Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.
Abstract
Dal suo sviluppo da Sakmann e Neher 1, 2, la patch clamp si è affermata come una tecnica estremamente utile per la misurazione elettrofisiologica dei canali ionici singole o multiple nelle cellule. Questa tecnica può essere applicata a canali ionici, sia il loro ambiente nativo ed espresso in cellule eterologhe, come gli ovociti raccolti dalla rana africana artigliata, Xenopus laevis. Qui, descriviamo la consolidata tecnica di registrazione patch clamp da ovociti di Xenopus. Questa tecnica viene utilizzata per misurare le proprietà dei canali ionici espressi sia nelle popolazioni (macropatch) o singolarmente (un solo canale di registrazione). Ci concentriamo sulle tecniche per ottimizzare la qualità della preparazione degli ovociti e la generazione di tenuta. Con tutti i fattori ottimizzato, questa tecnica dà una probabilità di generazione sigillo di successo superiore al 90 per cento. Il processo può essere ottimizzato in modo diverso da ogni ricercatore sulla base dei fattori lui o lei trova la più importante, e vi presentiamo l'approccio che hanno portato al più grande successo nelle nostre mani.
Protocol
Parte 1: Rimozione della membrana vitellina Preparare due serie di pinze. Noi preferiamo n ° 5 pinze, dove un gruppo è stata leggermente affilato con una lima. Anche preparare una pipetta di vetro trasferimento da taglio e la lucidatura fuoco un 7 "pipetta Pasteur. Consigliato: Per evitare che gli ovociti di scivolare, tagliare un cerchio di griglia (1 quadrati mm) e colla nel fondo di un piatto 60 millimetri Petri. Questo piatto può essere riutilizzata all'infinito se tenuto pul…
Discussion
Ci sono molti parametri di registrazione elettrofisiologica non discusso qui. Installazione impianto di perforazione, il rumore del sistema di gestione, espressione dei canali e protocolli di registrazione sono anche fondamentali per buoni risultati sperimentali.
Nella nostra esperienza, questi sono i parametri più critici per formare guarnizioni affidabile: gli ovociti di qualità, eliminando la membrana vitellina velocemente (aka, "peeling"), utilizzare pipette appena tirato al riparo dalla polvere, pipette liscio, pres…
Acknowledgements
Ricetta soluzione restringimento è dal laboratorio di RW Aldrich. Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).