In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Summary

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

Abstract

De ontdekking van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) is dramatisch toegenomen de instrumenten die beschikbaar zijn medische wetenschappers die geïnteresseerd zijn in de regeneratieve geneeskunde. Echter, heeft directe injectie van hESC 's, en cellen onderscheiden van hESC' s, in levende organismen tot nu toe gehinderd door aanzienlijke celdood, teratoom vorming, en host afstoting. Het begrijpen van de in vivo hESC gedrag na de transplantatie zijn nieuwe vormen van beeldvormende technieken om de lengte te controleren hESC lokalisatie, proliferatie en levensvatbaarheid. Moleculaire beeldvorming heeft gegeven onderzoekers een high-throughput, goedkoop, en gevoelige betekent voor het bijhouden van in-vivo-celproliferatie over dagen, weken en zelfs maanden. Deze vooruitgang is aanzienlijk toegenomen het begrip van de spatio-temporele kinetiek van hESC aanslaan, proliferatie en teratoom-vorming in levende onderwerpen.

Een grote vooruitgang in de moleculaire beeldvorming is de uitbreiding van niet-invasieve reportergen assays uit de moleculaire en cellulaire biologie in de in vivo multi-modaliteit beeldvorming platforms. Deze reporter genen, onder controle van technisch promotors en enhancers die gebruik maken van transcriptionele de gastheercel s machines, worden ingevoerd in cellen met behulp van een verscheidenheid van vector-en niet-vector methoden. Eenmaal in de cel, kan reporter genen ofwel constitutief of alleen worden overgeschreven onder specifieke biologische of cellulaire voorwaarden, afhankelijk van het type van de promoter wordt gebruikt. Transcriptie en vertaling van reporter genen in bioactieve eiwitten wordt vervolgens gedetecteerd met gevoelige, niet-invasieve instrumenten (bv., CCD-camera's) met behulp van signaal-genererende sondes, zoals D-luciferine.

Om te voorkomen dat de noodzaak voor prikkelende lichte tot stamcellen track in vivo als nodig is voor fluorescentie beeldvorming, bioluminescentie reportergen beeldvormende systemen vereisen slechts een exogeen toegediende sonde aan het licht emissie te veroorzaken. Vuurvlieg luciferase, afgeleid van de vuurvlieg Photinus pyralis, codeert voor een enzym dat D-luciferine katalyseert de optisch actieve metaboliet, oxyluciferine. Optische activiteit kan dan worden gecontroleerd met een externe CCD camera. Stabiel getransduceerde cellen die de reporter dragen bouwen in hun chromosomale DNA passeert de reporter DNA-construct op dochter cellen, waardoor longitudinale monitoring van hESC overleving en proliferatie in vivo. Bovendien, omdat de expressie van het reportergen product is nodig voor het signaal generatie zal enige levensvatbare ouder en dochter cellen te creëren bioluminescentie signaal; apoptotische of dode cellen niet.

In deze video, zal de specifieke materialen en methodes die nodig zijn voor het bijhouden van stamcel proliferatie en teratoom formatie met bioluminescentie beeldvorming worden beschreven.

Protocol

Bouw van Double Fusion Reporter Gene Met het oog op bioluminescentie beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen uit te voeren, moet je eerst cellen die stabiel drukken een luciferase reportergen zoals vuurvlieg luciferase aangedreven door een constitutieve promoter zoals Ubiquitine of EF1a te verkrijgen. De focus van dit protocol is op de reporter-gen-toepassingen, zodat gedetailleerde procedures zijn hier niet voorzien. Echter, onze lab van de algemene strategie is het gebruik van een dubbele…

Discussion

In vergelijking met andere modaliteiten, zoals PET en MRI, bioluminescentie heeft een beperkte ruimtelijke resolutie en een verminderde penetratie als gevolg van de relatief zwakke energie van de uitgezonden fotonen (2-3 eV), om deze redenen is het tot nu toe niet van toepassing in grote dieren. Echter, bioluminescentie heeft het voordeel dat het low-cost, high-throughput, en niet-invasieve, waardoor het zeer wenselijk dat in vivo stamcellen volgen in kleine dieren. Niet-bioluminescentie reporter genen zoals PET en fluorescentie constructen…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)		HyClone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix	Growth factor reduced (optional: phenol-red free)	BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells		StemCell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt		Biosynth AG
Collagenase IV solution				Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates		TPP	92006