यह वीडियो स्वस्थानी संकरण, एक विधि है जिसके द्वारा स्थानिक और लौकिक 2 अलग जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न युवा लड़की भ्रूण में visualized किया जा सकता में 2 रंग पूरे माउंट दर्शाता है. इस पद्धति का मूल दाऊद Wilkinson, डोमिंगोस हेनरिक, फिल Ingham और ईशबोशेत Horowicz डेविड द्वारा पेश किया गया था.
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह मस्तिष्क, न्यूरल ट्यूब, somite और दिल primordia गठन में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. इस वीडियो स्वस्थानी संकरण में 2 रंग पूरे माउंट में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहला, भ्रूण अंडे से dissected है और paraformaldehyde में तय है. दूसरा, भ्रूण prehybridization के लिए कार्रवाई की है. भ्रूण तो दो अलग अलग जांच, डीआईजी युग्मित, और एक FITC के लिए युग्मित के साथ संकरित है. रातोंरात संकरण के बाद, भ्रूण डीआईजी युग्मित एंटीबॉडी के साथ incubated है. डीआईजी सब्सट्रेट के लिए रंग की प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया, और ब्याज के क्षेत्र नीले प्रकट होता है. भ्रूण तो FITC एंटीबॉडी के साथ मिलकर incubated है. भ्रूण FITC के साथ रंग की प्रतिक्रिया के लिए कार्रवाई की है, और ब्याज के क्षेत्र लाल प्रकट होता है. अंत में, भ्रूण तय है और संसाधित और phtograph लिए सेक्शनिंग. समस्या निवारण मार्गनिर्देशिका भी प्रस्तुत किया है.
2 रंग में पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण विधि जीन अभिव्यक्ति की दोनों स्थानिक और लौकिक पैटर्न को निर्धारित करने के लिए, ब्याज की एक या दो जीनों का उपयोग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आवेदन जीन उपन्यास जीन की अभिव?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Eggs | Animal | Charles River | Premium Fertile | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher | 14-062 | |
Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
Microcapillary tube | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Tween-20 | Reagent | Sigma | P1379-100ML | |
Proteinase K | Sigma | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher | PR-V4261 | |
EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher | ||
SDS | Reagent | Fisher | BP166-100 | |
Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
Boehringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Applied Sciences | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson Immuno | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11093274910 | |
NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Applied Sciences | 11681451001 | |
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11426338910 | |
2M Tris | BP1759-500 | Fisher | ||
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma | 429325-100ML | Under hood |