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Biology

इन विट्रो में और vivo में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के bioluminescence रिपोर्टर जीन इमेजिंग में

doi: 10.3791/740 Published: May 2, 2008

Summary

स्टेम सेल उपचार में बढ़ती रुचि के साथ, आणविक इमेजिंग तकनीक निगरानी स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद व्यवहार के लिए आदर्श होते हैं. Luciferase रिपोर्टर जीन गैर इनवेसिव, सेल अस्तित्व, स्थान, और vivo में प्रसार के दोहराव आकलन सक्षम है. यह वीडियो कैसे एक जीवित चूहे में hESC प्रसार को ट्रैक करने के लिए प्रदर्शन करेंगे.

Protocol

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  1. डबल फ्यूजन रिपोर्टर जीन का निर्माण
    1. आदेश में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, आप पहली बार कोशिकाओं है कि stably जैसे जुगनू luciferase Ubiquitin या EF1a तरह विधान प्रमोटर द्वारा संचालित एक luciferase रिपोर्टर जीन व्यक्त प्राप्त करने की जरूरत है.
    2. इस प्रोटोकॉल के रिपोर्टर जीन अनुप्रयोगों पर ध्यान केंद्रित है, तो विस्तृत प्रक्रियाओं यहाँ नहीं प्रदान की जाती हैं. हालांकि, हमारी प्रयोगशाला की सामान्य रणनीति के लिए एक डबल संलयन का निर्माण सदिश है कि जुगनू (fluc) luciferase और बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) 3.1 pCDNA के भीतर एक स्पेसर + द्वारा अलग होता है का उपयोग करने के लिए है.
    3. संक्षेप में, हमारे डबल संलयन जीन मूल में cytomegalovirus प्रमोटर pCDNA 3.1 (+) के बहाव स्थित है, तो 3.3 KBP टुकड़ा NdeI और चना पाचन और कुंद के अंत में एक स्वयं निष्क्रिय (SIN के कई क्लोनिंग साइट में ligated का उपयोग excised था ) एक Ubiquitin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत lentiviral वेक्टर,.

  2. Lentiviral transduction
    1. hESCs पारित होने के बाद 3-5 दिनों किया जा सकता है संक्रमण की बहुलता (MOI) 10 (लगभग 107 के वायरल टिटर 106 कोशिकाओं के साथ incubated) पर transduced.
    2. thawed वायरल शेयर ताजा hESC मीडिया को सीधे जोड़ा जा सकता है.
    3. 12 मीडिया और 24 घंटे बाद ताज़ा.
    4. 48 घंटे के बाद, पारगमन दक्षता द्वारा गुणात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मूल्यांकन कर सकते हैं. इसके बाद, FACS संक्रमित कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  3. संवर्धन hESCs और इमेजिंग के लिए सेट अप परिचय
    1. में अपने luciferase सकारात्मक hESCs संस्कृति फीडर मुक्त स्थितियों. हम आम तौर पर मानक WiCell प्रोटोकॉल का पालन करें और 6-वृद्धि कारक Matrigel कम में अच्छी तरह से लेपित प्लेटें, या तो वातानुकूलित मीडिया या वाणिज्यिक का उपयोग करते हुए, फीडर स्वतंत्र मीडिया का उपयोग करें.
    2. Luciferase सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, आप रिपोर्टर जांच डी - luciferin पहले से ही तैयार की आवश्यकता होगी. 45 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में 1-1.5 एमएल तैयारी में करने के लिए इस, विभाज्य luciferin. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots रखें जब का उपयोग करें और कागज तौलिया जब भंडारण में नहीं के साथ कवर के द्वारा प्रकाश में जोखिम से बचने नहीं है.
    3. आदेश में luciferase सकारात्मक कोशिकाओं कल्पना करने के लिए, हम 50 IVIS और IVIS 200 इमेजिंग सिस्टम (Xenogen निगम, अल्मिडा, सीए) का उपयोग करें. यह बाद प्रणाली एक एकीकृत isoflourane तंत्र और छोटे जानवरों के अस्थायी संज्ञाहरण के लिए प्रेरण चैम्बर भी शामिल है.

