Summary
Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.
Abstract
De ontdekking van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) is dramatisch toegenomen de instrumenten die beschikbaar zijn medische wetenschappers die geïnteresseerd zijn in de regeneratieve geneeskunde. Echter, heeft directe injectie van hESC 's, en cellen onderscheiden van hESC' s, in levende organismen tot nu toe gehinderd door aanzienlijke celdood, teratoom vorming, en host afstoting. Het begrijpen van de in vivo hESC gedrag na de transplantatie zijn nieuwe vormen van beeldvormende technieken om de lengte te controleren hESC lokalisatie, proliferatie en levensvatbaarheid. Moleculaire beeldvorming heeft gegeven onderzoekers een high-throughput, goedkoop, en gevoelige betekent voor het bijhouden van in-vivo-celproliferatie over dagen, weken en zelfs maanden. Deze vooruitgang is aanzienlijk toegenomen het begrip van de spatio-temporele kinetiek van hESC aanslaan, proliferatie en teratoom-vorming in levende onderwerpen.
Een grote vooruitgang in de moleculaire beeldvorming is de uitbreiding van niet-invasieve reportergen assays uit de moleculaire en cellulaire biologie in de in vivo multi-modaliteit beeldvorming platforms. Deze reporter genen, onder controle van technisch promotors en enhancers die gebruik maken van transcriptionele de gastheercel s machines, worden ingevoerd in cellen met behulp van een verscheidenheid van vector-en niet-vector methoden. Eenmaal in de cel, kan reporter genen ofwel constitutief of alleen worden overgeschreven onder specifieke biologische of cellulaire voorwaarden, afhankelijk van het type van de promoter wordt gebruikt. Transcriptie en vertaling van reporter genen in bioactieve eiwitten wordt vervolgens gedetecteerd met gevoelige, niet-invasieve instrumenten (bv., CCD-camera's) met behulp van signaal-genererende sondes, zoals D-luciferine.
Om te voorkomen dat de noodzaak voor prikkelende lichte tot stamcellen track in vivo als nodig is voor fluorescentie beeldvorming, bioluminescentie reportergen beeldvormende systemen vereisen slechts een exogeen toegediende sonde aan het licht emissie te veroorzaken. Vuurvlieg luciferase, afgeleid van de vuurvlieg Photinus pyralis, codeert voor een enzym dat D-luciferine katalyseert de optisch actieve metaboliet, oxyluciferine. Optische activiteit kan dan worden gecontroleerd met een externe CCD camera. Stabiel getransduceerde cellen die de reporter dragen bouwen in hun chromosomale DNA passeert de reporter DNA-construct op dochter cellen, waardoor longitudinale monitoring van hESC overleving en proliferatie in vivo. Bovendien, omdat de expressie van het reportergen product is nodig voor het signaal generatie zal enige levensvatbare ouder en dochter cellen te creëren bioluminescentie signaal; apoptotische of dode cellen niet.
In deze video, zal de specifieke materialen en methodes die nodig zijn voor het bijhouden van stamcel proliferatie en teratoom formatie met bioluminescentie beeldvorming worden beschreven.
Protocol
- Bouw van Double Fusion Reporter Gene
- Met het oog op bioluminescentie beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen uit te voeren, moet je eerst cellen die stabiel drukken een luciferase reportergen zoals vuurvlieg luciferase aangedreven door een constitutieve promoter zoals Ubiquitine of EF1a te verkrijgen.
- De focus van dit protocol is op de reporter-gen-toepassingen, zodat gedetailleerde procedures zijn hier niet voorzien. Echter, onze lab van de algemene strategie is het gebruik van een dubbele fusieconstruct vector die vuurvlieg luciferase (schommelingen) en verbeterde groen fluorescerend eiwit (EGFP), gescheiden door een spacer in pcDNA 3.1 + bevat.
- Kortom, onze dubbele fusiegen was oorspronkelijk stroomafwaarts van het cytomegalovirus promotor in pcDNA 3,1 (+), dus de 3,3 kbp fragment werd uitgesneden met behulp van Ndel en Notl spijsvertering en stomp-end geligeerd in de meervoudige kloneringsplaats van een zelf-inactiverende (SIN ) lentivirale vector, onder controle van een ubiquitine-promoter.
- Lentiviraal Transductie
- hESC 's kan 3-5 dagen worden getransduceerd na passage bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 (virale titer van ongeveer 107 geïncubeerd met 106 cellen).
- Het ontdooide virale voorraad kan direct worden toegevoegd aan verse hESC media.
- Later Vernieuw de media 12 en 24 uur.
- Na 48 uur, kan transductie efficiëntie door kwalitatief beoordeeld met behulp van fluorescentie microscopie. Vervolgens kan FACS worden gebruikt om geïnfecteerde cellen te isoleren.
- Het kweken van hESC 's en inleiding tot Imaging Set-up
- De cultuur van uw luciferase positieve hESC 's in de feeder-vrije omstandigheden. We meestal volgen de standaard WiCell protocol en gebruik 6-well platen gecoat in groeifactor verminderde Matrigel, met behulp van geconditioneerde media of commerciële, feeder-vrije media.
