In vitro och in vivo mareld Reporter Gene avbildning av mänskliga embryonala stamcellslinjer
Summary
Med det växande intresset för stamcellsbehandlingar, molecular imaging tekniker är idealiska för övervakning av stamcellstransplantation beteende efter transplantationen. Luciferas reporter gener har aktiverat icke-invasiva, repetitiva bedömning av cellens överlevnad, placering och spridning i vivo. Denna video kommer att visa hur du spårar hESC spridning i en levande mus.
Abstract
Upptäckten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) har ökat dramatiskt de verktyg som finns för att medicinska forskare intresserade av regenerativ medicin. Dock har direktinsprutning av hESCs, och celler skiljas från hESCs, i levande organismer hittills hämmats av betydande celldöd, teratom bildning, och värd avstötning. Förstå in vivo hESC beteende efter transplantation kräver nya avbildningstekniker för att longitudinellt följa hESC lokalisering, spridning och överlevnad. Molekylär avbildning har gett utredare en hög genomströmning, billig och känsliga metoder för att spåra in vivo celltillväxt under dagar, veckor och även månader. Denna utveckling har avsevärt ökat förståelsen för tid och rum kinetik hESC engraft, proliferation och teratom-formation i levande individer.
Ett stort framsteg inom molekylär bildanalys har varit en förlängning av icke-invasiv analyser reporter gen från molekylär-och cellbiologi till in vivo multimodalitet bildbehandling plattformar. Dessa reporter gener, under kontroll av tekniska medel och medel som utnyttjar värdcellens s transkriptionell maskiner införs i celler med hjälp av olika vektor och icke-vektor metoder. Väl inne i cellen, kan reporter gener transkriberas antingen konstitutivt eller endast under särskilda biologiska eller cellulära villkor, beroende på vilken typ av promotor. Transkription och översättning av reporter gener i bioaktiva proteiner sedan detekteras med känslig, icke-invasiv instrumentering (t ex CCD-kameror) med hjälp av signal-genererande sonder som D-luciferin.
För att undvika behovet av excitatoriska lätta att spåra stamceller in vivo som krävs för fluorescens avbildning, mareld reporter gen bildsystem behöver endast en exogent administrerad sond för att framkalla ljus utsläpp. Firefly luciferas, som härrör från eldfluga Photinus pyralis, kodar ett enzym som katalyserar D-luciferin till optiskt aktiva metabolit, oxyluciferin. Optisk aktivitet kan sedan följas upp med en extern CCD-kamera. Stabilt transduced celler som bär reportern bygger på deras kromosomalt DNA kommer att passera reportern konstruera DNA till dotter celler, vilket möjliggör longitudinell övervakning av hESC överlevnad och spridning in vivo. Dessutom, eftersom uttrycket av reportern genprodukten krävs för signal generation, kommer bara livskraftiga förälder och dotter celler skapa mareld signal; apoptotiska eller döda celler kommer inte.
I denna video kommer de särskilda material och metoder som behövs för att spåra stamceller spridning och teratom formation med mareld avbildning beskrivas.
Protocol
Discussion
Jämfört med andra metoder såsom PET och MRI, har bioluminescens begränsad rumslig upplösning och minskat in i vävnaderna på grund av den relativt svaga energin som avges fotoner (2-3 eV), av dessa skäl har det hittills inte varit tillämplig i stora djur. Har dock bioluminescens fördelen att vara låg kostnad, hög genomströmning, och icke-invasiv, vilket gör det mycket önskvärt för in vivo stamceller spårning i små djur. Icke-bioluminescence reporter gener som PET och fluorescens konstruktioner kan användas tillsammans med…
Acknowledgements
Tack vare Tim Doyle, PhD och Stanford Center for in vivo imaging för hjälp med bioluminescens avbildning. Tack även till Ngan Huang, PhD för att dela sin teknik på stamceller samarbete injektion med matris lösning. Slutligen Felt tack vare Steve, Ph.D. för hjälp med veterinär djurvård.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17 (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. . Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .
