Summary
Aquí presentamos un método para estudiar la hibernación del escarabajo de la papa de Colorado en las condiciones naturales de la zona templada, así como una técnica para recolectar escarabajos en invierno. Este método permite obtener un número deseado de individuos invernantes para diversos análisis en cualquier etapa de la hibernación.
Abstract
Una de las principales plagas de la papa Solanum tuberosum L. en la zona templada es el insecto escarabajo de la papa de Colorado (CPB). La mayoría de los estudios sobre la inmunidad y las enfermedades de la CEC se realizan durante las etapas activas de alimentación. Sin embargo, hay menos estudios sobre las etapas de reposo, aunque estos escarabajos pasan la mayor parte de su ciclo de vida en un estado de diapausa invernal (hibernación). En este trabajo, se desarrolló y probó un método para investigar la hibernación de CPB en condiciones naturales, ofreciendo la oportunidad de recolectar un número suficiente de individuos en invierno. En este artículo se evaluó la supervivencia de la CEC y se identificaron agentes infecciosos en diferentes etapas de hibernación. La mortalidad por CEC aumentó durante la hibernación, alcanzando un máximo en abril-mayo. De los insectos muertos se aislaron hongos entomopatógenos (Beauveria, Isaria y Lecanicillium) y bacterias Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas y Serratia . La tasa de supervivencia de los escarabajos durante todo el período de hibernación fue del 61%. No se encontraron escarabajos congelados o disecados, lo que indica el éxito del método presentado.
Introduction
El escarabajo de la papa de Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) es una plaga importante de las plantas de solanáceas, predominantemente de la papa Solanum tuberosum L. El área de distribución geográfica de esta especie es de más de 16 millones dekm2 y se expande constantemente1. El CPB tiene diapausa invernal facultativa y la hibernación es obligatoria en la zona templada. La diapausa es inducida por un fotoperiodo de día corto y modulada por la temperatura1. Estos escarabajos pasan el invierno en la etapa adulta excavando en el suelo. Con el aumento de las latitudes, la duración del período de hibernación se extiende. En la zona templada, especialmente en los territorios septentrionales de su área de distribución, la hibernación dura hasta 9 meses: desde agosto-septiembre hasta mayo-junio (Noskov et al., observaciones personales). Durante este período, el CPB, al igual que cualquier otro insecto en la zona templada, está expuesto a condiciones invernales desfavorables y debe aumentar su tolerancia al frío. Al mismo tiempo, el contacto de los escarabajos con el suelo aumenta el riesgo de infección por diversos microorganismos oportunistas y patógenos2. Por lo tanto, estos escarabajos necesitan mantener un cierto nivel de actividad del sistema inmunológico durante la hibernación, lo que también es energéticamente costoso. No obstante, incluso si el insecto sobrevive a una infección, la enfermedad puede reducir su resistencia alfrío. Cabe señalar que la baja temperatura no es la única razón de mortalidad invernal de la CEC. La falta de oxígeno también juega un papel importante y, en algunas condiciones, podría ser el principal factor de mortalidad invernal 4,5.
Se sabe que la mortalidad natural invernal del CPB puede ser muy alta, llegando al 100% en suelos franco arcillosos6. Por lo tanto, la hibernación es uno de los períodos más cruciales en el ciclo de vida del CPB. Sin embargo, los datos sobre la fisiología, la actividad del sistema inmunitario, la supervivencia y otros parámetros de la hibernación de la CEC en condiciones naturales siguen siendo limitados. Existen estudios sobre la expresión génica diferencial y diversos parámetros fisiológicos en adultos con CEC durante la diapausa y en respuesta al choque frío 7,8,9,10,11,12; Sin embargo, estos análisis se han llevado a cabo principalmente mediante la inducción de diapausa o estrés por frío en condiciones de laboratorio sin fluctuaciones naturales de temperatura, humedad y carga patógena nativa. No obstante, la investigación sobre la fisiología de estos escarabajos recolectados por excavación del suelo en condiciones naturales es importante. En las décadas de 1970 y 1980 se estudiaron activamente diferentes aspectos de la hibernación de la CPB en condiciones naturales 13,14,15,16,17,18. Por otro lado, estos estudios no involucraron la excavación de CPB del suelo en invierno. Además, no se proporciona en detalle una técnica para la hibernación controlada del CEC ni una descripción de las jaulas. Por lo tanto, es necesario investigar la fisiología de los CEC que hibernan en entornos naturales19.
