במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג'ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים
Summary
עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.
Abstract
הגילוי של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) גדל באופן דרמטי את הכלים העומדים לרשות מדענים רפואיים מעוניין רפואה רגנרטיבית. עם זאת, הזרקה ישירה של hESCs, ותאי להבדיל hESCs, לתוך אורגניזמים חיים עד כה כבר הקשו על ידי מוות של תאים משמעותי, היווצרות תפלצת רוחנית, ודחייה מארח החיסונית. הבנת התנהגות hESC vivo לאחר ההשתלה דורש טכניקות הדמיה חדשנית longitudinally לפקח לוקליזציה hESC, שגשוג, ואת הכדאיות. הדמיה מולקולרית נתן החוקרים אמצעי תפוקה גבוהה, לא יקר, רגיש עבור מעקב התפשטות תאים vivo לאורך ימים, שבועות ואפילו חודשים. התקדמות זו גדל באופן משמעותי את הבנת במרחב ובזמן קינטיקה של engraftment hESC, התפשטות, תפלצת היווצרות בנושאים החיים.
התקדמות גדולה הדמיה מולקולרית כבר את הסיומת של מבחני גן פולשנית כתב ביולוגיה מולקולרית תאית לתוך in vivo מרובת פלטפורמות שיטת הדמיה. גנים אלו הכתב, בשליטת היזמים משפרי מהונדסים כי לנצל מכונות תעתיק של התא המארח, הם הציגו לתוך התאים באמצעות מגוון של שיטות וקטור וקטור לא. לאחר בתא, גנים הכתב יכול להיות גם עיבד constitutively או רק בתנאים ביולוגיים או הסלולר ספציפי, בהתאם לסוג של האמרגן בשימוש. תמלול ותרגום של גנים לחלבונים כתב ביו מזוהה אז עם מכשור, רגיש פולשנית (למשל, מצלמות CCD) באמצעות האות מניבות בדיקות כגון D-luciferin.
כדי למנוע את הצורך לעקוב אחר האור מעוררים בתאי גזע in vivo כפי שנדרש לצורך דימות פלואורסצנטי, כתב פליטת אור גן מערכות הדמיה דורשים רק בדיקה מנוהל exogenously לגרום פליטת האור. גחלילית בלוציפראז, נגזר Photinus גחלילית pyralis, מקודד אנזים המזרז D-luciferin על המטבוליט הפעיל אופטית, oxyluciferin. פעילות אופטית אז יכול להיות במעקב עם מצלמת CCD חיצוני. ביציבות transduced תאים שנושאים את הכתב לבנות בתוך הדנ"א בכרומוזומים שלהם יעבור הכתב לבנות DNA לתאי הבת, המאפשר ניטור האורך של הישרדות hESC ושגשוגם in vivo. יתר על כן, כי הביטוי של המוצר גן הכתב נדרש דור האות, קיימא רק בתאי אב ובתו תיצור אות פליטת אור; תאים אפופטוטיים מת או לא.
בסרטון הזה, החומרים הספציפיים הדרושים ריבוי שיטות מעקב בתאי גזע היווצרות תפלצת עם הדמיה פליטת אור יתוארו.
Protocol
Discussion
לעומת שיטות אחרות כגון PET ו-MRI, פליטת אור בעל רזולוציה מרחבית מוגבלת חדירה לרקמות מופחת בשל האנרגיה חלשה יחסית של פוטונים הנפלטים (2-3 eV); מסיבות אלה יש עד כה לא היה רלוונטי בחיות גדולות. עם זאת, פליטת אור יש את היתרון של להיות בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה, ולא פולשנית, מה שהופך אותו רצוי מ…
Acknowledgements
הודות טים דויל, PhD והמרכז סטנפורד בתחום ההדמיה Vivo לסיוע עם הדמיה פליטת אור. כמו כן, הודות Ngan הואנג, PhD לשיתוף הטכניקה שלה על תא גזע שיתוף זריקה עם פתרון מטריקס. לבסוף, בזכות סטיב לבד, Ph.D. לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים וטרינרי.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17 (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. . Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .
