Summary
该协议提出了一种用于生产转基因大鼠模型的优化方法。腺相关病毒 （AAV） 用于递送 DNA 修复模板，电穿孔用于递送 CRISPR-Cas9 试剂以完成 2 细胞胚胎的基因组编辑过程。
Abstract
基因组编辑技术被广泛用于生产转基因动物，包括大鼠。DNA修复模板和CRISPR-Cas试剂的细胞质或原核注射是最常见的胚胎递送方法。然而，这种类型的显微操作需要使用专门的设备，很费力，并且需要一定程度的技术技能。此外，由于胚胎上的机械应力，显微注射技术通常会导致胚胎存活率降低。在该协议中，我们开发了一种优化的方法，以提供大型DNA修复模板，以与CRISPR-Cas9基因组编辑结合使用，而无需显微注射。该协议结合了单链DNA供体模板的AAV介导的DNA递送以及通过电穿孔递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）以修饰2细胞胚胎。使用这种新颖的策略，我们成功地生产了靶向敲入大鼠模型，该模型携带1.2至3.0 kb大小的DNA序列插入，效率在42%至90%之间。
Introduction
基于CRISPR的基因组编辑工具的发展加速了我们高效生成新的、更复杂的基因工程大鼠模型的能力。单向导 RNA 与 Cas9 核酸酶结合形成核糖核蛋白 （RNP） 复合物，靶向基因组中感兴趣的 DNA 序列并导致双链 DNA 断裂。由于细胞DNA修复机制容易出错，因此在修复过程中会引入插入和缺失（INDELs），从而破坏靶基因的功能。当所需的工程化 DNA 序列（修复模板）与基因组编辑试剂共同递送时，修复模板通过称为同源定向修复 （HDR） 的过程插入包含双链 DNA 断裂的区域。这是生成具有靶向DNA插入/替换（敲入）的动物模型的有效策略。一个局限性是敲入序列通常尺寸很大，这已被证明会降低基因编辑效率，从而使生成所需模型更加困难1。提高敲入效率的策略包括双链 DNA （dsDNA） 和单链 DNA （ssDNA） 修复模板的线性化以及 DNA 修复模板的化学修饰 2,3,4。此外，已经尝试了前核显微注射以及HDR刺激化合物，将电脉冲与显微注射相结合，以及定时显微注射到2细胞胚胎中5,6,7。尽管其中一些方法取得了成功，但掺入大于 1.0 kb 的 DNA 序列在技术上仍然具有挑战性。
电穿孔是将试剂引入培养细胞系的常用方法，它提供了一种将 CRISPR-Cas9 成分递送至胚胎的显微注射替代方案。胚胎电穿孔首次在大鼠胚胎中得到证实8，此后已成功用作小鼠9,10,11,12,13，猪14,15和其他动物模式生物16,17,18的递送方法.将悬浮在含有CRISPR-Cas9试剂的培养基中的胚胎放入比色皿或两个电极之间的载玻片上，并受到电流的直接脉冲。这会在透明带和胚胎质膜中产生瞬时开口，CRISPR-Cas9成分通过这些开口进入胚胎。通常，中级电“孔”脉冲用于创建临时开口，然后是较低级别的电“传输脉冲”，以促进带负电荷的基因组编辑组件的移动。胚胎电穿孔效率高，通量高，易于执行。然而，虽然胚胎电穿孔已被证明在引入小 （<200 bp） ssDNA 修复模板方面非常成功，但很少有关于成功电穿孔较大 （>1.0 kb） 修复模板的报道 13,19。这种尺寸限制代表了胚胎电穿孔在生成需要大插入的敲入动物模型方面的主要局限性。
在基因治疗的背景下，腺相关病毒 （AAV） 长期以来一直被用作传递遗传物质的载体，因为它们对分裂和非分裂细胞都具有有效的体内感染性、缺乏致病性和罕见的基因组整合20,21。最近，越来越多的研究将 AAV 与 CRISPR-Cas9 技术相结合，引入了 DNA 修复模板和 CRISPR 试剂 22,23,24。这种方法允许在不需要显微注射技术的情况下提供更大的DNA修复模板。
HDR 通路在细胞周期的晚期 S 和 G2 期更为活跃25,26。在体外进行的研究中，通过将 CRISPR-Cas9 RNP 和 DNA 修复模板递送至 G2 同步细胞或使用 Cas9-Geminin 融合蛋白2 将 Cas9 蛋白的存在限制在晚期 S 期和 G2 期，实现了敲入效率的显着提高。此外，在 2 细胞阶段胚胎的延长 G2 期期间发生主要的合子基因组激活 （ZGA） 事件，这与开放染色质状态有关。据推测，这为CRISPR-Cas9 RNP和修复模板提供了对基因组DNA的更大可及性。
