In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Summary

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

Abstract

Die Entdeckung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) hat sich dramatisch die Werkzeuge zur Verfügung, um Mediziner in der regenerativen Medizin interessiert erhöht. Allerdings hat die direkte Injektion von hESCs, und Zellen aus hES differenziert, in lebende Organismen bisher durch erhebliche Zelltod, Teratom-Bildung und Host Immunabwehr behindert. Das Verständnis der in vivo hESC Verhalten nach der Transplantation erfordert neuartige bildgebende Verfahren in Längsrichtung Monitor hESC Lokalisation, Ausbreitung und Lebensfähigkeit. Die molekulare Bildgebung hat Ermittler einen hohen Durchsatz, kostengünstig und empfindliche Methode für die Verfolgung von in vivo Proliferation über Tage, Wochen und sogar Monate. Dieser Fortschritt hat sich das Verständnis der räumlich-zeitlichen Kinetik hESC Engraftment, Proliferation und Teratom-Bildung in lebenden Probanden erhöht.

Ein wichtiger Fortschritt in der molekularen Bildgebung hat die Ausweitung der nicht-invasiven Reportergen-Assays von Molekular-und Zellbiologie in in vivo multimodalen Bildgebung Plattformen. Diese Reporter-Gene unter der Kontrolle von technischen Promotoren und Enhancer, die die Vorteile der Wirtszelle s Transkriptionsmaschinerie sind in Zellen mit einer Vielzahl von Vektor-und Nicht-Vektor-Methoden eingeführt. Einmal in der Zelle kann Reportergene entweder konstitutiv oder nur unter bestimmten biologischen oder zellulären Bedingungen transkribiert werden, abhängig von der Art des verwendeten Promotor. Transkription und Übersetzung von Reporter-Genen in bioaktive Proteine ​​wird dann mit empfindlichen, nicht-invasive Instrumente (zB CCD-Kameras) mit Signal-Erzeugung Sonden wie D-Luciferin detektiert.

Um zu vermeiden, die Notwendigkeit für exzitatorische Licht zur Gewinnung von Stammzellen in vivo verfolgen, wie es für die Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich, für Biolumineszenz Reportergen Imaging-Systeme nur eine exogen verabreichtes Sonde Lichtemission zu induzieren. Firefly Luciferase aus dem Leuchtkäfer Photinus pyralis abgeleitet, kodiert ein Enzym, das D-Luciferin katalysiert die optisch aktiven Metaboliten, Oxyluciferin. Optische Aktivität kann dann mit einem externen CCD-Kamera überwacht werden. Stabil transduzierten Zellen, dass der Reporter tragen im Rahmen ihrer chromosomalen DNA-Konstrukt passieren das Reporter-Konstrukt DNA auf Tochterzellen, so dass für die Längs-Überwachung hESC Überleben und Proliferation in vivo. Darüber hinaus, weil die Expression des Reportergens Produkt zur Signalerzeugung erforderlich ist, wird einzig gangbare Eltern und Tochterzellen erzeugen Biolumineszenzsignal; apoptotischen oder tote Zellen nicht.

In diesem Video werden die spezifischen Materialien und Methoden für die Verfolgung von Stammzellen die Proliferation und Teratom-Bildung mit Biolumineszenz-Bildgebung erforderlich beschrieben werden.

Protocol

Bau von Double Fusion Reporter Gene Um Biolumineszenz-Bildgebung des menschlichen embryonalen Stammzellen durchzuführen, müssen Sie zunächst Zellen, die stabil exprimieren, einem Luciferase-Reportergen wie Glühwürmchen-Luciferase durch einen konstitutiven Promotor wie Ubiquitin oder EF1A getrieben zu erhalten. Der Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf Reportergen-Anwendungen, so detaillierten Verfahren nicht vorgesehen sind hier. Allerdings ist unser Labor die allgemeine Strategie zu einer doppel…

Discussion

Im Vergleich zu anderen Verfahren wie PET und MRI hat Biolumineszenz begrenzte räumliche Auflösung und reduzierten Gewebepenetration aufgrund der relativ schwachen Energie der emittierten Photonen (2-3 eV); aus diesen Gründen hat es bislang nicht anwendbar in großen Tieren. Allerdings hat Biolumineszenz den Vorteil, dass Low-Cost, High-Throughput-und non-invasive, so dass es sehr wünschenswert, in vivo Stammzellen Tracking bei Kleintieren. Non-Biolumineszenz Reporter-Gene wie PET und Fluoreszenz-Konstrukte können in Verbindung mit Luc…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)		HyClone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix	Growth factor reduced (optional: phenol-red free)	BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells		StemCell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt		Biosynth AG
Collagenase IV solution				Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates		TPP	92006