête, pressez tout le contenu dans une boîte de Pétri avec un tampon phosphate, séparez l’intestin et nettoyez-le de la graisse et des vaisseaux de Malpighi.
- Séparez une section souhaitée de l’intestin, comme l’intestin antérieur, l’intestin moyen ou l’intestin postérieur.
- Pour isoler le corps adipeux, séparez-le des autres tissus après l’isolement de l’intestin.
REMARQUE : Les tissus isolés peuvent être utilisés pour mesurer l’activité des enzymes antioxydantes et détoxifiantes (exemple : figure 1 supplémentaire), analyser la régulation des gènes de la voie de signalisation immunitaire (exemple : figure 2 supplémentaire) ou métabarcoding du contenu intestinal des insectes, etc.
6. Isolement des micro-organismes des cadavres
- Pour isoler les champignons entomopathogènes des cadavres, placez les insectes momifiés dans une chambre d’humidité stérile.
- Utiliser des conidies aériennes (si disponibles) ou des sclérotes provenant du contenu interne des coléoptères pour le placage sur gélose au dextrose Sabouraud avec 0,4 % d’acide lactique.
REMARQUE : Utilisez immédiatement des coléoptères avec du mycélium et des conidies pour le placage (sans les placer dans des chambres d’humidité). - Isolez les bactéries des cadavres présentant des symptômes de décomposition bactérienne.
- Coupez la tête d’un coléoptère, pressez le contenu interne et collectez-le dans des tubes pour le placage ultérieur sur des milieux pour les bactéries (gélose Luria-Bertani, gélose endo et gélose à l’esculine biliaire).
REMARQUE : Utiliser la microscopie et les méthodes moléculaires pour identifier les genres et les espèces des agents pathogènes. Si nécessaire, une analyse de la présence d’autres parasites peut être effectuée.
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Representative Results
Les résultats ci-dessous sur les doryphores hivernants montrent la température du sol, le taux de survie et les infections.
Dynamique de la température du sol.
Des températures négatives dans les cages à une profondeur de 30 cm ont été enregistrées de fin novembre à début avril (figure 1). La température moyenne au cours de cette période était de moins 3,3 ± 0,1 °C (moyenne ±erreur-type). La température la plus basse enregistrée était de moins 7,9 °C à la mi-février.
Survie des doryphores hivernants.
La mortalité des insectes a été observée pendant l’hibernation et a atteint un maximum au printemps avant l’émergence. Le nombre initial de coléoptères était de 2000, dont 1470 individus ont survécu à la fin du mois de mai. Le taux de survie des coléoptères pendant l’hibernation était de 61 % (figure 2).
Infections chez les doryphores hivernants.
Une analyse de 530 coléoptères morts a montré que pendant la période d’hibernation, 53 % d’entre eux présentaient des symptômes de décomposition bactérienne et 25 % présentaient des symptômes d’infections fongiques (figure 3). Beauveria a dominé (45 isolats) parmi les cultures isolées de champignons entomopathogènes. Metarhizium, Cordyceps (= Isaria) et Lecanicillium étaient beaucoup moins fréquents (deux isolats chacun). Parmi les bactéries isolées des cadavres présentant des symptômes de décomposition bactérienne (n = 30), des espèces appartenant aux genres Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella et Glutamicibacter ont été identifiées (tableau supplémentaire 1).
Figure 1 : Dynamique de la température du sol. Dynamique de la température du sol mesurée par un enregistreur de données de température étanche installé à une profondeur de 30 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Survie des doryphores de la pomme de terre hivernants pendant différentes périodes d’hibernation. Les cages ont été creusées, et les coléoptères survivants et morts ont été dénombrés en novembre, janvier, avril et mai. Les barres représentent le nombre de coléoptères survivants. Les moustaches indiquent une erreur type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Infections chez les cadavres hivernants du doryphore de la pomme de terre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Matériel supplémentaire : Veuillez cliquer ici pour télécharger les fichiers supplémentaires ci-dessous.
Figure supplémentaire 1. Activité des estérases non spécifiques dans l’intestin moyen du doryphore pendant l’hibernation. Les moustaches indiquent l’erreur type. Des lettres différentes indiquent des différences significatives entre les points temporels (test de Dunn, P < 0,05).
