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Biology

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

doi: 10.3791/740 Published: May 2, 2008

Summary

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

Abstract

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 발견은 극적으로 재생 의료에 관심이 의료 과학자에 사용할 수있는 도구를 증가했습니다. 그러나, 살아있는 생물로, hESCs에서 차별 hESCs, 그리고 세포의 직접 분사는 지금까지 상당한 세포 사망, 기형 종의 형성, 및 호스트 면역 거부 반응에 의해 방해되었다. 이식 후 생체내 hESC 행동에을 이해하는 것은 새로운 이미징 기술은 길이 방향 hESC 현지화, 증식 및 생존을 모니터링해야합니다. 분자 영상은 조사에게 생체내 세포 일 동안 확산, 주, 심지어 개월 이내에 추적에 대한 높은 처리량, 저렴하고, 중요한 수단을 제공하고 있습니다. 이 발전은 크게 hESC의 engraftment, 확산, 생활 과목의 기형 종 - 형성 spatio - 시간적 동력학에 대한 이해를 증가하고 있습니다.

분자 이미징의 주요 사전은 생체내에서 다중 양상 이미징 플랫폼으로 분자 및 세포 생물학에서 비침 투 리포터 유전자의 assays의 확장되었습니다. 이 기자의 유전자는 숙주 세포의 transcriptional 기계를 활용 설계 발기인 및 강화의 통제하에, 벡터가 아닌 벡터 다양한 방법을 사용하여 세포에 도입하고 있습니다. 일단 세포에서 기자의 유전자를 사용 모터의 종류에 따라, 특정 생물 학적 또는 세포 조건 중 constitutively 또는 유일한 베꼈는데 수 있습니다. bioactive 단백질로 전사와 기자의 유전자의 번역은 다음 D - luciferin 같은 신호 생성 프로브를 사용하여 민감한, 비침 투 계측 (예 : CCD 카메라)와 검색입니다.

로 형광 이미징에 필요한 생체내에서 줄기 세포를 추적하는 흥분성의 조명의 필요성을 방지하기 위해, bioluminescence의 리포터 유전자 이미징 시스템은 발광을 유발에만 exogenously 관리 프로브가 필요합니다. 반딧불 Photinus pyralis에서 파생된 반딧불 루시페라제은, 광학 활성 대사, oxyluciferin에 D - luciferin을 catalyzes 효소를 인코딩합니다. 광학 활동 후 외부 CCD 카메라로 모니터링할 수 있습니다. 안정 기자 들고 세포들은 염색체 DNA 내에 구축 transduced 기자가 생체내에 hESC의 생존과 확산의 길이 모니터링있게 딸 세포에 DNA를 구성 전달합니다. 리포터 유전자 제품의 표현은 신호 생성을 위해 필요하기 때문에 또한, 오직 실용적 부모와 딸 세포는 bioluminescence 신호를 만들 것이다; apoptotic이나 죽은 세포가되지 않습니다.

이 동영상에서 특정 자료 및 bioluminescence 이미징과 함께 추적 줄기 세포 증식 및 기형 종의 형성에 필요한 방법은 설명한다.

Protocol

  1. 더블 퓨전 리포터 유전자의 건설
    1. 인간 배아 줄기 세포의 bioluminescence 이미징을 수행하기 위해서는 먼저 안정 등 Ubiquitin이나 EF1a 같은 제정 발기인에 의한 반딧불 루시페라제로 루시페라제 리포터 유전자를 표현 세포를 얻기 위해 필요합니다.
    2. 이 프로토콜의 초점은 기자의 유전자 응용 프로그램에, 자세한 절차를 여기에 제공되지 않습니다 때문에. 그러나, 우리 실험실의 일반적인 전략은 반딧불 루시페라제 (fluc)와 pCDNA 3.1 이내 스페이서 +로 구분하여 향상된 녹색 형광 단백질 (egfp)를 포함하는 이중 융합 구조 벡터를 사용하는 것입니다.
    3. 간단히 우리 두 융합 유전자가 원래 pCDNA 3.1 사이토 메갈로 바이러스 프로 모터 (+)의 하류에 위치하고 있었기 때문에 3.3 kbp의 단편은 자체 운영을 중지시키지 (SIN의 여러 복제 사이트에 출혈도 잡았 NdeI와 노티 소화하고 무딘 엔드를 사용하여 excised되었습니다 Ubiquitin 모터의 제어하에) lentiviral 벡터.

  2. Lentiviral 형질 도입
    1. hESCs 10의 감염의 다중성 (뫄) (106 전지 incubated 약 107의 바이러스 titer)의 통과 후 3~5일을 transduced 수 있습니다.
    2. 해동 바이러스 주식은 신선한 hESC 미디어에 직접 추가할 수 있습니다.
    3. 나중에 미디어 12 24 시간을 새로 고칩니다.
    4. 48 H 후, 전달 효율에 의해 질적으로 형광 현미경을 사용하여 평가하실 수 있습니다. 그 후, 외과는 감염된 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

  3. Culturing의 hESCs 및 설정 이미징 소개
    1. 문화 귀하의 루시페라제 긍정적인 hESCs를 피더없는 조건입니다. 우리는 일반적으로 표준 WiCell 프로토콜에 따라 에어컨 미디어 또는 상업적 중 하나를 사용하여 Matrigel 감소 성장 인자에 코팅 6 자 접시, 피더없는 미디어를 사용합니다.
    2. 루시페라제 긍정적인 세포를 감지하기 위해서는 기자 프로브 D - luciferin 이미 준비하셔야합니다. 45 MG / ML의 최종 농도에서 1-1.5 ML 준비에서, 나누어지는의 luciferin을 수행하려면. -20 ° C에서 aliquots을 유지하지 않을 때 종이 타월하지 않을 때 저장소에 함께 걸쳐 사용하고 조명에 노출을 피하 인치
    3. 루시페라제 긍정적인 세포를 시각화하기 위해, 우리는 IVIS 50 IVIS 200 이미징 시스템 (Xenogen 공사, 알라 메다, CA)을 사용합니다. 이 후자의 시스템은 작은 동물을 일시적으로 마취에 대한 통합 isoflourane 장치와 유도 챔버를 포함합니다.

  4. hESCs의 시험 관내 bioluminescence 이미징에
    1. 시험 관내 bioluminescence 이미징의 경우, 그것은 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 따라서, 영상 시스템은 선호 세포 배양 룸에서 멸균한다.
    2. 이미징 전에 세포 미디어를 제거하고 세포를 충당하기 위해 충분 PBS를 추가합니다. 예를 들어, hESC 문화를 포함하는 6 자 판의 각 잘하는 1mL PBS를 추가합니다.
    3. PBS로 D - Luciferin의 비율은 1:100해야하므로 6 잘 플레이트의 각 잘하는 해동 D - Luciferin 10 μL를 추가합니다.
    4. 잠시만 기다려 다음 일초의 노출 시간을 사용하여 이미지를 가져가라. 신호가 약한 경우, 노출 간격을 증가하고 다시 시도하십시오.
    5. 발광 생물 신호 휴대폰 번호를 반영, quantitation assays의 서로 다른 세포 숫자와 신호를 상관 관계 것을 수행할 수 있도록.

