चिकी में पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला के लिए विधि
Summary
यह वीडियो पूरी माउंट immunohistochemistry, एक विधि है जिसके द्वारा एक प्रतिजन के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न जवान लड़की भ्रूण में visualized किया जा सकता है दर्शाता है. इस पद्धति का मूल रूप से जेन डोड और टॉम Jessell द्वारा पेश किया गया था.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह मस्तिष्क, न्यूरल ट्यूब और somite विकास में एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. यह वीडियो पूरी माउंट एंटीबॉडी एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर धुंधला में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहला, भ्रूण अंडे से dissected है और paraformaldehyde में तय है. दूसरा, अंतर्जात peroxidase निष्क्रिय है, भ्रूण तो प्राथमिक एंटीबॉडी के संपर्क में है. कई washes के बाद, भ्रूण माध्यमिक एचआरपी को संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ incubated है. Peroxidase की गतिविधि diaminobenzidine सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए पता चला है. अंत में, भ्रूण तय है और फोटोग्राफी और सेक्शनिंग के लिए कार्रवाई की जाती है. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग पर इस विधि का लाभ यह है कि भ्रूण मोम सेक्शनिंग के लिए संसाधित किया जा सकता है, इस प्रकार सक्षम पार अनुभाग में प्रतिजन साइटों का अध्ययन. इस पद्धति का मूल रूप से जेन डोड और टॉम Jessell द्वारा शुरू की गई थी<sup> 1</sup>.
Protocol
Discussion
इस वीडियो युवा लड़की भ्रूण में पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन में विभिन्न चरणों को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से 2,3 चूजा में उपन्यास एंटीबॉडी के स्थानिक और लौकिक लक्षण वर्णन के लि?…
Acknowledgements
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (PAX7 15.3B9) (जे डोड, टीएम Jessell और ए Kawakami) विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा NICHD और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा, जीव विज्ञान के विभाग के तत्वावधान में विकसित बैंक से प्राप्त किया गया , आयोवा. डीपी रुथ Kirschstein पुरस्कार DA021977 01A1-1F32 के नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान से प्राप्तकर्ता है. यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