- Het opsporen van de luciferase positieve cellen, moet u de reporter probe D-luciferine al voorbereid. Om dit te doen, hoeveelheid luciferine in 1-1,5 ml voorbereidingen op een uiteindelijke concentratie van 45 mg / ml. Houd de fracties bij -20 ° C wanneer niet in gebruik en vermijd blootstelling aan het licht door het bedekken met een papieren handdoek wanneer het niet in opslag.
- Om de luciferase positieve cellen zichtbaar te maken, gebruiken we IVIS 50 en IVIS 200 Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Dit laatste systeem bevat een geïntegreerde isoflourane apparatuur en inductie kamer voor tijdelijke verdoving van kleine dieren.
- In vitro bioluminescentie beeldvorming van hESC 's
- Voor in vitro bioluminescentie beeldvorming, is het belangrijk om te behouden steriele omstandigheden. Daarom moet de imaging-systeem worden steriel, bij voorkeur in een celcultuur kamer.
- Voor de beeldvorming, verwijdert u de cel media en voeg net genoeg PBS om de cellen te dekken. Voeg bijvoorbeeld 1 ml PBS aan elk putje van een 6-wells plaat met uw hESC culturen.
- De verhouding van D-Luciferine te PBS moet worden 1:100, dus het is aan 10 ul van ontdooid D-Luciferine in elke well van de 6-wells plaat.
- Wacht een minuut, neem dan een afbeelding met behulp van een belichtingstijd van 1 seconde. Als het signaal zwak is, verhoogt de blootstelling interval en probeer het opnieuw.
- De bioluminescente signaal geeft mobiele nummer, zodat kwantificatie testen kunnen worden uitgevoerd die correleren signaal met verschillende cel aantallen.
- Voorbereiding van de muis en het injecteren van cellen voor in vivo beeldvorming
- Reportergen beeldvorming zorgt voor een high-throughput, goedkope en gevoelige methode voor het bijhouden van cellen na transplantatie over dagen, weken en zelfs maanden. Dit is vooral van belang omdat getransplanteerde stamcellen vaak vorm teratomen, worden afgewezen door het immuunsysteem van de gastheer, of gewoon sterven.
- De eenvoudigste methode voor beeldvorming teratoom vorming van in vivo is om te injecteren hESC 's dat de vuurvlieg luciferase reporter-gen te uiten in de rug van SCID muizen en het verwerven van bioluminescente beelden met de IVIS systeem.
- Wanneer u klaar bent om de cellen te transplanteren, gebruik dispase of collagenase om de cellen los te maken, een paar keer wassen, en hen te schorten in een 1:1 mengsel van groeifactor minder-Matrigel en DMEM. Typisch we eerst de cellen te mengen met gekoelde DMEM en voeg vervolgens in de Matrigel. Voor elke subcutane injectie, we injecteren 200.000 cellen gesuspendeerd in een 50-100 ul volume van de Matrigel / DMEM mengsel. Het aantal cellen kan worden aangepast afhankelijk van uw toepassing. Vergeet niet om alles te houden op het ijs voorafgaand aan de injectie.
- Zodra de cellen klaar zijn, verdoven de muis door deze in de inductie doos met isofluraan stroom ingeschakeld. Na 1-5 minuten, de muis wordt in slaap en kan worden geplaatst op de operatietafel met continue isofluraan.
- Omdat de vacht van nature auto-fluoresceert en kan de lichtgevende afbeelding obscure, zullen we nodig hebben om het haar te verwijderen uit de achterkant van de muis. De eenvoudigste manier om dit te doen is het gebruik van een elektrisch scheerapparaat, maar u kunt ook gebruik maken van hair-removal gels. Veeg met alcohol om te steriliserende huid daarna
- Vervolgens het opstellen van uw celsuspensie in een spuit. 23 tot 27 gauge naalden het beste werken, omdat ze niet verstoppen met cellen. Als de naald is te groot (<23 gauge), de naald-darmkanaal kan laat een groot gat, waardoor cellen kunnen weer lekken.
- Injecteer de cellen onder de huid in de rug van de muis. Omdat de huid is heel los, gebruik je duim en wijsvinger te knijpen en strek het gebied dat u wilt injecteren. Injecteer vlak onder de huid, waarbij zorg niet te prikken te diep. Ook proberen de naald te houden van uitschuiven van de plaats van injectie, terwijl het indrukken van de zuiger: dit wordt voorkomen dat het maken van een gat in de huid waardoor de cellen kan lekken als u probeert weer te injecteren.
- Nadat de cellen zijn ingespoten, wacht een paar uur om de muis om wakker te worden en rond te rennen voordat die weer verlamming voor bioluminescentie beeldvorming. Daarmee vermijdt isofluraan toxiciteit.
- In vivo bioluminescentie beeldvorming van getransplanteerde cellen
- Voor de hele dier bioluminescentie beeldvorming, doen we een intraperitoneale injectie van D-luciferine van 375 mg / kg lichaamsgewicht. Weeg het dier om de dosering te berekenen voor de injectie.
- Injecteer de D-luciferin in het buikvlies, vlak bij de middellijn. Wees voorzichtig om niet te diep te gaan of u kunt schade aan interne organen. Als de muis begint om wakker te worden, plaats deze terug in de knock-out box en wacht een minuut of twee. Voor muizen, de maximale bioluminescentie gebeurt meestal 15-40 minuten na de injectie.
- Vergeet niet om mat zwart papier plaats in de imaging-box te helpen geen licht uitgezonden door de hESC 's op te vangen. Plaats de muis (achterkant boven) in de beeldvorming kamer met isofluraan, op de top van het zwarte papier. Begin met een belichtingstijd van 10 seconden. Als het signaal verzadigd is, probeer dan het verminderen van de blootstelling tijd, als het te zwak is, verhoging van de blootstelling.
- Zodra het signaal belichtingstijd is geoptimaliseerd voor de muis, beginnen met beelden elke minuut totdat het signaal bereikt een maximum. Dit kan het beste gebeuren door gebruik te maken van de imaging software om "regio's van belang (ROI)" dat uw injectieplaatsen te dekken selecteren. Door het monitoren van de intensiteit van het signaal bij iedere ROI kunt u eenvoudig bepalen wanneer het signaal begint af te nemen, wat aangeeft dat de maximale intensiteit van het signaal is bereikt. Het maximum signaal moet worden gebruikt als uw definitieve gegevens.
- Wanneer u tevreden bent met uw afbeeldingen, verwijder de muis van isofluraan en laat hem wakker in zijn kooi. Normaal gesproken, zou de muis wakker worden binnen 15 minuten.
- Bioluminescentie reportergen beeldvorming kan worden herhaald dagelijkse, wekelijkse en maandelijkse zolang de hESC 's overleven in het dier. Signaal van een zich ontwikkelende teratoom zullen exponentieel toenemen na verloop van tijd, meestal in de orde van weken, als de hESC 's beginnen te vermenigvuldigen.
- Nadat de gewenste tijd loop van bioluminescentie beelden is verworven, kan het dier worden opgeofferd en weefsel wordt gebruikt voor histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vergelijking met andere modaliteiten, zoals PET en MRI, bioluminescentie heeft een beperkte ruimtelijke resolutie en een verminderde penetratie als gevolg van de relatief zwakke energie van de uitgezonden fotonen (2-3 eV), om deze redenen is het tot nu toe niet van toepassing in grote dieren. Echter, bioluminescentie heeft het voordeel dat het low-cost, high-throughput, en niet-invasieve, waardoor het zeer wenselijk dat in vivo stamcellen volgen in kleine dieren. Niet-bioluminescentie reporter genen zoals PET en fluorescentie constructen kunnen worden gebruikt in combinatie met luciferase tot een fusie reportergen dat is samengesteld uit verschillende domeinen die de individuele reporter genen te creëren. Bijvoorbeeld, onze groep maakt gebruik van een fusieconstruct met schommelingen, monomere rood fluorescerend eiwit (mrfp), en herpes simplex virus thymidine kinase afgekapt (TTK, een PET-reporter gen) voor multi-modaliteit volgen van stamcellen gedrag in kleine dieren. Na verloop van tijd kan stabiel geïntegreerde reporter genen zijn onderworpen aan gene silencing door de endogene chromosomale machines. Een reportergen de gevoeligheid voor gene silencing is nauw verbonden met de keuze van de promotor het rijden zijn expressie. Zo is het cytomegalovirus promotor (pCMV) snel het zwijgen opgelegd in hESC 's. Ons laboratorium heeft goede succes met de menselijke ubiquitine-C promotor (schaamluis), om de expressie van een dubbele fusie-station te bouwen in meerdere hESC cellijnen, en hebben gezien minimaal signaalverlies in de tijd.
Tot slot, voordat hESC-afgeleide celregeneratie wordt klinisch relevant, moet een aantal elementaire biologische hindernissen worden overwonnen - namelijk celdood of apoptose na de transplantatie van gedifferentieerde cellen, teratoom vorming van de ongedifferentieerde cellen, en afstoting door het gastheerorganisme. Deze en andere uitdagingen onderstrepen de noodzaak voor het volgen van hESC aanslaan, de overleving en proliferatie in de ontvangende organisme. De ontwikkeling van moleculaire beeldvormende technieken zoals de vuurvlieg luciferase reporter gen en ultra-gevoelige CCD-camera's heeft het mogelijk niet-invasieve, repetitieve evaluatie van de cel-locatie, migratie, proliferatie en differentiatie in vivo. Technologieën zoals deze zal helpen duwen vertaling van hESC de biologie van het laboratorium naar klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Met dank aan Tim Doyle, PhD en de Stanford Centrum voor in vivo beeldvorming voor hulp bij bioluminescentie beeldvorming. Mede dankzij Ngan Huang, PhD voor het delen van haar techniek op stamcellen co-injectie met matrix-oplossing. Tot slot dank aan Steve Vilt, Ph.D. voor hulp met de veterinaire verzorging van dieren.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
