Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Sistem, ubikitinin uç terminal NUBI ve C terminal CUB yarılarına stabil olarak ayrılıp daha sonra tam uzunlukta bir pseudo-ubikitin molekülüne yeniden birleşebilme yeteneğini ifade eden bölünmüş ubikitin kavramına dayanmaktadır. Bu yeniden birleşme, vahşi tip NUBI kullanıldığında kendiliğinden gerçekleşirken; izoleusin 13'ten glisin mutasyonunun uygulanmasıyla oluşturulan NUBG adlı fragman, CUB ile olan afinitesini büyük ölçüde azaltarak pseudo-ubikitin oluşumunu engeller. Eğer NUBG ve CUB sırasıyla protein A ve protein B'ye füzyon edilirse ve A ile B etkileşime girebiliyorsa, pseudo-ubikitin molekülü yeniden oluşturulabilir.

Bu yöntemde, integral membran yemleri, yapay bir transkripsiyon faktörüne bağlı CUB fragmanından oluşan bir yapıya füzyon edilir. Avlar ise NUBG fragmanına füzyon edilir; yem ile av arasındaki bir etkileşim, psödo ubikitinin yeniden oluşumuna yol açar ve bu yapı, makaslarla simgelenen sitozolik de-ubikitinasyon enzimleri tarafından tanınabilir. Bu enzimler, CUB'ın C-terminüsünden sonra kesim yaparak transkripsiyon faktörünü serbest bırakır; böylece faktör çekirdeğe girerek raporlayıcı sistemi aktive edebilir ve bu da yem-av etkileşimlerinin gerçekleştiği hücrelerin seçici izolasyonuna ve tanımlanmasına olanak tanır.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Moleküler Genetik ve Biyokimya bölümlerindeki Igor STAARs Lab'dan Janie Snyder. Bugün size membran kullanımı iki hibrit veya MINT prosedürünü göstereceğim; laboratuvarımızda integral membran proteinlerinin etkileşimlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Myt analizi gerçekleştirmeden önce, yem proteininizin N ve/veya C terminusünün hücrenin sitozolünde olduğunu doğrulayın. CUB Lex A VP 16 etiketi, proteininizin böyle bir terminusüne füzyonlanmış olmalıdır. Transkripsiyon faktörünün salınımı için gerekli olan deubikitinasyon enzimleri sitozolde yer aldığı için, yem proteininizin topolojisi bilinmiyorsa, hem N hem de C terminusünde etiketlenmiş konstrüktlar oluşturabilir ve kısa süre sonra açıklanacak olan N-U-B-G-I kontrol testini kullanarak bunlardan herhangi birinin Myt kullanımı için uygun olup olmadığını belirleyebilir, böylece belirli bir terminusün sitozolik olduğunu saptayabilirsiniz.

Ardından, myth yönteminin iki ana varyantından hangisinin deneyiniz için uygun olduğuna karar verin. Yerli maya proteinleri için entegre myth veya immy tercih edilen yöntemdir. Imy yönteminde, Bates'ler endojen olarak CUB Lex a VP 16 etiketiyle işaretlenir ve böylece doğal promoterlerinin kontrolü altında bırakılırlar.

Bates'in vahşi tip ekspresyon seviyesi, yerli olmayan maya proteinleri için artan yanlış pozitif sayısı gibi protein aşırı ekspresyonuyla ilişkili sorunları gidermeye yardımcı olduğundan avantajlıdır; CU B Lex A V VP 16 etiketli yemlerin bir plazmitten topikal olarak aşırı eksprese edildiği geleneksel myth veya T myth kullanılabilir. Bu protokolde, myth'in bu formu daha yaygın olarak uygulanabildiği için T myth'e odaklanacağız; başlangıç yem konstrüksiyonu ve kullanılan besiyeri hariç, myth'in her iki formu da esasen özdeş bir şekilde yürütülür. Yem, etiketleme ve ekspresyon için uygun bir vektöre klonlanmalıdır.