我们的目标是在所有这些观察结果的基础上，将AAV方法与胚胎电穿孔相结合，在胚胎发育的2细胞阶段引入CRISPR-Cas9 RNP。该策略利用了AAV更大的DNA修复模板递送能力，电穿孔的技术易用性以及胚胎发育过程中基因组可及性的最佳2细胞时间点，为DNA插入的靶向基因工程创造了一种有效的方法。正如本方案所强调的，我们优化的方法允许生产靶向敲入大鼠模型，该模型携带插入的DNA序列从1.2到3.0 kb大小，而无需显微注射技术。
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Protocol
所有实验程序均由密苏里大学机构动物护理和使用委员会（ACUC 协议 #25580）批准，并按照《实验动物使用和护理指南》中规定的指南进行。
1. AAV 介导的 DNA 修复模板递送
- 设计 DNA 构建体以在两个同源臂之间包含所需的敲入序列。典型的同源臂长度为 300-500 bp。通过克隆到适当的质粒骨架并包装到重组 ssAAV1 或 ssAAV6（血清型 1 或 6）中，确保整个 DNA 修复模板（同源臂 + 所需的敲入序列）两侧有倒置末端重复序列 （ITR）。
注意：如果 sgRNA 靶序列存在于 DNA 修复模板中，则重要的是设计沉默突变以破坏该序列，从而阻止 CRISPR-Cas9 介导的正确靶向等位基因的编辑。
注意：重组 AAV 病毒载体是非整合的，分类为 BSL-1。标准无菌技术用于移液和处理暴露于病毒的胚胎。 - 将工程化的 ssAAV1 或 ssAAV6（用 DNA 修复模板包装）加入 30 μL KSOM-R 培养基27,28 中，在矿物油下在 35 mm 培养皿中达到 3 ×10 7 个基因组拷贝 （GC）/μL 的终浓度。
- 将具有可见原核的受精卵放入含有工程化 ssAAV 的 KSOM-R 培养基中。
注意：使用此方案，无需稀释透明带，因为AAV血清型1和6能够轻松通过以进行有效的DNA修复模板递送。 - 在37°C下用5%CO2 和最大湿度孵育18-20小时，以允许足够的病毒转导。
2.电穿孔准备
- 第二天，在无菌 RNase 管中制备含有 100 ng/μL sgRNA 和 100 ng/μL Cas9 蛋白的电穿孔混合物，这些蛋白在 Opti-MEM 培养基中稀释。轻轻混合。
- 在室温下孵育 10 分钟以形成 RNP。
- 在孵育期间，打开电穿孔仪并将引线连接到 1.5 mm 间隙的载玻片电极。
- 如 表1所示设置电穿孔参数。
3. 2细胞胚胎电穿孔
- 在载玻片上的两个电极之间轻轻移液 5 μL CRISPR 电穿孔混合物，注意不要将气泡引入溶液中。
- 从AAV溶液中取出2细胞期胚胎。将 2 细胞阶段的胚胎排列在混合物中，不允许它们接触电极的侧面。这样做是为了避免裂解。
- 按 欧姆 按钮测量阻抗。检查以确保阻抗介于 0.100 和 0.300 kΩ 之间。反应体积将改变阻抗（增加体积以降低阻抗，减去体积以增加阻抗）。
- 按 开始。该过程只需几秒钟即可完成。
- 电穿孔后立即取出胚胎，并在新鲜的30μL KSOM-R培养基中洗涤3次。
- 将胚胎放回37°C培养箱中，在矿物油下放入500μL KSOM-R培养基中，在500μL KSOM-R培养基中进行体外培养。或者，通过手术将胚胎移植到后 1.5 天 （dpc） 假怀孕雌性大鼠以产生活体后代。
图 1：用于 CRISPR-Cas9 基因组编辑的 AAV 介导的 DNA 递送和 2 细胞胚胎电穿孔管道示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
根据该方案，在用 CRISPR-Cas9 RNP 电穿孔 2 细胞胚胎后，AAV 介导的 DNA 修复模板的有效递送允许高效的 HDR。如视频所示，成功的电穿孔过程会导致每个电极上形成气泡（图2C），阻抗保持在0.100和0.300 kΩ范围内。电穿孔后，胚胎肿胀填充透明带内的卵黄周围空间的情况并不少见（图3）。这种肿胀应该在培养数小时后消退。在电穿孔2细胞胚胎后，出现一小部分（高达20%）的细胞融合事件也并不少见（图3）。通过仔细的水平轴对齐而不是电极之间的垂直轴对齐，可以避免细胞融合（图2B）。然而，我们通常只是在电穿孔过程后丢弃任何融合的胚胎。