El objetivo de este estudio fue desarrollar y probar un método para la hibernación controlada de adultos de CEC en condiciones naturales. El método propuesto permite obtener un número deseado de individuos de CEC para ensayos microbiológicos, inmunológicos y de otro tipo durante la hibernación en condiciones de campo de un clima continental. Este método se puede adaptar y aplicar a otras especies de insectos que pasan el invierno en suelos bajo la nieve.
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Protocol
1. Descripción de las jaulas para hibernación
NOTA: Dependiendo de los objetivos del experimento, el número de jaulas varía. Utilice al menos tres jaulas por fecha de muestreo. Para estimar la cantidad de escarabajos que emergerán, prepare al menos tres jaulas adicionales, que no se sacarán del suelo hasta la primavera.
- Utilice jaulas hechas de un marco de madera rígido con un tamaño de 25 × 25 × 40 cm (largo × ancho × alto).
- Para construir un marco para la jaula, use listones de madera de al menos 2 cm de grosor y 4 cm de ancho.
- Cubra el interior de la jaula con una malla de acero inoxidable que tenga un tamaño de aberturas no mayor de 5 mm × 3 mm. Usa una grapadora de madera para fijar la malla.
- Fije la malla de acero inoxidable al exterior de la parte inferior con la grapadora.
- Forrar el interior de la jaula con un geotextil sintético negro con una densidad de 60 g/m2.
NOTA: El geotextil sirve como una barrera adicional para evitar el escape de los escarabajos. No lo use en experimentos relacionados con entomopatógenos y parasitoides en movimiento activo. - Sujete firmemente un tubo de tela sintética translúcida translúcida de aproximadamente 60 cm de altura a la parte superior de la jaula.
- Cruza y fija dos cuerdas fuertes al fondo de la jaula para sacarla del suelo cuando sea necesario.
2. Instalación de las jaulas
- Cava un hoyo de 40 cm de profundidad en el suelo y coloca la jaula dentro.
- Coloque hierba seca o heno en el hoyo.
- Coloque la jaula adentro de modo que el heno o la hierba seca queden entre las paredes de la jaula y el suelo.
- Llene las jaulas con tierra del mismo campo de papas donde se recolectan los insectos.
- Instale registradores de datos de temperatura y humedad a prueba de agua en las jaulas a las profundidades requeridas.
NOTA: Se pueden utilizar registradores de datos de cualquier fabricante y deben poder funcionar a bajas temperaturas. - Plante plántulas de papa dentro de cada jaula 3-4 semanas antes de la introducción de los escarabajos y riéguelas moderadamente.
- Fija un tubo de tela sintética verticalmente a un palo de cualquier material instalado en el exterior de la jaula.
3. Cría de insectos antes de la hibernación
- Recoja manualmente los escarabajos adultos en los campos de papa libres de pesticidas hacia el final de la vegetación de papa.
NOTA: Los escarabajos adultos difieren sustancialmente de las larvas y se caracterizan por élitros rayados, mientras que las larvas son rojas. - Mantenga los escarabajos recolectados en cubos de plástico de 15-20 L (200 individuos como máximo por cubo) que contengan puntas de patata para alimentar a los insectos antes de colocarlos en las jaulas.
- Cubre los cubos con tela transpirable.
NOTA: No guarde los insectos en cubos durante más de 12 h. Use puntas de papa lo suficientemente grandes para evitar la acumulación de escarabajos en el fondo de los baldes. - Coloque no más de 200 individuos de CPB en las plantas de papa cubiertas con la malla de tela sintética.
- Cuando se consuman las puntas de las papas, agregue las frescas colocadas en un frasco de plástico que contenga agua y luego cambie las puntas de las papas diariamente.
NOTA: Para fijar los tallos en un frasco, use algodón y parafilm. Revise cuidadosamente los tallos viejos en busca de escarabajos cuando los retire. - Una vez que todos los escarabajos estén enterrados en el suelo para pasar el invierno, desate el tubo de tela sintética del palo y coloque la tela en el suelo.
4. Recolección de insectos durante la temporada de invierno
- Quita la nieve por encima de la superficie de la jaula.
- Afloja la jaula a cada lado con una pala fuerte.
- Saca la jaula de la tierra con las cuerdas.
- Lleva la jaula al laboratorio.
NOTA: Dependiendo de los objetivos del experimento, es posible que los escarabajos que hibernan tengan que estar inactivos antes del análisis. En este caso, la temperatura en el laboratorio durante el aislamiento de los escarabajos del suelo debe ser de ~2-5 °C. - Retire la tierra de la caja en porciones pequeñas, rompa con cuidado los trozos grandes de tierra y aísle a los escarabajos con pinzas.