Şu anda BV4, pABV4 ve PCM BV4 gibi çeşitli T myth vektörleri mevcuttur; bunlar sırasıyla çok güçlü TF1, güçlü ADH1 ve zayıf CYC1 promotörlerinin kontrolü altında C-terminali etiketli Bait-Cub Lexie, VP16 konstrüksiyonuna olanak tanır. Team efektörü seçildikten sonra, plazmit uygun restriksiyon bölgesinden restriksiyon enzimi ile sindirilir. Kesim, C-terminal etiketleme için etiketin hemen yukarısında (upstream) veya N-terminal etiketleme için etiketin hemen aşağısında (downstream), yalnızca CUB Lxe VP16 etiketin yakın çevresinde gerçekleşmelidir.

Örneğin, PAM BV vektörü kullanıldığında SFI I ideal bir seçimdir; plazmit digere edilip kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklandıktan sonraki adım, ilgi duyulan genin amplifikasyonu ve klonlanması için primerlerin tasarlanmasıdır. Forward primerinizin 5' ucunun, kısıtlama bölgesinin 35 ila 40 nükleotid yukarısıyla yaklaşık olarak eşleşmesi gerekir. 3' ucunun ise, beta iki ve jenerik reseptörü kodlayan bir DRB 2 olan hedef genin ilk 18 ila 20 nükleotidiyle eşleşmesi gerekmektedir.

Örneğimizde, ters primerin beş prime ucu, restriksiyon bölgesinin aşağısındaki yaklaşık 35 ila 40 nükleotidin ters tamamlayıcısıyla eşleşmelidir. Üç prime ucun, hedef genin son 18 ila 20 nükleotidinin ters tamamlayıcısıyla eşleşmesi gerekir; gösterilen örnekte olduğu gibi C-terminusuna CUB Lex, VP 16 etiketi yerleştiriliyorsa stop kodu dışarıda bırakılmalıdır. N veya C-terminal etiketlemesinin hangisinin yapıldığına bağlı olarak, ileri veya ters primerde kullanılan plazmit dizisinin seçilen 35 ila 40 nükleotidinin, hedef genin CUB Lex, a VP 16 etiketiyle aynı çerçevede (in frame) klonlanmasını sağladığından emin olun. Örneğimizde A DRB iki proteininin C-terminusu etiketlenecektir.

Ters primerdeki A MBV dizisinin 35 bazı, A DRB iki ve CUB gen dizilerinin aynı okuma çerçevesinde yer alacak şekilde seçilmiştir; seçilen primerleri kullanarak PCR ile ilgilenilen geni çoğaltın. PCR parametreleri, boşluk onarım homolog rekombinasyonunun gerçekleşebileceği bir ortam sağlamak için kullanılan özel enzime ve spesifik primerlere bağlı olacaktır. Daha önce sindirilmiş plazmit ve çoğaltılan ilgili gen, Geets ve Woods tarafından tanımlanan standart bir maya transformasyon protokolü kullanılarak uygun bir maya suşuna transforme edilir.

Transforme edilmiş maya plakta büyüdükten sonra, suşun tek bir kolonisini seçin ve 5 mL lösin içermeyen SD besiyerine inoküle edin. Sıvı besiyerini 30 °C'de gece boyunca inkübe edin; kültür gece boyunca büyüyüp doygunluğa ulaştıktan sonra hücreleri 5 dakika boyunca 700 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ticari bir mini prep kiti kullanarak hücre peletinden yem plazmid DNA'sını izole edin.

İlk resüspansiyon işleminin ardından pelete 0,5 milimolar soda lime cam boncuklar ekleyerek küçük bir hacimde yeterli maya hücresi lizisini sağlamak amacıyla standart protokolü bir modifikasyonla uygulayın ve beş dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından ticari protokole normal şekilde devam edin. İzole edilen maya DNA'sını, plazmit propagasyonu için uygun, mikrogram DNA başına en az 1×10⁷ hücre dönüşüm verimliliğine sahip kimyasal olarak kompetan bir e coli suşuna transforme edin.