  5. 생체내 이미징에 대한 마우스 및 주입 세포의 준비
    1. 리포터 유전자 영상은 일, 주, 심지어 몇 달 동안 이식 후 추적 세포에 대한 높은 처리량, 저렴하고 민감한 방법을 제공합니다. 이식 줄기 세포가 자주, 기형종 형성 숙주의 면역 체계에 의해 거부, 또는 단순히 죽고 때문에 이것은 특히 중요합니다.
    2. 생체내 이미징에서 기형 종 형성을위한 가장 간단한 방법은 SCID 생쥐의 백업에 반딧불 루시페라제 리포터 유전자를 표현하고 IVIS 시스템 발광 생물 이미지를 획득 hESCs를 삽입하는 것입니다.
    3. 당신이 세포를 이식하기 위해 준비가되면, 세포를 풀어 여러 번 씻어하고, 성장 인자 감소 - matrigel과 DMEM의 1:1 혼합물에서 그들을 정지 dispase 또는 collagenase를 사용합니다. 일반적으로 우리가 먼저 차게 DME​​M으로 세포를 섞어 다음 matrigel에 추가합니다. 각각의 피하 주입 사이트에, 우리는 matrigel / DMEM 혼합물의 50-100 UL 볼륨에서 정지 200,000 개 셀을 주입. 휴대폰 번호는 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. 사전 주사로 얼음에있는 모든 유지되도록주의를 기울이십시오.
    4. 세포가 준비가되면,이 켜져 isoflurane 흐름 유도 상자에 배치하여 마우스를 마취. 1-5분 후, 마우스 잠이이고 지속적인 isoflurane으로 수술대에 둘 수 있습니다.
    5. 모피 자연스럽게 자동 fluoresces하고는 발광 생물 이미지를 모호한 수 있기 때문에, 우리는 마우스의 뒷면에서 머리를 제거해야합니다. 이 작업을 수행하는 가장 쉬운 방법은 전기 면도기를 사용하는 것입니다,하지만 당신은 머리 - 제거 젤을 사용할 수 있습니다. 소독에 알코올로 닦아나중에 피부
    6. 다음 주사기에 세포 현탁액을 그립니다. 그들은 세포와 방해할 않기 때문에 23-27 게이지 바늘은 최고의 작동합니다. 바늘이 (<23 게이지) 너무 큰 경우 바늘의 넓이 세포가 다시 밖으로 누출 수있는을 통해 큰 구멍을 떠날 수 있습니다.
    7. 마우스의 뒷면에 피부 아래에있는 세포를 주사. 피부가 매우 느슨한 때문에, 핀치에 엄지와 집게손가락을 사용하고 삽입하고자하는 영역을 스트레칭. 너무 깊이 주사로 치료하지 복용, 피부 아래에 주사를 막. 또한, 플런저를 우울 동안 사출 사이트의 밖으로 미끄러져에서 바늘을 유지하려고이 다시 주입하려고하면 세포가 누출 수있는을 통해 피부에 구멍을 만드는 것을 방지할 수 있습니다.
    8. 세포 주입 후, 마우스 깨어있게하고 bioluminescence 이미징을위한 다시 anesthetizing 전에 주위를 실행하는 데 몇 시간을 기다립니다. 이렇게하면 isoflurane 독성을 방지합니다.

  6. 이식 세포의 생체내 bioluminescence 이미징에
    1. 전체 동물 bioluminescence 이미징을 위해, 우리는 375 밀리그램 / kg 체중에서 D - luciferin의 intraperitoneal 주사를 않습니다. 사전 주사로 주사 량을 계산하기 위해 동물을 나가는거야.
    2. 그냥 정중선에서, 복막에있는 D - luciferin을 주사. 너무 깊이 가지 않은 또는 내부 장기를 손상시킬 수주의하십시오. 마우스 깨어하기 시작하면, 녹아웃 상자에 다시 배치하고 몇 분만 기다립니다. 생쥐의 경우 최대 bioluminescence은 일반적으로 주사 후 15-40 분을 발생합니다.
    3. hESCs가 배출되지 않은 빛을 흡수에 도움이되는 이미징 상자에 무광택 검은 종이를 삽입해야합니다. 검은 종이 위에, isoflurane과 이미징 챔버에서 마우스 (후면까지)을 놓으십시오. 10초의 노출 시간과 함께 시작합니다. 신호가 포화되면, 노출 시간을 감소 노력, 너무 약한 경우, 노출을 증가시킵니다.
    4. 신호 노출 시간이 마우스에 최적화된되면, 신호가 최대에 도달할 때까지 이미지를 매 분 복용 시작합니다. 이것은 가장 사출 사이트를 커버 "관심 영역 (ROI)"을 선택 이미징 소프트웨어를 사용하여 이루어집니다. 각각의 투자 수익 (ROI)에서 신호 강도를 모니터링함으로써 쉽게 최대 신호 강도에 도달되었음을 나타내는 신호가 감소하기 시작하면 확인할 수 있습니다. 최대 신호는 최종 데이터로 사용해야합니다.
    5. 당신이 이미지에 만족하는 경우, isoflurane에서 마우스를 제거하고는 새장에 깨어 수 있습니다. 보통 마우스는 15 분 이내에 깨어날 것입니다.
    6. hESCs이 동물의 생존과 같은 Bioluminescence 기자의 유전자 이미징이있는 동안, 매일 주별 및 월별 반복 수 있습니다. hESCs가 세포 분열 따위에 의해 번식을 시작으로 발전 기형 종에서 신호는 일반적으로 주의 순서에, 시간이 지남에 따라 기하 급수적으로 증가합니다.
    7. bioluminescence 이미지의 원하는 시간 코스 취득 후, 동물 희생 및 조직 섹션 조직학에 사용할 수 있습니다.