Figure supplémentaire 2 : Altérations de l’expression du facteur de transcription NFkB (voie IMD) dans l’intestin et le corps adipeux du CPB pendant l’hibernation. Les données sont présentées sous forme de variations de plis par rapport à un point temporel du mois d’août. Rp4, Rp18 et Arf19 ont été utilisés comme gènes de référence. Les moustaches indiquent une erreur type.
Tableau supplémentaire 1 : Identification présumée de séquences de gènes d’ARNr 16S (~800 pb) de bactéries isolées d’un doryphore mort pendant l’hibernation.
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Discussion
Cette étude montre que la méthode proposée pour l’étude de l’hivernage des doryphores permet d’obtenir un nombre suffisant d’insectes en différentes périodes d’hibernation. Le succès de la technique présentée dépend de plusieurs facteurs indépendants, dont le plus important est les conditions météorologiques. Lors d’un hiver froid et sans neige, le sol peut geler sur toute la profondeur de la cage. Dans ce cas, le risque de mort de tous les coléoptères augmente considérablement18. La survie du coléoptère dépend d’une combinaison de nombreux facteurs, qui peuvent varier considérablement d’une année àl’autre.
Dans l’expérience, la température du sol à l’intérieur des cages pendant l’hiver n’est pas descendue en dessous de moins 7,9 °C. Aucune glace n’a été observée à une profondeur supérieure à 25 cm, et le sol est resté meuble même pendant la période de plus grand refroidissement (janvier-février). La plupart des coléoptères se sont accumulés dans la partie inférieure de chaque cage, à une profondeur de 30 à 40 cm. Les coléoptères auraient pu creuser plus profondément avec une plus grande profondeur des cages. D’autre part, l’augmentation de la profondeur de la cage entraînerait une augmentation du poids, ce qui rendrait difficile l’extraction de la cage du sol, surtout en hiver. De plus, d’après nos observations dans les champs de pommes de terre de la région étudiée, le doryphore ne creuse pas plus de 35 cm de profondeur pour hiverner. Ce résultat peut s’expliquer par la couche de sol argileux à une profondeur de 30 à 35 cm, que les coléoptères ne peuvent pas surmonter. Dans notre expérience, un sol sablonneux et limoneux provenant de l’horizon supérieur de 30 cm a été utilisé. C’est probablement la raison pour laquelle les coléoptères ont pu s’enfouir plus profondément que dans des conditions naturelles. La profondeur à laquelle le doryphore hiberne est généralement de 10 à 25 cm (réf. 1), mais cela peut varier d’une région géographique à l’autre. Par exemple, dans le nord-est des États-Unis (New Jersey), la plupart des coléoptères hibernent à une profondeur de 10 à 13 cm (réf. 13). Des profondeurs d’hivernage similaires de coléoptères (≤15 cm) ont également été documentées dans le Wisconsin, aux États-Unis18. Dans le sud de l’Oural (Russie), la profondeur à laquelle le doryphore s’enfouit pour hiverner est de l’ordre de 5 à 30 cm (réf. 20). Il est à noter que le taux de survie des insectes n’est pas toujours corrélé positivement à une augmentation de la profondeur d’hivernage1. En effet, lors d’une expérience d’hivernage sur le terrain en Estonie6, il a été démontré que le taux de survie du doryphore était plus élevé à une profondeur de 30 cm qu’à une profondeur de 50 cm. Ces auteurs suggèrent que cette découverte pourrait être due au manque d’oxygène. Des données similaires ont été obtenues lors d’une expérience sur le terrain dans le Wisconsin, aux États-Unis 18 : le taux de survie le plus élevé (51,5 %) des doryphores hivernants a été enregistré à une profondeur de15 à 25 cm. Dans le même temps,18 % de mortalité du coléoptère ont été notés à une profondeur de 25 à 35 cm. Nous pensons qu’une profondeur de 40 cm est suffisante pour des expériences dans la zone tempérée parce que le pourcentage de coléoptères survivants était élevé et que le gel du sol ne s’étendait pas sur toute la profondeur de la cage. La présence d’un manteau neigeux contribue à un moindre refroidissement du sol. Si nécessaire, l’épaisseur du manteau neigeux au-dessus de la surface des cages peut être ajustée.
