In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

Summary

Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.

Abstract

A descoberta de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) aumentou drasticamente as ferramentas disponíveis para cientistas médicos interessados ​​em medicina regenerativa. No entanto, a injeção direta de hESCs e células diferenciadas de hESCs, em organismos vivos até agora tem sido dificultada pela morte celular significativa, a formação de teratoma, e rejeição imune do hospedeiro. Compreensão do comportamento em CTEh vivo após o transplante exige técnicas de imagem inovadora para monitorar longitudinalmente localização CTEh, proliferação e viabilidade. A imagem molecular tem dado investigadores um meio de alto rendimento, baixo custo, e sensível para o rastreamento na proliferação celular vivo ao longo de dias, semanas e até meses. Este avanço tem aumentado significativamente a compreensão da cinética espaço-temporal de enxerto CTEh, proliferação e formação de teratoma, nos indivíduos que vivem.

Um grande avanço em imagem molecular tem sido a extensão dos ensaios não-invasivo gene repórter da biologia molecular e celular em plataformas in vivo modalidade multi-imagem. Estes genes repórter, sob controle de promotores e potenciadores de engenharia que se aproveitam da maquinaria transcricional da célula hospedeira s, são introduzidas nas células usando uma variedade de métodos de vetor e vetor não. Uma vez na célula, genes repórter pode ser transcrita ou constitutivamente ou apenas sob determinadas condições biológicas ou celular, dependendo do tipo de promotor usado. Transcrição e tradução de genes repórter em proteínas bioativas é detectada com instrumentação, sensível não-invasiva (por exemplo, câmeras CCD) usando o sinal de geração de sondas, tais como D-luciferina.

Para evitar a necessidade de luz de excitação para rastrear as células-tronco in vivo como é necessário para imagens de fluorescência, bioluminescência repórter sistemas de imagem gene exigem apenas uma sonda exogenamente administrada para induzir a emissão de luz. Firefly luciferase, derivado do Photinus firefly pyralis, codifica uma enzima que catalisa D-luciferina ao opticamente metabólito ativo, oxiluciferina. Atividade óptica pode ser monitorada com uma câmera CCD externa. Estavelmente transduzidas células que carregam o repórter construir dentro de seu DNA cromossômico vai passar o repórter construção de DNA para as células filhas, que permitam um acompanhamento longitudinal de sobrevivência e proliferação CTEh in vivo. Além disso, como expressão do produto do gene repórter é necessário para a geração do sinal, apenas as células viáveis ​​pai e filha vai criar sinal de bioluminescência; células apoptóticas ou morto, não.

Neste vídeo, os materiais e métodos específicos necessários para a proliferação de rastreamento de células-tronco e formação de teratoma com a imagem de bioluminescência será descrito.

Protocol

Construção de Gene Double Fusion Reporter A fim de realizar imagem de bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas, é preciso primeiro obter células que expressam de forma estável um gene repórter luciferase, como vaga-lume luciferase dirigido por um promotor constitutivo como Ubiquitina ou EF1a. O foco deste protocolo é em aplicações gene repórter, então os procedimentos detalhados não são fornecidos aqui. No entanto, a estratégia geral do nosso laboratório é usar u…

Discussion

Em comparação com outras modalidades, tais como PET e RM, a bioluminescência tem resolução espacial limitada penetração nos tecidos e reduzido devido à energia relativamente fraca de fótons emitidos (2-3 eV); por estas razões que até agora não foi aplicável em animais de grande porte. No entanto, a bioluminescência tem a vantagem de ser de baixo custo, alto rendimento, e não-invasivo, tornando-se altamente desejável para in vivo com células-tronco de rastreamento em pequenos animais. Genes não bioluminescência-repórter, …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)		HyClone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix	Growth factor reduced (optional: phenol-red free)	BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells		StemCell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt		Biosynth AG
Collagenase IV solution				Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates		TPP	92006