  4. इन विट्रो hESCs के bioluminescence इमेजिंग
    1. इन विट्रो bioluminescence इमेजिंग में के लिए, यह महत्वपूर्ण है बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए. इसलिए, इमेजिंग प्रणाली बाँझ, अधिमानतः एक सेल संस्कृति कमरे में होना चाहिए.
    2. इमेजिंग से पहले, मीडिया सेल को हटाने और अभी काफी पीबीएस जोड़ने के लिए कोशिकाओं को कवर. उदाहरण के लिए, 6 अच्छी तरह से अपने hESC संस्कृतियों युक्त थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 1ml पीबीएस जोड़ने.
    3. डी Luciferin पीबीएस अनुपात 1:100 होना चाहिए, तो 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह thawed डी Luciferin 10 μL जोड़ें.
    4. एक मिनट रुको, तो 1 सेकंड के एक जोखिम समय का उपयोग कर छवि ले. यदि संकेत कमजोर है, जोखिम अंतराल बढ़ाने के लिए और फिर कोशिश करें.
    5. bioluminescent संकेत सेल नंबर को दर्शाता है, तो quantitation assays के प्रदर्शन हो सकता है कि अलग सेल नंबर के साथ संकेत सहसंबंधी कर सकते हैं.

  5. माउस और कोशिकाओं को इंजेक्शन के vivo इमेजिंग में के लिए तैयार
    1. रिपोर्टर जीन इमेजिंग दिन, सप्ताह, और महीनों के दौरान भी प्रत्यारोपण के बाद ट्रैकिंग कोशिकाओं के लिए एक उच्च throughput, सस्ती है, और संवेदनशील तरीका प्रदान करता है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के बाद से प्रतिरोपित स्टेम कोशिकाओं अक्सर teratomas फार्म, मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अस्वीकार कर दिया है, या बस मर जाते हैं.
    2. इमेजिंग vivo में teratoma गठन के लिए सरल तरीका hESCs कि SCID चूहों की पीठ में जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन व्यक्त और IVIS सिस्टम के साथ bioluminescent छवियों अधिग्रहण इंजेक्षन है.
    3. जब आप करने के लिए कोशिकाओं का प्रत्यारोपण के लिए तैयार कर रहे हैं, dispase या collagenase का उपयोग करें कोशिकाओं को ढीला करने के लिए, कई बार धोने के लिए, और उन्हें वृद्धि कारक कम matrigel और DMEM की एक 1:1 मिश्रण में निलंबित. आमतौर पर हम पहले ठंडा DMEM के साथ कोशिकाओं के मिश्रण और फिर matrigel में जोड़ने. प्रत्येक उपचर्म इंजेक्शन साइट के लिए, हम 200.000 5-10 उल मात्रा में मिश्रण / matrigel DMEM के निलंबित कोशिकाओं इंजेक्षन. सेल नंबर आपके आवेदन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. बर्फ पर सब कुछ रखने के इंजेक्शन के लिए पहले याद रखें.
    4. एक बार कोशिकाओं को तैयार हैं, यह isoflurane चालू प्रवाह के साथ शामिल बॉक्स में रखकर माउस anesthetize. 1-5 मिनट के बाद, माउस सो रहा है और निरंतर isoflurane के साथ ऑपरेटिंग मेज पर रखा जा सकता है है.
    5. क्योंकि फर स्वाभाविक रूप से ऑटो fluoresces और bioluminescent छवि अस्पष्ट हो सकता है, हम माउस के पीछे की ओर से बालों को हटाने की आवश्यकता होगी. सबसे आसान तरीका यह करने के लिए एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करने के लिए है, लेकिन आप भी बाल हटाने जैल का उपयोग कर सकते हैं. शराब के साथ पोछो के लिए बाँझबाद में त्वचा
    6. अगले, एक सिरिंज में अपने सेल निलंबन आकर्षित. 23 से 27 गेज सुई सबसे अच्छा काम के बाद से वे कोशिकाओं के साथ रोकना होगा. यदि सुई बहुत बड़ी है (<23 गेज) सुई पथ एक बड़ा छेद है जिसके माध्यम से कोशिकाओं को वापस बाहर लीक कर सकते हैं छोड़ सकते हैं.
    7. त्वचा के नीचे है माउस की पीठ में कोशिकाओं इंजेक्षन. क्योंकि त्वचा काफी ढीला है, अपने अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करने के लिए चुटकी और आप इंजेक्षन करना चाहते हैं क्षेत्र खिंचाव. सिर्फ त्वचा के नीचे सुई, देखभाल बहुत गहरा लेने पंचर नहीं है. इसके अलावा, सुई इंजेक्शन साइट के बाहर फिसलने जबकि सवार निराशाजनक से रखने की कोशिश: यह त्वचा में एक छेद के माध्यम से जो कोशिकाओं रिसाव अगर आप फिर इंजेक्षन करने की कोशिश कर सकते हैं बनाने से रोकने जाएगा.
    8. बाद कोशिकाओं अंतःक्षिप्त रहे हैं, कुछ घंटे प्रतीक्षा करने के लिए माउस जाग करने के लिए अनुमति देते हैं और bioluminescence इमेजिंग के लिए पुनः - anesthetizing पहले चारों ओर चला. ऐसा करने से isoflurane विषाक्तता से बचा जाता है.