Un autre point clé du protocole est la possibilité que le doryphore ne soit pas suffisamment prêt à hiverner en raison d’une faible quantité d’éléments nutritifs stockés. Certains doryphores adultes sont demeurés à la surface du sol après que les coléoptères se soient enfouis massivement dans le sol. Il est possible qu’ils n’aient pas stocké suffisamment de graisse car le succès de l’hivernage dépend aussi de la quantité de nutriments accumulés21. De plus, lorsque les cages ont été retirées du sol en hiver, certains coléoptères étaient gelés à la surface du sol ou dans la couche près de la surface. Peut-être s’agissait-il des coléoptères qui n’avaient pas assez d’énergie pour s’enfouir en raison de la malnutrition, d’infections ou d’autres facteurs dommageables. Lashomb et al.13 ont noté lors d’expériences sur des doryphores hivernants que ~15 % des adultes ne s’enfouissaient pas dans le sol pour hiverner. Ces auteurs n’en ont pas discuté les raisons. Dans tous les cas, il est nécessaire de fournir suffisamment de nourriture aux coléoptères.
Selon les objectifs de l’étude, il peut être nécessaire de maintenir les coléoptères en état d’hibernation après leur prélèvement dans le sol. À cette fin, la température du laboratoire doit être fraîche et les coléoptères doivent être immédiatement placés dans des conditions de 0 à 2 °C après l’extraction du sol. Il a été observé dans nos travaux qu’en automne et au printemps, les doryphores commencent presque immédiatement leur activité locomotrice après avoir été excavés du sol ; Ce processus se déroule beaucoup plus lentement au milieu de l’hiver.
Cette étude n’a pas pris en compte les entomopathogènes et les parasitoïdes en mouvement actif. Nous avons utilisé un géotextile comme barrière supplémentaire contre la propagation du doryphore. Notez qu’un géotextile ne doit pas être utilisé dans la recherche sur les entomopathogènes en mouvement actif (par exemple, les nématodes entomopathogènes), les prédateurs ou les parasitoïdes, car cela les empêcherait de se déplacer à travers lui.
Il est important de souligner que les études sur l’immunité et les maladies du doryphore sont principalement menées pendant les phases d’alimentation active. Les stades de repos sont moins étudiés et ont été examinés principalement dans des conditions de laboratoire. Dans ces conditions, cependant, il est difficile de simuler les fluctuations de température, d’humidité et d’aération qui se produisent dans les sites de reproduction naturels. Il est donc préférable d’effectuer des expériences sur le terrain22. Pour déterminer les causes de la mortalité hivernale des doryphores dans les champs au cours des différentes périodes d’hibernation, il est nécessaire d’extraire du sol les coléoptères hivernants. Des études sur l’hivernage du doryphore dans des conditions naturelles ont été menées activement dans les années 1970 et 1980. Les méthodes décrites dans ces articles consistent principalement à collecter et à dénombrer les individus qui émergent au printemps 13, à évaluer l’efficacité de l’utilisation de champignons entomopathogènes 14,15,16 ou de nématodes entomopathogènes15 avant l’hivernage, et à prélever des coléoptères hivernants dans le sol au printemps et à l’automne pour déterminer la mortalité hivernale naturelle 17. Dans le même temps, les tailles et les formes des cages utilisées dans ces expériences variaient de 20×20 cm à 90×90×90 cm (réf.13) ou 180×60×30 cm (réf.18). Il convient de souligner que les études susmentionnées n’avaient pas pour but de développer la méthodologie pour l’hivernage des doryphores avec la possibilité de collecter des insectes en hiver. Contrairement aux méthodes existantes, la technique décrite dans cet article permet d’étudier les populations naturelles de doryphores en période de neige.
En conclusion, la méthode proposée permet aux chercheurs d’obtenir le nombre souhaité d’individus hivernant dans des conditions naturelles avec une mortalité relativement faible des insectes et à faible coût. L’étude des divers aspects de l’hibernation du doryphore est essentielle, tant du point de vue de la recherche fondamentale que du point de vue appliqué, afin d’améliorer les approches de lutte contre ce ravageur. Cette technique peut être adaptée à d’autres espèces d’insectes hivernant dans le sol. Les futurs chercheurs pourraient appliquer cette méthode pour étudier la physiologie générale et la biochimie, y compris l’immunité des phases d’hivernage, de diverses espèces d’insectes. De plus, cette méthode peut être utilisée pour prédire l’abondance des ravageurs d’intérêt, sur la base de leur mortalité hivernale.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions nos collègues Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova et Oksana Tomilova pour leur aide dans l’organisation et l’exécution des procédures sur le terrain et en laboratoire.
La recherche a été soutenue par la Fondation russe pour la science, projet n° 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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