Transforme edilmiş e coli'den plazmid DNA'sı izole edildikten sonra, kullanmadan önce sekanslama yoluyla yem plazmidinin doğru şekilde oluşturulduğunu doğrulayın; yem proteinlerinin maya membranına doğru şekilde yerleştiğinden emin olmak için yem suşları analiz edilmelidir. Yerleşim, floresan mikroskobu kullanılarak belirlenir. Yem etiket dizisine bir YFP molekülünün dahil edilmesi, canlı hücrelerin doğrudan görüntülenmesine olanak tanır ve imy'de yaygın olarak kullanılır.

Alternatif olarak, yemin uygun lokalizasyonu belirlendikten sonra, etiketin Lex A veya VP 16 bileşenlerine karşı antikor kullanan standart bir immünofloresan yaklaşımı uygulanabilir. Yemin kendi kendine aktive olmadığını, yani raporlayıcı sistemi tek başına veya etkileşime girmeyen bir av proteinin varlığında aktive etmediğinden emin olmak gerekir; yemin kendi kendine aktive olmadığını doğrulamak için N-U-B-G-I testini uyguluyoruz. Bu testte.

Yem, etkileşen pozitif ve etkileşmeyen negatif kontrol avları ile transforme edilir ve ardından her bir transformanın farklı dilüsyonları uygun seçici besiyerlerine damlatılır. Yemin, maya iki hibrid sisteminde kullanıma uygun olması için pozitif kontrol varlığında seçici besiyerinde büyümesi ve negatif kontrol varlığında büyümemesi gerekir. Yem valide edildikten sonra, yemi içeren maya raporlayıcı suşu, protein-protein etkileşimlerini taramak için ilgili bir av kütüphanesi ile transforme edilebilir.

Bu büyük ölçekli maya transformasyonuna başlamak için, yeminizle birlikte myth reporter suşunun tek bir kolonisini beş mililitre lösin içermeyen SD besiyerine inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Gece boyu büyütülen kültürü 200 mililitre lösin içermeyen SD besiyerine seyreltin ve OD 600 değeri 0,6 ila 0,7'ye ulaşana kadar 30 °C'de çalkalamalı inkübatörde inkübe edin. Hedef OD 600 değerine ulaşıldığında, 200 mililitrelik kültürü dört adet 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpüne paylaştırın ve hücreleri santrifügasyon yoluyla hasat edin.

Pelletleri steril çift distile su ve lityum asetat trissy DTA çözeltisi ile yıkadıktan sonra, her bir pelleti 600 µL lityum asetat trissy DTA çözeltisi içinde, dört adet 15 mL'lik vidalı santrifüj tüpünün her birine süspanse ederiz. Yeniden süspanse edilmiş 600 µL hücreye 2,5 mL PEG lityum asetat çözeltisi, 100 µL somon spermi DNA çözeltisi ve yedi µg av kütüphanesi DNA'sı ekleyin. Tam karışımı sağlamak için tüpleri bir dakika boyunca vorteksleyin ve ardından 30 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca inkübe edin.

45 dakikalık inkübasyondan sonra her 15 dakikada bir kısaca karıştırın. Her tüpe 160 µL dimetil sülfoksit veya DMSO ekleyin ve tüpleri ters çevirerek hemen karıştırın. 42 °C'lik bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin.

Isı şoku tamamlandığında, hücreleri santrifüjasyonla toplayın ve yeniden süspande edin. Her bir peleti üç mililitre 2X-Y-P-A-D içinde süspande edin. Tüm örnekleri tek bir 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpünde birleştirin.

Hücrelerin toparlanması için hücreleri 30 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini, 100 µL resüspande edilmiş hücre kullanarak 4,9 mL steril %0,9 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Steril %0,9 sodyum klorür ile 10x'ten 10.000x'e kadar on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın; 100x ve 1000x dilüsyonlardan 100 µL'yi selektif besiyerine ekleyin ve 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.

Bu plakalar kontrol görevi görür ve transformasyon verimliliğinin aynı şekilde hesaplanması için kullanılır. Resüspande edilmiş hücrelerin geri kalan 4,8 mililitresini bölerek büyük 150 milimetrelik plakalara ekleyin ve 30 °C'de üç ila dört gün inkübe edin. Koloniler büyüdüğünde, her biri potansiyel etkileşimli bait-prey çifti içeren hücreleri temsil eden tekil kolonileri 100 µL %0,9 sodyum klorür içinde tekrar süspanse edin ve 5 µL'lik alikotları XG içeren seçici ortama ekleyerek sadece iki ila dört gün boyunca büyümeye bırakın.

Güçlü büyüme sergileyen ve mavi renkli olan koloniler ileri analizler için seçilir. Pozitif maya kolonilerinden plazmitler izole edilip dizilendikten sonra, ön etkileşim listesini oluşturmak için tüm dizileme verileri derlenir ve analiz edilir. Bu etkileşimleri yeniden kontrol etmek için yem bağımlılığı testi uygulanır.

Bu testte, tanımlanan etkileşimcileri eksprese eden tüm av plazmidleri, hem orijinal yem suşuna hem de tek bir transmembran domaininin CUB Lex ve bir VP 16 etiketine füzyon edildiği kontrol yapay yemini taşıyan suşa geri transforme edilir; bu transformasyonlardan elde edilen tek koloniler 100 µL steril çift distile su içerisinde yeniden süspanse edilir ve uygun seçici besiyeri + X sc üzerine beş µL'lik hacimler halinde damlatılır. İdeal olarak, her bir av için birden fazla transformant seçilmeli ve hem orijinal yem hem de yapay yem aynı plak üzerine damlatılmalıdır. Plakalar 30 °C'de iki ila dört gün boyunca inkübe edilir; yapay yem taşıyan ve reporter sisteminin aktivasyonuna neden olan mayalar promiskuös kabul edilir ve bu spesifik av, etkileşimci listesinden çıkarılır.

İlgilenilen yem ile avın bulunduğu mayada büyüme ve mavi renklenme gözlemlenmeli, ancak yapay yem ile gözlemlenmemelidir. Bu durum, spesifik bir etkileşimi doğrular. Bununla birlikte, avı ve ilgilenilen yemi taşıyan mayalar büyümezse.

Bu av, etkileşimci listesinden çıkarılır. Geriye kalan avlar, maya taramasında tanımlanan etkileşimcilerin tam listesini oluşturur. Maya prosedürü tamamlandığında, bir etkileşim haritanız olacaktır.

Bu, araştırmacının vaka bazlı olarak belirlenen spesifik çalışmalarla daha detaylı analiz etmesi gereken aday etkileşimler koleksiyonunu temsil eder. Her birinin biyolojik anlamlılığını değerlendirmek için, ilgilenilen bir proteinin etkileşim ortaklarını belirlemek amacıyla membran E2 hibrit veya MYTH prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini az önce gösterdik. MYTH prosedürünü uygularken, ilgilenilen proteinin N ve/veya C terminusünün hücreninle sitoplazmasında yer aldığını doğrulamak ve etiketleme stratejinizi buna göre tasarlamak önemlidir.

Ek olarak, yem suşlarınızın yemi uygun şekilde eksprese ettiğini ve yemin doğru şekilde lokalize olduğunu dikkatle değerlendirmek önemlidir. Ayrıca, tarama koşullarının belirlenmesine yardımcı olduğu için NUB GI Kontrol testinin yapılması önemlidir. Son olarak, myth kullanarak tespit ettiğiniz tüm etkileşimleri bağımsız olarak doğruladığınızdan emin olun.

Bu basit adımları takip etmek, mit prosedüründen mümkün olan en iyi sonuçları almanızı sağlayacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.