  6. प्रतिरोपित कोशिकाओं के vivo bioluminescence इमेजिंग
    1. पूरे जानवर bioluminescence इमेजिंग के लिए, हम 375 शरीर मिलीग्राम / किग्रा वजन में डी luciferin की intraperitoneal इंजेक्शन नहीं है. जानवर का वजन खुराक इंजेक्शन के लिए पहले की गणना.
    2. Peritoneum में डी luciferin midline बस बंद इंजेक्षन. जाना है या नहीं भी गहरी आंतरिक अंगों को नुकसान कर सकते हैं सावधान रहो. यदि माउस को जगाने के लिए शुरू होता है, इसे वापस पीटा बॉक्स में और जगह एक या दो मिनट रुको. चूहों के लिए, अधिकतम bioluminescence आमतौर पर इंजेक्शन के बाद 15-40 मिनट का होता है.
    3. इमेजिंग बॉक्स में मैट काले कागज जगह में मदद करने के लिए किसी भी नहीं hESCs द्वारा उत्सर्जित प्रकाश को अवशोषित करने के लिए याद रखें. Isoflurane साथ इमेजिंग कक्ष में माउस (पीठ अप), काले कागज के ऊपर रखें. 10 सेकंड के एक जोखिम समय के साथ शुरू करो. यदि संकेत संतृप्त है, समय जोखिम कम करने की कोशिश, अगर भी कमजोर, निवेश बढ़ा.
    4. एक बार संकेत जोखिम समय अपने माउस के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, छवियों को हर मिनट ले जब तक संकेत एक अधिकतम तक पहुँच शुरू करते हैं. यह सबसे अच्छा इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) "है कि अपने इंजेक्शन साइटों को कवर का चयन करके किया जाता है. प्रत्येक रॉय संकेत तीव्रता की निगरानी करके आप आसानी से तय कर सकते हैं जब संकेत को कम करने के लिए शुरू होता है, यह दर्शाता है कि अधिकतम संकेत तीव्रता तक पहुँच गया है. अधिकतम संकेत अपने अंतिम डेटा के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    5. जब आप अपने चित्रों के साथ संतुष्ट हैं, isoflurane से माउस को हटाने और यह अपने पिंजरे में जगा के लिए अनुमति देते हैं. आमतौर पर, माउस 15 मिनट के भीतर जाग चाहिए.
    6. Bioluminescence रिपोर्टर जीन इमेजिंग रूप में लंबे समय के लिए दैनिक, साप्ताहिक और मासिक दोहराया रूप में hESCs जानवर में जीवित कर सकते हैं. एक विकासशील teratoma से सिग्नल तेजी से समय पर बढ़ाने के लिए, सप्ताह के आदेश पर आम तौर पर, के रूप में hESCs पैदा करना शुरू.
    7. Bioluminescence छवियों के वांछित समय पाठ्यक्रम के बाद हासिल कर ली है, जानवर और बलिदान किया जा सकता है ऊतक वर्गों ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया.