我们使用 2 细胞胚胎 CRISPR-Cas9 RNP 电穿孔技术进行的 AAV 介导的 DNA 递送已被证明对于生成具有靶向插入的敲入大鼠模型非常有效。在大鼠胚胎中测试我们的方法，并筛选培养的囊胚以插入含有loxP位点的工程化短人工内含子，我们注意到超过60%的囊胚含有基于下一代序列（NGS）分析的正确靶向敲入等位基因（图4）。此外，为了测试我们生产活敲入大鼠的方法，我们设计了一个项目来设计针对大鼠 Drd2 基因的 ATG 起始位点的 Cre 重组酶编码序列。AAV 包装的 DNA 供体模板包括 AAV 包装所需的 ITR 序列、一个 5' 同源臂（长度为 422bp）、一个 Cre-pA 序列（长度为 1,339bp）和一个 3' 同源臂（长度为 477bp）（图 5A）。在出生的 11 个后代中，10 个通过 PCR 分析对正确插入大鼠 Drd2 的 ATG 起始位点的 Cre-pA 序列呈阳性（图 5B-D）。后来通过DNA序列分析证实了靶向插入。作为对 7 个不同项目的总结，我们通过对同源臂连接的 PCR 分析和 DNA 序列验证确定，在创始人动物中实现了 76% 的平均敲入成功率（表 2）。
| 电压 [V] | 脉冲长度 [msec] | 脉冲间隔 [msec] | # 脉冲 | 衰减率 [%] | 极性 | |
| Poring Pulse | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| 传输脉冲 | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
表 1：电穿孔参数。 确保在电穿孔过程中电流限制为导通。
图2：2细胞胚胎电穿孔过程。 （A） 载玻片电极。（B） 将胚胎悬浮在 CRISPR-Cas9 基因组编辑试剂中，并在电穿孔前加载到载玻片电极中。（C）电穿孔过程中各电极上形成气泡。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：电穿孔后的胚胎外观。 电穿孔后，多达 20% 的 2 细胞胚胎发生细胞融合。胚胎细胞也可以在透明带内膨胀，填充卵黄周围空间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：培养大鼠囊胚中 AAV 介导的 DNA 递送和 2 细胞胚胎电穿孔敲入效率。 数据以下一代测序 （NGS） 检测正确敲入等位基因阳性的囊胚百分比表示。N=28 个囊胚（仅培养对照组）、N=37 个囊胚（仅电穿孔 （EP） 对照组）和 N=35 个囊胚（AAV+EP 组）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：创建 Drd2-Cre 敲入式大鼠模型。（A）靶向大鼠Drd2基因。RNP 复合物设计用于靶向包含编码区起始位点的外显子 2。AAV 供体模板包含病毒反向末端重复序列 （ITR）、5' 和 3' Drd2 基因同源臂 （HA） 以及具有 polyA 序列的 Cre 基因。供体模板的成功整合将 Cre 基因 3' 敲入外显子 2 内的起始位点。这使 Cre 基因处于 Drd2 启动子的控制之下，同时敲除 Drd2 基因。用于确认成功敲入的PCR引物的位置用紫色箭头表示。（B） 潜在基因组编辑动物（泳道 B10-C8）的 PCR 分析，引物跨越 5' 同源臂。泳道C9：野生型（阴性对照）;泳道 C10：无模板（阴性对照）。敲入阳性动物的预期扩增子大小为 601bp。 （C） 潜在基因组编辑动物（泳道 D8-E6）的 PCR 分析，引物跨越 3' 同源臂。泳道E7：野生型;泳道 E8：无模板控制。敲入阳性动物的预期扩增子大小为 676bp。 （D） Cre 基因检测。预期扩增子大小为 381bp。 泳道 C7-D5：潜在创始人;泳道D6：野生型;泳道 D7：无模板控制。使用15bp-3kb比对标记物（以绿色表示）通过毛细管电泳分析PCR反应。QX DNA大小标记显示在每张图像的左侧，峰大小对应于碱基对中的PCR扩增子大小（bp）。该图经参考文献24 许可修改。请点击这里查看此图的较大版本.
