Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.
Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia oluşumu gen ekspresyonu çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video 2-renk tüm montaj in situ hibridizasyon farklı adımları gösteriyor; İlk yumurta, embriyo disseke ve paraformaldehid sabit. İkincisi, embriyo prehybridization için işlenir. Embriyo daha sonra iki farklı probları, DIG akuple bir FITC akuple melezleşmiştir. Gecede hibridizasyon, embriyo DIG birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. DIG substrat için renk reaksiyonu ve ilgi bölge mavi görünür. Embriyo daha sonra FITC birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. Embriyo FITC ile renk reaksiyonu için işlenir ve ilgi bölge kırmızı görünür. Son olarak, embriyo, sabit ve işlenmiş phtograph ve kesit. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.
In situ hibridizasyon yöntemi 2-renk tüm montaj, ilgi duyulan bir ya da iki gen, gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desenler belirlemek için kullanılır. Uygulamalar yeni genlerin gen ekspresyonu değerlendirilmesi (örneğin 1,2 yanı sıra, gen ekspresyonu aşağıdaki hakaret değişiklikler (embriyonik manipülasyonlar 3, boncuk 4, ve RNA veya DNA elektroporasyon 5 oluşumlar) içerir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Eggs | Animal | Charles River | Premium Fertile | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher | 14-062 | |
Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
Microcapillary tube | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Tween-20 | Reagent | Sigma | P1379-100ML | |
Proteinase K | Sigma | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher | PR-V4261 | |
EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher | ||
SDS | Reagent | Fisher | BP166-100 | |
Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
Boehringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Applied Sciences | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson Immuno | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11093274910 | |
NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Applied Sciences | 11681451001 | |
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11426338910 | |
2M Tris | BP1759-500 | Fisher | ||
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma | 429325-100ML | Under hood |