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Biology

In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

doi: 10.3791/740 Published: May 2, 2008

Summary

Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.

Abstract

A descoberta de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) aumentou drasticamente as ferramentas disponíveis para cientistas médicos interessados ​​em medicina regenerativa. No entanto, a injeção direta de hESCs e células diferenciadas de hESCs, em organismos vivos até agora tem sido dificultada pela morte celular significativa, a formação de teratoma, e rejeição imune do hospedeiro. Compreensão do comportamento em CTEh vivo após o transplante exige técnicas de imagem inovadora para monitorar longitudinalmente localização CTEh, proliferação e viabilidade. A imagem molecular tem dado investigadores um meio de alto rendimento, baixo custo, e sensível para o rastreamento na proliferação celular vivo ao longo de dias, semanas e até meses. Este avanço tem aumentado significativamente a compreensão da cinética espaço-temporal de enxerto CTEh, proliferação e formação de teratoma, nos indivíduos que vivem.

Um grande avanço em imagem molecular tem sido a extensão dos ensaios não-invasivo gene repórter da biologia molecular e celular em plataformas in vivo modalidade multi-imagem. Estes genes repórter, sob controle de promotores e potenciadores de engenharia que se aproveitam da maquinaria transcricional da célula hospedeira s, são introduzidas nas células usando uma variedade de métodos de vetor e vetor não. Uma vez na célula, genes repórter pode ser transcrita ou constitutivamente ou apenas sob determinadas condições biológicas ou celular, dependendo do tipo de promotor usado. Transcrição e tradução de genes repórter em proteínas bioativas é detectada com instrumentação, sensível não-invasiva (por exemplo, câmeras CCD) usando o sinal de geração de sondas, tais como D-luciferina.

Para evitar a necessidade de luz de excitação para rastrear as células-tronco in vivo como é necessário para imagens de fluorescência, bioluminescência repórter sistemas de imagem gene exigem apenas uma sonda exogenamente administrada para induzir a emissão de luz. Firefly luciferase, derivado do Photinus firefly pyralis, codifica uma enzima que catalisa D-luciferina ao opticamente metabólito ativo, oxiluciferina. Atividade óptica pode ser monitorada com uma câmera CCD externa. Estavelmente transduzidas células que carregam o repórter construir dentro de seu DNA cromossômico vai passar o repórter construção de DNA para as células filhas, que permitam um acompanhamento longitudinal de sobrevivência e proliferação CTEh in vivo. Além disso, como expressão do produto do gene repórter é necessário para a geração do sinal, apenas as células viáveis ​​pai e filha vai criar sinal de bioluminescência; células apoptóticas ou morto, não.

Neste vídeo, os materiais e métodos específicos necessários para a proliferação de rastreamento de células-tronco e formação de teratoma com a imagem de bioluminescência será descrito.

Protocol

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  1. Construção de Gene Double Fusion Reporter
    1. A fim de realizar imagem de bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas, é preciso primeiro obter células que expressam de forma estável um gene repórter luciferase, como vaga-lume luciferase dirigido por um promotor constitutivo como Ubiquitina ou EF1a.
    2. O foco deste protocolo é em aplicações gene repórter, então os procedimentos detalhados não são fornecidos aqui. No entanto, a estratégia geral do nosso laboratório é usar um vetor de construção de dupla fusão que contém firefly luciferase (flutuações) e proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) separados por um espaçador dentro pCDNA 3.1 +.
    3. Resumidamente, o nosso gene de fusão dupla foi originalmente localizada a jusante do promotor citomegalovírus em pCDNA 3.1 (+), de modo que o fragmento foi retirado 3,3 kbp usando NdeI e NotI digestão e finais blunt ligada no sítio múltiplo de clonagem de uma auto-inativação SIN ( ) vector lentiviral, sob controle de um promotor da ubiquitina.

  2. Transdução lentiviral
    1. hESCs pode ser transduzidas 3-5 dias após a passagem de uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 (título viral de cerca de 107 incubadas com 106 células).
    2. O estoque viral descongeladas podem ser adicionados diretamente à mídia CTEh fresco.
    3. Atualizar o media 12 e 24 horas depois.
    4. Após 48 h, a eficiência de transdução pode avaliados qualitativamente por meio de microscopia de fluorescência. Posteriormente, FACS pode ser usada para isolar as células infectadas.

  3. HESCs cultura e Introdução à Imagem Set-up
    1. Cultura da sua luciferase hESCs positiva no alimentador sem condições. Normalmente, seguir o protocolo WiCell padrão e utilizar placas de 6 poços revestida em fator de crescimento reduzida Matrigel, usando meios condicionados ou comercial, alimentador de mídia livre.
    2. De detectar as células luciferase positivo, você precisará ter a sonda repórter D-luciferina já preparado. Para fazer isso luciferina alíquota, em mL 1-1,5 preparações numa concentração final de 45 mg / mL. Manter as alíquotas a -20 ° C, quando não em uso e evitar a exposição à luz, cobrindo com toalha de papel quando não estiver em armazenamento.
    3. Para visualizar as células luciferase positivo, usamos IVIS 50 e 200 IVIS Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Este último sistema inclui um aparelho integrado isoflourane e câmara de indução para a anestesia temporária de pequenos animais.