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Discussion

이러한 PET와 MRI와 같은 다른 modalities 비교, bioluminescence 제한된 공간 해상도와 방출되는 광자의 상대적으로 약한 에너지 (2-3 EV)으로 인해 감소 조직 침투력을 가지고, 이러한 이유로 그것은 지금까지 큰 동물에서 적용되지 않았습니다. 그러나, bioluminescence 작은 동물의 생체내 추적의 줄기 세포에 대해 그것이 매우 바람직 만들기, 저렴한 비용, 높은 처리량, 그리고 비침습되는 장점이 있습니다. 이러한 PET 및 형광 구조와 같은 비 bioluminescence 기자의 유전자는 개별 기자의 유전자를 포함하는 다른 도메인으로 구성되어 있습니다 퓨전 리포터 유전자를 만들 수 루시페라제와 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그룹은 융합 fluc, monomeric 적색 형광 단백질 (mrfp)이있는 구축 사용하며, 헤르페스 심플 렉스 바이러스는 작은 동물의 줄기 세포 행동의 여러 양상의 추적 thymidine 키나제를 (TTK, 애완 동물 리포터 유전자) 잘립니다. 시간이 지남에 안정적으로 통합 기자 유전자는 염색체 내생 기계에 의해 유전자 입을 대상이 될 수 있습니다. 유전자 입을으로 리포터 유전자의 자화율는 밀접하게 발기인는 표현을 운전의 선택에 관련되어 있습니다. 예를 들어, 사이토 메갈로 바이러스 프로 모터 (pCMV)는 빠르게 hESCs에 침묵이다. 우리 연구실은 여러 hESC 세포 라인에 건설 더블 퓨전의 표현을 주도하는 인간 ubiquitin - C 프로 모터 (음모)와 좋은 성공을 거둘수 있으며, 시간이 지남에 따라 최소한의 신호 손실을 관찰했습니다.

hESC - 파생 세포 재생이 임상 관련되기 전에 결론적으로, 몇몇 기본적인 생물 학적 장애물이 극복되어야합니다 - 차별화된 세포, undifferentiated 세포에서 기형 종의 형성과 숙주 면역 거부 이식 다음과 같은 즉 세포 사망 또는 apoptosis합니다. 이들과 다른 도전 추적 hESC의 engraftment, 생존, 그리고받는 유기체 내에서 확산의 필요성을 강조 표시합니다. 같은 반딧불 루시페라제 리포터 유전자와 매우 민감한 CCD 카메라와 같은 분자 이미징 기술의 개발은 휴대폰 위치, 마이 그 레이션, 증식, 그리고 생체내의 분화의 비침습, 반복적인 평가를 활성화하고 있습니다. 이러한 기술은 임상 응용으로 연구실에서 hESC 생물학의 푸시 번역 도움이 될 것입니다.

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Acknowledgments

팀 도일, 박사 및 bioluminescence 이미징과 지원 VIVO 이미징에 대한 스탠포드 센터에 감사드립니다. 또한 매트릭스 솔루션과 줄기 세포 공동 사출 그녀의 기술을 공유 Ngan 황, 박사 덕분에. 마지막으로, 스티브 덕분에 박사에게 펠트 동물 동물 보호와 지원.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Hyclone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix Growth factor reduced (optional: phenol-red free) BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells Stem Cell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt Biosynth International, Inc
Collagenase IV solution Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates Techno Plastic Products 92006

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References

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Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).More

Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).

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