| 项目介绍 | 后代敲入阳性 （%） |
| Oprm1-P2A-Flp （1.7 kb 插入） | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre （1.3 kb 插入） | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre（1.3 kb 插入） | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre（插入 1.3 kb） | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre （1.2 kb 插入） | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP（插入 1.4 kb） | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed （3.1 kb 插入） | 5/7 (71%) |
表 2：敲入模型的成功率
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Discussion
CRISPR-Cas基因组编辑系统通过允许在各种动物物种中高效生产直接和复杂的定制基因修饰，彻底改变了基因工程领域。与基因组编辑相关的技术的频繁改进和改进进一步增强了其多功能性。在这里，我们描述了一种使用 ssAAV 介导的 DNA 递送以及将 CRISPR-Cas9 试剂的 2 细胞胚胎电穿孔到 2 细胞啮齿动物胚胎中的新方法。我们已经证明，这是产生靶向敲入式动物模型的有效方法。
使用AAV的一个主要优点是，它可以将更大的DNA修复模板输送到胚胎中，而无需显微注射技术。AAV 介导的递送还有助于在一定程度上规避单独电穿孔的 DNA 模板大小限制。但是，使用 AAV 时有一些重要的注意事项。透明带是受精卵周围的硬化糖蛋白基质，它是一种物理屏障，通常使核酸的输送复杂化。透明带变薄是一种常用技术，用于更好地进入胚胎。然而，一些研究报告说，在 AAV 感染之前透明带变薄的胚胎中，较高剂量（1 × 107 GC/μL 至 1 ×10 9 GC/μL）AAV 感染会阻碍胚胎发育22。然而，有一些血清型的AAV可以扩散到透明带29。我们的方案不涉及透明带变薄，而是使用血清型为 1 和 6 的 AAV，浓度为 3 ×10 7 GC/μl，以实现比以前发表的报告更高的敲入率。在这些条件下，我们没有注意到胚胎发育减少。
通过电穿孔对2细胞胚胎实现的高敲入效率很可能是由于胚胎在这个发育阶段的G2期延长，使其成为进行电穿孔的最佳发育阶段。然而，一个潜在的并发症是在电穿孔过程中观察到的一些 2 细胞胚胎中的细胞融合。这一观察结果并不奇怪，因为电融合程序通常用于融合哺乳动物细胞，并且通过在电极之间仔细地水平而不是垂直轴对齐可以避免融合30,31。此外，当基因组编辑发生在发育的后期阶段（例如2细胞而不是1细胞）时，嵌合体增加的可能性更大。使用我们的 2 细胞电穿孔方法，我们观察到与原核注射相比，嵌合体在 1 细胞阶段略有增加（AAV 方法为 86%，PNI 方法为 67%），但仍然能够在所有测试的创始人动物中实现修饰等位基因的种系传递。另一个潜在的问题是AAV衍生的DNA模板的串联连接体整合的可能性。虽然我们没有对本协议中描述的模型进行长读长测序，但我们确实确认了使用液滴数字PCR（ddPCR）拷贝数变异的所有模型的DNA模板的单一整合。
最后，虽然我们的方法涉及目标DNA序列的AAV递送，但应该可以使用其他病毒和非病毒介导的DNA递送方法与胚胎电穿孔相结合，以成功地对胚胎进行遗传操作。总之，将 ssAAV 介导的 DNA 递送和 CRISPR-Cas9 RNP 的电穿孔结合到 2 细胞期胚胎中是一种高效且易于适应的方法，可有效生成敲入大鼠模型。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者要感谢诺兰·戴维斯（Nolan Davis）在摄像和视频编辑方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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