  4. Na geração de imagens vitro bioluminescência de hESCs
    1. In vitro para a imagem de bioluminescência, é importante manter condições estéreis. Portanto, o sistema de imagem deve ser estéril, de preferência em uma sala de cultura celular.
    2. Antes de imagem, remova a mídia de células e adicionar PBS suficiente apenas para cobrir as células. Por exemplo, adicione 1 mL de PBS a cada poço de uma placa de 6 poços contendo o seu CTEh culturas.
    3. A proporção de D-Luciferina a PBS deve ser 1:100, então adicionar 10 mL de descongelado D-Luciferina a cada poço da placa de 6 poços.
    4. Espere um minuto, em seguida, tomar uma imagem usando um tempo de exposição de um segundo. Se o sinal é fraco, aumentar o intervalo de exposição e tente novamente.
    5. O sinal bioluminescente reflete o número de células, por isso os ensaios de quantificação pode ser realizada sinal de que se correlacionam com os números de celulares diferentes.

  5. Preparação de rato e células injetando para in vivo de imagens
    1. Gene repórter de imagem fornece um método de alto rendimento, barato e sensível para rastreamento de células após o transplante ao longo de dias, semanas e até meses. Isto é especialmente importante uma vez que as células-tronco transplantadas freqüentemente formam teratomas, são rejeitadas pelo sistema imunológico do hospedeiro, ou simplesmente morrer.
    2. O método mais simples para geração de imagens a formação de teratoma in vivo é injetar hESCs que expressam o gene repórter luciferase vagalume para as costas de camundongos SCID e adquirir imagens bioluminescentes com o sistema IVIS.
    3. Quando você está pronto para o transplante de células, use dispase ou colagenase para soltar as células, lave várias vezes, e suspendê-las em uma mistura 1:1 de fator de crescimento reduzido Matrigel e DMEM. Normalmente nós primeiro mix as células com DMEM refrigerados e depois adicionar no Matrigel. Para cada local de injeção subcutânea, injetamos 200.000 células suspensas em um volume 5-10 ul da mistura matrigel / DMEM. O número de células pode ser ajustada dependendo da sua aplicação. Lembre-se de manter tudo em gelo antes da injeção.
    4. Uma vez que as células estão prontas, anestesiar o rato, colocando-o na caixa de indução com isoflurano fluxo ligado. Depois de 1-5 minutos, o mouse está dormindo e pode ser colocado na mesa de operação contínua com isoflurano.
    5. Porque pele naturalmente auto-fluorescente e pode obscurecer a imagem de bioluminescência, teremos de remover o cabelo do lado de trás do mouse. A maneira mais fácil de fazer isso é usar um barbeador elétrico, mas você também pode usar depilação-géis. Limpe com álcool para esterilizara pele depois
    6. Em seguida, elaborar a sua suspensão de células em uma seringa. 23-27 agulhas funcionam melhor que elas não irão entupir com as células. Se a agulha é muito grande (<23 gauge) no trato agulha pode deixar um grande buraco através do qual as células podem vazar para fora.
    7. Injetar as células sob a pele em volta do mouse. Porque a pele é bem solta, use o polegar eo indicador para comprimir e estender a área que deseja injetar. Injetar sob a pele, tomando cuidado para não perfurar muito profundamente. Além disso, tente manter a agulha deslizando para fora do local de injecção enquanto pressiona o êmbolo: isso vai impedir a criação de um buraco na pele através do qual as células podem vazar se você tentar injetar novamente.
    8. Depois que as células são injetadas, esperar algumas horas para permitir que o mouse para acordar e correr ao redor antes de voltar a anestesiar a imagem de bioluminescência. Fazê-lo evita toxicidade isoflurano.

  6. Em imagem de bioluminescência vivo de células transplantadas
    1. Para imagens de toda a bioluminescência de animais, fazemos uma injeção intraperitoneal de D-luciferina em 375 peso corporal mg / kg. Pesar o animal para calcular a dose antes da injeção.
    2. Injetar o D-luciferina no peritônio, ao largo da linha média. Tenha cuidado para não ir muito fundo ou você pode danificar os órgãos internos. Se o rato começa a acordar, coloque-o novamente na caixa de knockout e esperar um minuto ou dois. Para camundongos, a bioluminescência máximo ocorre geralmente 15-40 minutos após a injeção.
    3. Lembre-se de colocar papel preto fosco na caixa de imagem para ajudar a absorver toda a luz não é emitida pela hESCs. Posicione o mouse (até backside) na câmara de imagem com isoflurano, em cima do papel preto. Comece com um tempo de exposição de 10 segundos. Se o sinal é saturado, tente diminuir o tempo de exposição, se demasiado fraco, aumentar a exposição.
    4. Uma vez que o tempo de exposição do sinal foi otimizado para o seu mouse, as imagens começam a tomar a cada minuto até que o sinal atinge um máximo. Este é o melhor feito usando o software de imagem para selecionar "regiões de interesse (ROI)", que cobrem seus locais de injecção. Ao monitorar a intensidade do sinal em cada ROI você pode facilmente determinar quando o sinal começa a diminuir, indicando que a intensidade máxima do sinal foi atingido. A máxima do sinal deve ser utilizado como seus dados final.
    5. Quando estiver satisfeito com suas imagens, remova o mouse de isoflurano e permitir que ele acorda em sua gaiola. Normalmente, o mouse deve acordar em 15 minutos.
    6. Bioluminescência imagem gene repórter pode ser repetida diariamente, semanalmente e mensalmente durante o tempo que o hESCs sobreviver no animal. Sinal de um teratoma desenvolvimento irá aumentar exponencialmente ao longo do tempo, tipicamente da ordem de semanas, como o hESCs começam a proliferar.
    7. Após o curso de tempo desejado de imagens bioluminescência é adquirido, o animal pode ser sacrificado e secções de tecido usado para histologia.

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Discussion

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Em comparação com outras modalidades, tais como PET e RM, a bioluminescência tem resolução espacial limitada penetração nos tecidos e reduzido devido à energia relativamente fraca de fótons emitidos (2-3 eV); por estas razões que até agora não foi aplicável em animais de grande porte. No entanto, a bioluminescência tem a vantagem de ser de baixo custo, alto rendimento, e não-invasivo, tornando-se altamente desejável para in vivo com células-tronco de rastreamento em pequenos animais. Genes não bioluminescência-repórter, como construções de PET e de fluorescência pode ser utilizado em conjunto com luciferase para criar um gene repórter de fusão que é composto de diferentes domínios que contêm os genes repórter individual. Por exemplo, o nosso grupo usa uma fusão construir contendo flutuações, proteína monomérica vermelha fluorescente (MRFP) e vírus herpes simplex truncado timidina quinase (ttk, um gene repórter PET) para multi-modalidade de monitoramento do comportamento de células-tronco em pequenos animais. Ao longo do tempo, genes repórter estavelmente integrado pode estar sujeito ao silenciamento de genes pela maquinaria endógena cromossômicas. A suscetibilidade do gene repórter de silenciamento de genes está intimamente relacionada com a escolha do promotor dirigindo sua expressão. Por exemplo, o promotor de citomegalovírus (pCMV) é rapidamente silenciada em hESCs. Nosso laboratório tem tido um bom sucesso com o promotor da ubiquitina-C humano (púbica) para dirigir a expressão de uma fusão dupla construir em múltiplas linhagens celulares, CTEh, e observaram a perda de sinal mínima ao longo do tempo.

Em conclusão, antes CTEh derivados de regeneração celular torna-se clinicamente relevante, várias barreiras biológicas básicas devem ser superados - ou seja, a morte celular ou apoptose após o transplante de células diferenciadas, a formação de teratoma de células indiferenciadas, e pela rejeição imunológica do organismo hospedeiro. Esses e outros desafios destacam a necessidade de enxerto CTEh rastreamento, sobrevivência e proliferação no organismo receptor. O desenvolvimento de técnicas de imagem molecular, como o gene repórter luciferase firefly e câmeras CCD ultra-sensível permitiu não-invasivo de avaliação, repetitiva de localização celular, migração, proliferação e diferenciação in vivo. Tecnologias como estas ajudarão tradução toque de biologia CTEh do laboratório para aplicações clínicas.

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Acknowledgments

Graças a Tim Doyle, PhD e do Centro de Stanford para In Vivo Imaging para assistência com a imagem de bioluminescência. Também graças à Ngan Huang, PhD para compartilhar sua técnica sobre células-tronco co-injeção com uma solução matriz. Por último, graças a Steve Felt, Ph.D. de assistência com cuidados animais veterinária.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Hyclone
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix Growth factor reduced (optional: phenol-red free) BD Biosciences
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells Stem Cell Technologies
Phosphate Buffered Saline (PBS)
D-Luciferin Firefly, potassium salt Biosynth International, Inc
Collagenase IV solution Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).
Baked Pasteur pipets
6-well tissue culture-treated plates Techno Plastic Products 92006

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References

  1. Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
  2. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  3. Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
  4. Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
  5. Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
  6. Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
  7. Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
  8. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
  9. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
  10. Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
  11. Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
  12. Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
  13. Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
  14. Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
  15. Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
  16. Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
  17. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
  18. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
  19. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
  20. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  21. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
  22. Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
  23. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
  24. Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. Forthcoming.
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Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).More

Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).

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