- Separe los escarabajos vivos de los cadáveres. Los escarabajos vivos y sanos crean un suelo compacto a su alrededor, formando una cavidad de aire (la llamada cuna) y, por lo tanto, se separan fácilmente del suelo. Los escarabajos muertos por hongos están momificados o tienen micelio visible en la superficie. Los insectos en descomposición bacteriana son oscuros.
- Tamiza la tierra a través de un colador para asegurarte de que todos los escarabajos estén aislados y no dañados.
- Coloque los cadáveres con síntomas de infección fúngica o descomposición bacteriana en un tubo de centrífuga estéril individual de 15 ml para su futura identificación.
- Almacenar los escarabajos vivos en un refrigerador a una temperatura de 0-2 °C hasta su análisis en un recipiente cerrado y ventilado que contenga una bola de algodón húmeda.
5. Preparación de muestras de órganos y tejidos
- Para recolectar la hemolinfa, haga una punción en la parte lateral del abdomen debajo de los élitros con una aguja de insulina.
NOTA: Durante la hibernación, la cantidad de hemolinfa se reduce significativamente, lo que dificulta la recolección de este líquido. - Para aislar el intestino, corte la cápsula de la cabeza, exprima todo el contenido en una placa de Petri con tampón de fosfato, separe el intestino y límpielo de grasa y vasos de Malpighi.
- Separe una sección deseada del intestino, como el intestino anterior, el intestino medio o el intestino posterior.
- Para aislar el cuerpo graso, sepárelo de otros tejidos después del aislamiento del intestino.
NOTA: Los tejidos aislados se pueden utilizar para medir la actividad de las enzimas antioxidantes y desintoxicantes (un ejemplo: Figura suplementaria 1), el análisis de la regulación de los genes de la vía de señalización inmunitaria (un ejemplo: Figura suplementaria 2) o el metabarcoding del contenido intestinal de los insectos, etc.
6. Aislamiento de microorganismos de los cadáveres
- Para aislar los hongos entomopatógenos de los cadáveres, coloque los insectos momificados en una cámara de humedad estéril.
- Utilice conidios aéreos (si están disponibles) o esclerocios del contenido interno de los escarabajos para colocar en agar dextrosa Sabouraud con ácido láctico al 0,4%.
NOTA: Use escarabajos con micelio y conidios para enchapar inmediatamente (sin colocarlos en cámaras de humedad). - Aísle las bacterias de los cadáveres con síntomas de descomposición bacteriana.
- Cortar la cabeza de un escarabajo, exprimir el contenido interno y recogerlo en tubos para su posterior colocación en medios para bacterias (agar Luria-Bertani, agar endo y agar esculina biliar).
NOTA: Utilice microscopía y métodos moleculares para identificar géneros y especies de los patógenos. Si es necesario, se puede realizar un análisis para detectar la presencia de otros parásitos.
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Representative Results
Los siguientes resultados sobre los CPB que hibernan muestran la temperatura del suelo, la supervivencia y las infecciones.
Dinámica de la temperatura del suelo.
Se registraron temperaturas bajo cero en las jaulas a una profundidad de 30 cm desde finales de noviembre hasta principios de abril (Figura 1). La temperatura media durante este período fue de -3,3 ± 0,1 °C (media ± error estándar). La temperatura más baja registrada fue de -7,9 °C a mediados de febrero.
Supervivencia de los CPB invernantes.
La mortalidad de los insectos se observó durante la hibernación y alcanzó un máximo en primavera antes de la emergencia. El número inicial de escarabajos fue de 2000, de los cuales 1470 individuos sobrevivieron a finales de mayo. La tasa de supervivencia de los escarabajos durante la hibernación fue del 61% (Figura 2).
Infecciones en CEC hibernantes.
Un análisis de 530 escarabajos muertos mostró que durante el período de hibernación, el 53% de ellos tenía síntomas de descomposición bacteriana y el 25% tenía síntomas de infecciones fúngicas (Figura 3). Beauveria dominó (45 aislados) entre los cultivos aislados de hongos entomopatógenos. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) y Lecanicillium fueron mucho menos comunes (dos aislados cada uno). Entre las bacterias aisladas de los cadáveres con síntomas de descomposición bacteriana (n = 30), se identificaron especies pertenecientes a los géneros Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella y Glutamicibacter (Tabla Suplementaria 1).