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Discussion

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पीईटी और एमआरआई जैसे अन्य रूपरेखा की तुलना में, bioluminescence सीमित स्थानिक संकल्प और कम ऊतक पैठ उत्सर्जित फोटॉनों की अपेक्षाकृत कमजोर ऊर्जा (2-3 eV) के कारण है, इन कारणों के लिए यह इस प्रकार दूर किया गया है बड़े जानवरों में लागू नहीं है. हालांकि, bioluminescence कम लागत, उच्च throughput, और गैर इनवेसिव होने का लाभ है, यह अत्यधिक vivo स्टेम छोटे जानवरों में ट्रैकिंग सेल के लिए वांछनीय बना. गैर bioluminescence जैसे पीईटी और प्रतिदीप्ति constructs संवाददाता जीन एक संलयन रिपोर्टर जीन है कि अलग डोमेन के व्यक्तिगत रिपोर्टर जीन युक्त बना है बनाने के लिए luciferase के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हमारे समूह का उपयोग करता है एक संलयन fluc, monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mrfp) युक्त निर्माण, और दाद सिंप्लेक्स वायरस छोटे पशुओं में स्टेम सेल के व्यवहार के बहु - साधन के लिए ट्रैकिंग thymidine kinase (टीटीके, पीईटी रिपोर्टर जीन) छोटा है. समय के साथ, stably एकीकृत रिपोर्टर जीन अंतर्जात गुणसूत्र मशीनरी द्वारा जीन मुंह बंद करने के लिए विषय हो सकता है. एक पत्रकार जीन जीन मुंह बंद करने के लिए संवेदनशीलता निकट प्रमोटर अपनी अभिव्यक्ति ड्राइविंग के चुनाव के लिए संबंधित है. उदाहरण के लिए, cytomegalovirus प्रमोटर (pCMV) जल्दी hESCs में खामोश है. हमारी प्रयोगशाला मानव ubiquitin सी (जघन) प्रमोटर एक डबल संलयन की अभिव्यक्ति ड्राइव कई hESC सेल लाइनों में निर्माण के साथ अच्छी सफलता मिली है, और समय पर न्यूनतम संकेत हानि मनाया.

अंत में, पहले hESC व्युत्पन्न सेल पुनर्जनन नैदानिक ​​प्रासंगिक हो जाता है, कई बुनियादी जीवविज्ञान बाधाओं को दूर किया जाना चाहिए - अर्थात् कोशिका मृत्यु या apoptosis विभेदित कोशिकाओं, undifferentiated कोशिकाओं से teratoma गठन, और मेजबान जीव द्वारा प्रतिरक्षा अस्वीकृति का प्रत्यारोपण निम्नलिखित. इन और अन्य चुनौतियों ट्रैकिंग hESC engraftment, अस्तित्व, और प्राप्तकर्ता जीव के भीतर प्रसार के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला. जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन और अति संवेदनशील सीसीडी कैमरों के रूप में आणविक इमेजिंग तकनीक के विकास के लिए गैर इनवेसिव, कक्ष स्थान, प्रवास, प्रसार, और vivo में भेदभाव का दोहराव आकलन सक्षम है. इस तरह के रूप में इन टेक्नोलॉजीज hESC जीव विज्ञान के नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की दिशा में प्रयोगशाला से धक्का अनुवाद में मदद करेगा.

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Acknowledgments

टिम डोयल, पीएचडी और bioluminescence इमेजिंग के साथ सहायता के लिए Vivo इमेजिंग में लिए स्टैनफोर्ड सेंटर के लिए धन्यवाद. इसके अलावा मैट्रिक्स समाधान के साथ स्टेम सेल सह इंजेक्शन पर उसकी तकनीक को साझा करने के लिए Ngan हुआंग, पीएचडी के लिए धन्यवाद. अंत में, स्टीव के लिए धन्यवाद पीएच.डी., लगा पशु चिकित्सा जानवरों की देखभाल के साथ सहायता के लिए.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Hyclone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix Growth factor reduced (optional: phenol-red free) BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells Stem Cell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt Biosynth International, Inc
Collagenase IV solution Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates Techno Plastic Products 92006

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References

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Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).More

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