In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

Summary

Con el creciente interés en terapias con células madre, las técnicas de imagen molecular son ideales para el comportamiento de las células madre de seguimiento tras el trasplante. Genes luciferase reportero le han permitido no invasiva, la evaluación repetida de la supervivencia celular, la ubicación y la proliferación in vivo. Este vídeo demuestra cómo realizar el seguimiento proliferación de células madre en un ratón vivo.

Abstract

El descubrimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) se ha incrementado dramáticamente las herramientas disponibles para los científicos médicos interesados ​​en la medicina regenerativa. Sin embargo, la inyección directa de hESCs, y las células diferenciadas a partir de hESCs, en los organismos vivos hasta el momento ha sido obstaculizada por la muerte celular significativa, la formación de teratomas, y el rechazo inmune del huésped. Entender el comportamiento de células madre in vivo después de un trasplante requiere nuevas técnicas de imagen para controlar la localización longitudinal células madre, la proliferación y viabilidad. Imagen molecular ha dado a los investigadores un medio de alto rendimiento, bajo costo y sensible para el seguimiento de la proliferación celular in vivo durante días, semanas e incluso meses. Este avance se ha incrementado significativamente la comprensión de la cinética de espacio-temporal de injerto células madre, proliferación y formación de teratoma en sujetos vivos.

Un avance importante en la proyección de imagen molecular ha sido la extensión de ensayos de gen reportero no invasivo de la biología molecular y celular en las plataformas de imágenes en vivo en varias modalidades. Estos genes reporteros, bajo el control de promotores y potenciadores de ingeniería que se aprovechan de la maquinaria transcripcional de la célula huésped s, se introducen en las células usando una variedad de métodos vectoriales y no vectoriales. Una vez en la célula, los genes indicadores pueden ser transcritos o bien constitutivamente o sólo en determinadas condiciones biológicas o celular, dependiendo del tipo de promotor utilizado. Transcripción y traducción de genes reporteros en proteínas bioactivas es detectado con instrumentos sensibles, no invasivo (por ejemplo, cámaras CCD) con la generación de la señal de las sondas, tales como D-luciferina.

Para evitar la necesidad de luz de excitación para realizar un seguimiento in vivo de células madre que se requiere para imágenes de fluorescencia, bioluminiscencia reportero de sistemas de imágenes gen sólo requieren una investigación administrada de forma exógena para inducir la emisión de luz. Luciferasa de luciérnaga, derivado de la luciérnaga pyralis Fotino, codifica una enzima que cataliza la D-luciferina a la ópticamente activos oxyluciferin metabolito. Actividad óptica puede ser controlado con una cámara CCD externa. Establemente células transducidas que llevan el reportero construir dentro de su ADN cromosómico pasará el reportero construcción de ADN a las células hijas, permitiendo un seguimiento longitudinal de la supervivencia y la proliferación de células madre in vivo. Por otra parte, porque la expresión del producto del gen reportero se requiere para la generación de señales, las células madre y la hija única solución viable a crear la señal de la bioluminiscencia, la apoptosis o muerte no.

En este video, los materiales específicos y los métodos necesarios para la proliferación de células madre y el seguimiento de la formación de teratomas con imágenes de bioluminiscencia se describen.

Protocol

Construcción de doble reportero Gene fusión Con el fin de realizar imágenes de bioluminiscencia de células madre embrionarias humanas, primero tiene que obtener las células que expresan establemente un gen reportero de la luciferasa como luciferasa de luciérnaga impulsado por un promotor constitutivo como ubiquitina o EF1A. El objetivo de este protocolo es el gen reportero de aplicaciones, por lo que los procedimientos detallados que no se proporcionan aquí. Sin embargo, la estrategia general …

Discussion

En comparación con otras modalidades como la PET y la RM, la bioluminiscencia tiene una resolución espacial limitada y penetración en los tejidos debido a la reducción de la energía relativamente débil de los fotones emitidos (2-3 eV), por estas razones que hasta ahora no ha sido aplicable en los animales grandes. Sin embargo, la bioluminiscencia tiene la ventaja de ser de bajo costo, alto rendimiento, y no invasiva, por lo que es muy conveniente que en las células madre in vivo de seguimiento en pequeños animales. Bioluminiscencia …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)		HyClone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix	Growth factor reduced (optional: phenol-red free)	BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells		StemCell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt		Biosynth AG
Collagenase IV solution				Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates		TPP	92006