Figura 1: Dinámica de la temperatura del suelo. Dinámica de la temperatura del suelo medida por un registrador de datos de temperatura a prueba de agua instalado a una profundidad de 30 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Supervivencia de escarabajos de la papa de Colorado que hibernan en diferentes períodos de hibernación. Las jaulas fueron excavadas y los escarabajos supervivientes y muertos se contaron en noviembre, enero, abril y mayo. Las barras representan el número de escarabajos supervivientes. Los bigotes indican un error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Infecciones en cadáveres de escarabajos de la papa de Colorado que hibernan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Materiales complementarios: Haga clic aquí para descargar los archivos complementarios a continuación.
Figura complementaria 1. Actividad de esterasas inespecíficas en el intestino medio de la CEC durante la hibernación. Los bigotes denotan un error estándar. Diferentes letras indican diferencias significativas entre puntos temporales (prueba de Dunn, P < 0,05).
Figura complementaria 2: Alteraciones de la expresión del factor de transcripción NFkB (vía IMD) en el intestino y el cuerpo graso del CEC durante la hibernación. Los datos se presentan como cambios en el pliegue en relación con un punto de tiempo de agosto. Rp4, Rp18 y Arf19 se utilizaron como genes de referencia. Los bigotes muestran un error estándar.
Tabla suplementaria 1: Identificación putativa de secuencias del gen 16S rRNA (~800 pb) de bacterias aisladas de un CEC muerto durante la hibernación.
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Discussion
Este estudio muestra que el método propuesto para el estudio de la hibernación de los CPB permite obtener un número suficiente de insectos en diferentes períodos de hibernación. El éxito de la técnica presentada depende de varios factores independientes, el más importante de los cuales son las condiciones climáticas. En un invierno frío y sin nieve, el suelo puede congelarse hasta la profundidad total de la jaula. En este caso, el riesgo de muerte de todos los escarabajos aumenta significativamente18. La supervivencia del escarabajo depende de una combinación de muchos factores, que pueden variar significativamente de un año a otro6.
En el experimento, la temperatura del suelo dentro de las jaulas durante el invierno no cayó por debajo de -7,9 °C. No se observó hielo a una profundidad superior a 25 cm, y el suelo permaneció suelto incluso durante el período de mayor enfriamiento (enero-febrero). La mayoría de los escarabajos se acumulaban en la parte inferior de cada jaula, a una profundidad de 30-40 cm. Los escarabajos podrían haber excavado más profundamente con una mayor profundidad de las jaulas. Por otro lado, aumentar la profundidad de la jaula conduciría a un aumento de peso, lo que dificultaría la extracción de la jaula del suelo, especialmente en invierno. Además, de acuerdo con nuestras observaciones en campos de papa de la región en estudio, el CPB no excava más de 35 cm de profundidad para la hibernación. Este hallazgo puede explicarse por la capa de suelo arcilloso a una profundidad de 30-35 cm, que los escarabajos no pueden superar. En nuestro experimento, se utilizó suelo arenoso y arcilloso del horizonte superior de 30 cm. Esta es probablemente la razón por la que los escarabajos fueron capaces de excavar más profundamente que en condiciones naturales. La profundidad a la que hiberna el CPB suele ser de 10 a 25 cm (ref. 1), pero esto puede variar entre regiones geográficas. Por ejemplo, en el noreste de los Estados Unidos (Nueva Jersey), la mayoría de los escarabajos hibernan a una profundidad de 10-13 cm (ref. 13). También se han documentado profundidades de hibernación similares de escarabajos (≤15 cm) en Wisconsin, EE.UU.18. En el sur de los Urales (Rusia), la profundidad a la que se esconde el CPB para pasar el invierno está en el rango de 5-30 cm (ref. 20). Cabe señalar que la tasa de supervivencia de los insectos no siempre se correlaciona positivamente con un aumento en la profundidad de hibernación1. De hecho, en un experimento de hibernación de campo en Estonia6, se demostró que la tasa de supervivencia de la CPB era mayor a una profundidad de 30 cm que a una profundidad de 50 cm. Estos autores proponen que este hallazgo puede deberse a la falta de oxígeno. Datos similares se obtuvieron en un experimento de campo en Wisconsin, EE.UU.18: la tasa de supervivencia más alta (51,5%) de los CEC invernantes se registró a una profundidad de 15-25 cm. Al mismo tiempo, se observó una mortalidad del 18,100% del escarabajo a una profundidad de 25-35 cm. Creemos que una profundidad de 40 cm es suficiente para los experimentos en la zona templada porque el porcentaje de escarabajos supervivientes era alto y la congelación del suelo no se extendía a toda la profundidad de la jaula. La presencia de una capa de nieve contribuye a un menor enfriamiento del suelo. Si es necesario, se puede ajustar el grosor de la capa de nieve sobre la superficie de las jaulas.
