Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.

Mit sistemi, ubikuitinin uç terminale ve UBI ve C terminali CUB yarımlarına tam uzunlukta bir psödo-ubikuitin molekülüne yeniden yapılandırılabilme yeteneğini ifade eden bölünmüş ubikuitin kavramına dayanmaktadır. Bu sulandırma, bir ISIN 13'ün glisin mutasyonuna eklenmesi için vahşi tip NUBI kullanıldığında kendiliğinden olsa da, NUBG adı verilen bir fragmanın üretilmesi, CUV'ye olan afinitesini büyük ölçüde azaltır, böylece pseu ubikitin oluşumunu bloke eder. NUBG ve CUB sırasıyla protein A ve protein B'ye kaynaşmışsa ve A ve B etkileşime girebiliyorsa, pseu ubikitin molekülü bir kez daha oluşturulabilir.

Efsanede, integral membran yemleri, yapay bir transkripsiyon faktörüne bağlı CUB fragmanından oluşan saldırı için kaynaştırılır. Övgüler NUBG fragmanına kaynaştırılırken, yem ve av arasındaki bir etkileşim, psödo-ubikitin'in yeniden yapılandırılmasına yol açar ve bu da makas olarak gösterilen sitozolik de ubikitinated enzimler tarafından tanınabilir. Bu enzimler, CUB'un C terminalinden sonra parçalanır ve transkripsiyon faktörünü serbest bırakır, bu daha sonra çekirdek ve aktivatör raportör sistemine girebilir ve BA av etkileşimlerinin meydana geldiği hücrelerin seçici izolasyonuna ve tanımlanmasına izin verir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Moleküler Genetik ve Biyokimya bölümlerinde Igor STAARs Lab'dan Janie Snyder. Bugün size membran kullanımı için bir prosedür göstereceğim, iki hibrit veya efsane, ve bu prosedürü laboratuvarımızda integral membran proteinlerinin etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Efsane analizi yapmadan önce, yem proteininizin hücrenin sitozolünde N ve/veya C terminaline sahip olduğunu doğrulayın. CUB Lex A VP 16 etiketi, böyle bir terminalde proteininize kaynaştırılmalıdır. Transkripsiyon faktörü salınımı için gerekli olan de ubikitinated enzimler sitozolde bulunduğundan, yem proteininizin topolojisi bilinmiyorsa, hem NNC terminalinde etiketlenmiş yapılar oluşturabilir hem de kısaca açıklanan N-U-B-G-I kontrol testini kullanarak, bunlardan herhangi birinin efsanede kullanım için uygun olup olmadığına bakın, böylece belirli bir terminalin sitosolik olduğunu gösterir.

Ardından, efsanenin iki ana varyantından hangisinin deneyiniz için uygun olduğuna karar verin. Doğal maya proteinleri için, entegre mit veya immy tercih edilen yöntemdir. Imy'de Bates, CUB Lex bir VP 16 etiketi ile içsel olarak etiketlenir ve bu da onları yerel destekçilerinin kontrolü altında bırakır.

Bu, Bates'in vahşi tip ekspresyon seviyesinin, doğal olmayan maya proteinleri için artan sayıda yanlış pozitif, geleneksel efsane veya T efsanesi gibi protein aşırı ekspresyonu ile ilişkili sorunları ortadan kaldırmaya yardımcı olması nedeniyle avantajlıdır, burada CU B Lex AV V, VP 16 etiket yemi, bir plazmidden topikal olarak ECT'yi aşırı eksprese eder. Bu protokolde T mitine odaklanacağız, çünkü bu mit biçimi, ilk yem inşası ve kullanılan medya dışında daha yaygın olarak uygulanabilir olduğundan, her iki mit biçimi de temelde aynı şekilde gerçekleştirilir. Yem, etiketleme ve ifade için uygun bir vektöre klonlanmalıdır.

Şu anda BV dört, p, a, BV dört ve PCM BV dört gibi çeşitli T efsane vektörleri mevcuttur, bu da çok güçlü bir TF bir güçlü A DH bir ve zayıf CYC bir promotörün kontrolü altında terminal olarak etiketlenmiş Bates, Beit Cub Lexie, VP 16'nın inşasına izin verir. Takım efektörü seçildikten sonra, kısıtlama uygun kısıtlama bölgesinde plazmidi sindirir. Bölünme yalnızca CU B Lxe VP 16 etiketinin hemen yakınında, C terminali etiketlemesi için etiketin yukarı akışında veya N terminal etiketlemesi için aşağı akışta gerçekleşmelidir.

Örneğin, PAM BV vektörünü kullanırken, SFI bir ideal seçimdir, plazmit sindirildikten sonra, kullanıma hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklandıktan sonra, bir sonraki adım, ilgilenilen genin amplifikasyonu ve klonlanması için primerler tasarlamaktır. İleri astarınızın beş ana ucu, kısıtlama bölgesinin yukarısındaki yaklaşık 35 ila 40 nükleotidle eşleşmelidir. Üç asal uç, beta iki ve jenerik reseptörü kodlayan bir DRB iki olan hedef genin ilk 18 ila 20 nükleotidi ile eşleşmelidir.

Örneğimizde, ters primerin beş asal ucu, kısıtlama bölgesinin akış aşağısındaki yaklaşık 35 ila 40 nükleotidin ters tamamlayıcısı ile eşleşmelidir. Hedef genin son 18 ila 20 nükleotidinin ters tamamlayıcısıyla eşleşen üç asal uçla, CUB Lex diyor ki VP 16 etiketi, gösterilen örnekte olduğu gibi C terminaline yerleştiriliyorsa, N veya C terminal etiketlemesinin gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğine bağlı olarak, ileri veya geri primerde kullanılan seçilen 35 ila 40 plazmit dizisi nükleotidinin, hedef genin bir VP 16 etiketi olan CU B Lex ile çerçeve içinde klonlanmasına neden olduğundan emin olun. Örneğimizde, A DRB iki proteininin C terminali etiketlenecektir.

Ters primerdeki A MBV dizisinin 35 temeli, A DRB iki ve CUB gen dizileri aynı okuma çerçevesi içinde yer alacak ve seçilen primerler kullanılarak PCR ile ilgilenilen geni amplifiye edecek şekilde seçilmiştir. PCR parametreleri, boşluk onarımı homolog rekombinasyonunun meydana gelebileceği bir ortam sağlamak için kullanılan belirli enzime ve spesifik primerlere bağlı olacaktır. Önceden sindirilmiş plazmit ve ilgilenilen amplifiye edilmiş gen, geets ve woods tarafından tarif edilene benzer standart bir maya dönüşüm protokolü kullanılarak uygun bir maya türüne dönüştürülür.

Dönüştürülmüş maya plaka üzerinde büyüdükten sonra, suşun tek bir kolonisini seçin ve beş mililitre SD eksi lösin ile aşılayın. Sıvı ortam, kültür gece boyunca büyüdükten ve doygunluğa ulaştıktan sonra gece boyunca 30 santigrat derecede büyür. Hücreleri beş dakikada 700 GS'de santrifüjleyin ve herhangi bir ticari mini hazırlık kiti kullanarak süpernatan izole yem plazma DNA'sını hücre peletinden çıkarın.

İlk reçine süspansiyonundan sonra pelete küçük bir hacimde 0.5 milimolar soda kireç cam boncuklarda yeterli maya hücresi lizizini sağlamak için standart protokolü bir modifikasyonla takip edin ve beş dakika boyunca kuvvetli bir şekilde girdap yapın. Ardından ticari protokole normal şekilde devam edin. İzole maya DNA'sını, mikrogram DNA başına en az bir kez 10 ila yedinci hücrelerin dönüşüm verimliliği ile plazmit yayılımı için uygun, kimyasal olarak yetkin bir e coli suşuna dönüştürün.

Dönüştürülmüş e coli'den plazma DNA'sını topladıktan sonra, yem proteinlerinin maya zarına uygun şekilde lokalize olduğundan emin olmak için yem suşlarının analiz edilmesi gerektiğini kullanmadan önce sıralama yaparak yem plazmidinin uygun yapısını doğrulayın. Lokalizasyon, floresan mikroskobu kullanılarak belirlenir. Yem etiketi dizisine bir YFP molekülünün dahil edilmesi, canlı hücrelerin doğrudan görselleştirilmesine izin verecektir ve imy'de yaygın olarak kullanılır.

Alternatif olarak, etiketin Lex A veya VP 16 bileşenlerine karşı antikor kullanan standart bir immünofloresan yaklaşımı, yemin uygun lokalizasyonu sağlandıktan sonra kullanılabilir. Yemin kendi kendine aktive olmadığından, yani muhabir sistemini tek başına aktive etmediğinden veya yemin kendi kendine aktive olmadığından emin olmak için etkileşimde bulunmayan övgü varlığında emin olmak gerekir, N-U-B-G-I testini kullanıyoruz. Bu testte.

Yem, etkileşen pozitif ve etkileşmeyen negatif kontrol övgüsü ile dönüştürülür ve daha sonra her dönüştürücünün farklı seyreltmeleri uygun seçici ortamda tespit edilir. Abate, mitte kullanıma uygun olması için pozitif kontrolün varlığında seçici medya üzerinde büyümeli ve negatif kontrolün varlığında büyümemelidir. Yem doğrulandıktan sonra, yemi içeren efsane muhabir suşu, protein protein etkileşimlerini taramak için ilgilenilen bir av kütüphanesi ile dönüştürülebilir.

Bu büyük ölçekli maya dönüşümüne başlamak için, yeminizi içeren efsane muhabir türünün tek bir kolonisini beş mililitre SD eksi lösin ortamına aşılayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak kuluçkaya yatırın. Gece boyunca kültürü 200 mililitre SD eksi lösin ortamına seyreltin ve 0.6 ila 0.7 OD 600'e ulaşana kadar çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Hedef OD 600'e ulaşıldığında, 200 mililitrelik kültürü dört adet 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpü arasına bölün ve hücreleri santrifüjleme yoluyla hasat edin.

Peletleri steril çift damıtılmış su ve lityum asetat trissy DTA çözeltisi ile yıkadıktan sonra, her peleti dört adet 15 mililitrelik vidalı santrifüj tüpünün her birine 600 mikrolitre lityum asetat trissy DTA çözeltisi içinde süspanse ediyoruz. 2.5 mililitre PEG lityum asetat çözeltisi, iki 600 mikrolitre yeniden süspanse hücre, 100 mikrolitre somon spermi DNA çözeltisi ve yedi mikrogram av kütüphanesi DNA'sı dört ekleyin. İyice karıştırmayı sağlamak için tüpleri bir dakika boyunca metin haline getirin ve ardından 30 santigrat derece su banyosunda 45 dakika inkübe edin.

45 dakikalık inkübasyondan sonra her 15 dakikada bir kısaca karıştırın. Her tüpe 160 mikrolitre dimetil sülfoksit veya DMSO ekleyin ve tüpleri ters çevirerek hemen karıştırın. 42 derece santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.

Isı şoku tamamlandığında, hücreleri santrifüjleme ve resüs ile toplayın. Peletlerin her birini üç mililitre iki X-Y-P-A-D içinde süspanse edin. Tüm numuneleri tek bir 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpünde bir araya getirin.

Hücre iyileşmesi için hücreleri 30 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüjleyin ve 100 mikrolitre yeniden süspanse hücre kullanarak hücre peletini 4.9 mililitre steril% 0.9 sodyum klorür içinde yeniden süspanse edin. 10 x ila 10.000 x plaka, 100 mikrolitre 100 x ve 1000 x seyreltme arasında değişen steril% 0.9 sodyum klorürde seçici ortam üzerine on kat seri seyreltme hazırlayın ve iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Bu plakalar bir kontrol görevi görür ve dönüşümün verimliliğini eşit olarak hesaplamak için kullanılır. Kalan 4.8 mililitre yeniden askıya alınmış hücreleri ve plakayı büyük 150 milimetrelik plakalara bölün ve üç ila dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Koloniler büyüdükten sonra, resus her biri potansiyel bir etkileşimli yem içeren hücreleri temsil eden tek kolonileri askıya alır, 100 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür içinde av çifti ve beş mikrolitrelik alikotları XG içeren seçici ortama plaka, sadece iki ila dört gün büyümesine izin verir.

Daha fazla analiz için sağlam büyüme ve mavi renk gösteren koloniler seçilir. Pozitif maya kolonilerinden plazmitleri izole ettikten ve sıraladıktan sonra, ön etkileşimci listenizi bir araya getirmek için tüm sıralama verilerini derleyin ve analiz edin. Bu etkileşimleri yeniden kontrol etmek için yem bağımlılık testi kullanılır.

Bu testte, tanımlanan interaktörleri ifade eden tüm av plazmaları, orijinal yem suşuna ve ayrıca CUB Lex'e kaynaşmış tek bir transmembran alanından oluşan bir kontrol yapay yemini barındıran suşa geri dönüştürülür, bir VP 16 etiketi, 100 mikrolitre steril çift damıtılmış su içinde bu dönüşümlerden tek kolonileri yeniden süspanse eder ve uygun seçici ortam artı X sc altında beş mikrolitrelik hacimleri tespit eder. İdeal olarak, Her av için birden fazla dönüştürücü seçilmeli ve hem orijinal yem hem de yapay yem aynı plaka üzerinde tespit edilmelidir. Plakaları 30 santigrat derecede iki ila dört gün boyunca kuluçkaya yatırın, yapay yemi avda taşıyan ve raportör sisteminin aktivasyonuna neden olan maya, rastgele olarak kabul edilir ve bu belirli av, etkileşimciler listesinden çıkarılır.

Mayada büyümeye ve mavi renklenmeye neden olan övgü, ilgilenilen yemle değil, yapay yemle değil. Belirli bir etkileşimi onaylayın. Bununla birlikte, avı barındıran maya ve ilgilendiğiniz yem büyümez.

Bu av, etkileşimciler listesinden kaldırılır. Kalan övgü, mit ekranında tanımlanan interaktörlerin tam listesini oluşturur. Efsane prosedürünün tamamlanmasının ardından, bir etkileşim ana haritasına sahip olacaksınız.

Bu, araştırmacının duruma göre belirlenen belirli çalışmaları kullanarak daha fazla analiz etmesi gereken bir aday etkileşimleri koleksiyonunu temsil eder. Her birinin biyolojik önemini değerlendirmek için, İlgilenilen bir proteinin etkileşen ortaklarını belirlemek için zar E iki hibrit veya efsane prosedürünü nasıl uygulayacağınızı az önce gösterdik. Efsane prosedürünü gerçekleştirirken, ilgilendiğiniz kişinin hücresinin cito'sunda bulunan sonunun ve/veya C terminalinin olduğunu doğrulamak ve etiketleme stratejinizi buna göre tasarlamak önemlidir.

Ek olarak, yem türünüzün yemi düzgün bir şekilde ifade edip etmediğini ve yemin doğru şekilde lokalize olduğunu dikkatlice değerlendirmek önemlidir. Ek olarak, NUB GI Kontrol testini yapmak önemlidir, çünkü bu, tarama koşullarının oluşturulmasına yardımcı olmak için yararlıdır. Son olarak, efsane kullanarak tespit ettiğiniz tüm etkileşimleri bağımsız olarak doğruladığınızdan emin olun.

Bu basit adımları takip etmek, efsane prosedüründen mümkün olan en iyi sonuçları almanızı sağlamalıdır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.