Detta är tänkt som en introduktion till patch clamp-inspelning från Xenopus laevis oocyter. Det omfattar vitelline membran borttagning, bildandet av en gigaohm tätning (gigaseal) och valfria omvandlingen av plåstret på utsidan ut topologi.
Abstract
Sedan dess utveckling genom Sakmann och Neher 1, 2, har patch clamp etablerat sig som en mycket användbar teknik för elektrofysiologiska mätningar av ett eller flera jonkanaler i cellerna. Denna teknik kan tillämpas på jonkanaler i både deras naturliga miljö och uttrycks i heterolog celler, t.ex. oocyter skördats från klor afrikanska grodan, Xenopus laevis. Här beskriver vi den väletablerade tekniken med patch clamp inspelning från Xenopus oocyter. Denna teknik används för att mäta egenskaperna hos uttryckt jonkanaler antingen i populationer (macropatch) eller individuellt (singel-kanals inspelning). Vi fokuserar på tekniker för att maximera kvaliteten i äggcellen förberedelse och tätning generation. Med alla faktorer optimeras, ger denna teknik en sannolikhet för framgångsrik säl generationen över 90 procent. Processen kan optimeras på olika sätt av varje forskare bygger på de faktorer som han eller hon finner viktigast, och vi presenterar den metod som lett till den största framgången i våra händer.
Protocol
Del 1: Ta bort vitelline membranet Förbered två uppsättningar av tång. Vi föredrar nr 5 pincett, där en uppsättning har varit något slipas med en fil. Också utarbeta en pipett glas överlåtelse genom putsning och eld-polering en 7 "pasteurpipett. Rekommenderas: att förhindra att ägg från att halka, skär en cirkel av galler (1 mm rutor) och lim i botten av en 60mm petriskål. Denna maträtt kan återanvändas på obestämd tid om hålls ren mellan användningarna. …
Discussion
Det finns många parametrar elektrofysiologiska inspelning inte diskuteras här. Rigg setup, system för bullerbekämpningen, kanal uttryck, och protokoll inspelning är alla också kritiska till goda experimentella resultat.
Enligt vår erfarenhet, dessa är de mest kritiska parametrarna för att bilda pålitliga tätningar: hög kvalitet ägg, ta bort vitelline membranet snabbt (aka "peeling"), använder nya drog pipetter skyddas från damm, släta pipetter, positivt tryck användas vid inträde i badet lösning, korta t…
Acknowledgements
Krympande lösning recept från labbet i RW Aldrich. Vi tackar följande finansiärer och stiftelser till stöd: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, muskeldystrofi Association, Donald B. och Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein fonden och McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).