Otro punto clave en el protocolo es la posible preparación insuficiente de la CPB para la hibernación debido a una pequeña cantidad de nutrientes almacenados. Algunos CPB adultos permanecieron en la superficie del suelo después de la excavación masiva de los escarabajos en el suelo. Es posible que no almacenaran suficiente grasa porque el éxito de la hibernación depende también de la cantidad de nutrientes acumulados21. Además, cuando las jaulas se retiraron del suelo en el invierno, algunos de los escarabajos estaban congelados en la superficie del suelo o en la capa cercana a la superficie. Tal vez estos eran los escarabajos que no tenían suficiente energía para excavar debido a la desnutrición, infecciones u otros factores dañinos. Lashomb et al.13 observaron en experimentos con la hibernación de CPB que ~15% de los adultos no excavaban en el suelo para pasar el invierno. Esos autores no discutieron las razones. En cualquier caso, es necesario proporcionar suficiente alimento a los escarabajos.
Dependiendo de los objetivos de un estudio, puede ser necesario mantener a los escarabajos en un estado de hibernación después de recolectarlos del suelo. Con este fin, la temperatura del laboratorio debe ser fresca y los escarabajos deben colocarse inmediatamente en condiciones de 0-2 °C después de la extracción del suelo. Se observó en nuestro trabajo que en otoño y primavera, los CPB inician casi inmediatamente la actividad locomotora después de ser excavados del suelo; Este proceso se lleva a cabo mucho más lentamente en pleno invierno.
Este estudio no tuvo en cuenta los entomopatógenos y parasitoides en movimiento activo. Utilizamos un geotextil como barrera adicional contra la propagación del CPB. Tenga en cuenta que un geotextil no debe usarse en la investigación sobre entomopatógenos en movimiento activo (por ejemplo, nematodos entomopatógenos), depredadores o parasitoides porque impedirá su movimiento a través de él.
Es importante señalar que los estudios sobre la inmunidad y las enfermedades de la CEC se realizan principalmente durante las etapas activas de alimentación. Las etapas de reposo están menos investigadas y se han examinado principalmente en condiciones de laboratorio. En estas condiciones, sin embargo, es difícil simular las fluctuaciones de temperatura, humedad y aireación que se producen en los criaderos naturales. Por lo tanto, los experimentos de campo son preferibles22. Para determinar las causas de la mortalidad invernal por CPB en el campo en diferentes períodos de hibernación, es necesario excavar escarabajos invernantes del suelo. En los decenios de 1970 y 1980 se llevaron a cabo activamente estudios sobre la hibernación de CPB en condiciones naturales. Los métodos descritos en estos trabajos consisten principalmente en recolectar y contar individuos que emergen en primavera 13, evaluar la efectividad del uso de hongos entomopatógenos 14,15,16 o nematodos entomopatógenos15 antes de invernar, y recolectar escarabajos invernantes del suelo en primavera y otoño para determinar la mortalidad natural invernal 17. Al mismo tiempo, los tamaños y formas de las jaulas utilizadas en esos experimentos variaron de 20×20 cm a 90×90×90 cm (ref.13) o 180×60×30 cm (ref.18). Cabe señalar que los estudios mencionados no tuvieron como objetivo desarrollar la metodología para la hibernación de CPB con la posibilidad de recolectar insectos en invierno. A diferencia de los métodos existentes, la técnica descrita en este artículo permite investigar las poblaciones naturales de CPB en un período de nieve.
En conclusión, el método propuesto permite a los investigadores obtener el número deseado de individuos de CPB hibernantes en condiciones naturales con una mortalidad relativamente baja de los insectos y a un bajo costo. La investigación de diversos aspectos de la hibernación de la CEC es esencial tanto desde el punto de vista de la investigación básica como desde el punto de vista aplicado: para mejorar los enfoques para el control de esta plaga. Esta técnica se puede adaptar a otras especies de insectos que hibernan en el suelo. Los investigadores futuros pueden aplicar este método para estudiar la fisiología general y la bioquímica, incluida la inmunidad de las fases de hibernación, de varias especies de insectos. Además, este método se puede utilizar para predecir la abundancia de plagas de interés, en función de su mortalidad invernal.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a nuestros colegas Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova y Oksana Tomilova por su ayuda en la organización y ejecución de los procedimientos de campo y laboratorio.
La investigación fue apoyada por la Fundación Rusa para la Ciencia, proyecto No. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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