Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Myth sistemi, ubikitinin uç terminal NUBI ve C terminal CUB yarılarına kararlı bir şekilde ayrılabilme ve bu yarıların yeniden birleşerek tam uzunlukta bir psödoubikit molekülü oluşturabilme yeteneğine dayanan ayrık ubikitin kavramına dayanmaktadır. Vahşi tip NUBI kullanıldığında bu yeniden birleşme kendiliğinden gerçekleşirken, izolösin 13'ten glisine mutasyonun eklenmesiyle üretilen NUBG adlı fragman, CUB'e olan afinitesini büyük ölçüde azaltarak psödoubikit oluşumunu engeller. Eğer NUBG ve CUB sırasıyla protein A ve protein B'ye füze edilirse ve A ile B etkileşime girebilirse, psödoubikit molekülü yeniden oluşabilir.

Mitolojide, integral membran yemleri, yapay bir transkripsiyon faktörüne bağlı CUB fragmanından oluşan bir yapıya füzyon edilir. Avlar ise NUBG fragmanına füzyon edilirken, yem ve av arasındaki bir etkileşim psödo übikvitinin yeniden oluşmasına yol açar; bu durum ise makasla örneklendirilen sitozolik deübikvitinasyon enzimlerinin tanıma kapasitesini tetikler. Bu enzimler CUB'un C terminalinden sonra kesme işlemi yaparak transkripsiyon faktörünü serbest bırakır; serbest kalan faktör çekirdeğe girerek raporlayıcı sistemi aktive eder ve böylece yem-av etkileşimlerinin meydana geldiği hücrelerin seçici olarak izole edilmesini ve tanımlanmasını sağlar.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Moleküler Genetik ve Biyokimya bölümlerindeki Igor STAARs Laboratuvarı'ndan Janie Snyder. Bugün size membran kullanmalı iki hibrit veya M2H prosedürünü göstereceğim; laboratuvarımızda bu prosedürü integral membran proteinlerinin etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Meme analizine başlamadan önce, yem proteininizin N ve/veya C terminusünün hücrenin sitozolünde olduğunu doğrulayın. CUB Lex A VP 16 etiketi, proteininize böyle bir terminus üzerinden füzyonlanmış olmalıdır. Transkripsiyon faktörünün salınımı için gerekli olan deubikitinasyon enzimlerinin sitozolde yer alması nedeniyle, yem proteininizin topolojisi bilinmiyorsa, hem N hem de C terminusi etiketlenmiş konstrüktlar oluşturabilir ve birazdan açıklanacak olan N-U-B-G-I kontrol testini kullanarak bunlardan herhangi birinin meme için uygun olup olmadığını, böylece belirli bir terminusün sitozolik olduğunu belirleyebilirsiniz.

Ardından, myth'in iki ana varyantından hangisinin deneyiniz için uygun olduğuna karar verin. Yerli maya proteinleri için entegre myth veya immy tercih edilen yöntemdir. Immy yönteminde, Bates'ler endojen olarak CUB Lex a VP 16 etiketi ile işaretlenir ve böylece kendi doğal promotörlerinin kontrolü altında bırakılırlar.

Wild tip Bates ekspresyon seviyesi, yerli olmayan maya proteinleri için artan yanlış pozitif sayıları gibi protein aşırı ekspresyonu ile ilişkili sorunların giderilmesine yardımcı olduğu için avantajlıdır; CU B Lex A V VP 16 etiketli yeminlerin bir plazmitten topikal olarak aşırı eksprese edildiği geleneksel myth veya T myth kullanılabilir. Bu protokolde T myth'e odaklanacağız çünkü myth'in bu formu daha yaygın olarak uygulanabilirdir; başlangıç yem konstrüksiyonu ve kullanılan besiyeri hariç, myth'in her iki formu da esasen özdeş bir şekilde yürütülür. Yem, etiketleme ve ekspresyon için uygun bir vektöre klonlanmalıdır.

Günümüzde, sırasıyla çok güçlü bir TF1, güçlü bir ADH1 ve zayıf bir CYC1 promotörünün kontrolü altında C-terminali etiketli Bait-Cub LexA-VP16 yapıların oluşturulmasına olanak tanıyan BV4, pA-BV4 ve PCM-BV4 gibi çeşitli T myth vektörleri mevcuttur. Ektektör seçildikten sonra, plazmid uygun restriksiyon bölgesinden restriksiyon enzimleriyle sindirilir. Kesim işlemi, C-terminal etiketleme için etiketin hemen yukarısında veya N-terminal etiketleme için etiketin hemen aşağısında, Cub LexA-VP16 etiketinin yakın çevresinde gerçekleşmelidir.

Örneğin, PAM BV vektörü kullanıldığında, SFI one ideal bir seçimdir; plazmid sindirildikten sonra kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklanır, bir sonraki adım ise ilgilenilen genin amplifikasyonu ve klonlanması için primerlerin tasarlanmasıdır. Forward primerinizin 5' ucunun, restriksiyon bölgesinin yaklaşık 35 ila 40 nükleotid yukarısıyla eşleşmesi gerekir. 3' ucu ise, beta iki ve jenerik reseptörü kodlayan bir DRB two olan hedef genin ilk 18 ila 20 nükleotidiyle eşleşmelidir.

Örneğimizde, ters primerin beş prime (5') ucu, restriksiyon bölgesinin aşağısındaki yaklaşık 35 ila 40 nükleotide karşılık gelen ters tamamlayıcı ile eşleşmelidir. Üç prime (3') ucunun, eğer gösterilen örnekte olduğu gibi C-terminusuna CUB Lex say VP 16 etiketi yerleştiriliyorsa, hedef genin stop kodonu hariç tutularak son 18 ila 20 nükleotidinin ters tamamlayıcısı ile eşleşmesi gerekir; N veya C terminal etiketlemesinin hangisinin yapıldığına bağlı olarak, ileri veya ters primerde kullanılan plazmit dizisindeki seçilen 35 ila 40 nükleotidin, hedef genin CU B Lex, a VP 16 etiketi ile aynı okuma çerçevesinde (in frame) klonlanmasını sağladığından emin olun. Örneğimizde A DRB iki proteininin C-terminusu etiketlenecektir.

Ters primerdeki A MBV dizisinin 35 bazı, A DRB iki ve CUB gen dizilerinin aynı okuma çerçevesinde yer alacağı şekilde seçilmiştir; seçilen primerleri kullanarak PCR ile ilgilenilen geni çoğaltın. PCR parametreleri, boşluk onarımı homolog rekombinasyonunun gerçekleşebileceği bir ortam sağlamak için kullanılan özel enzime ve spesifik primerlere bağlı olacaktır. Daha önce sindirilmiş plazmid ve çoğaltılan ilgilenilen gen, Geets ve Woods tarafından tanımlanan standart bir maya transformasyon protokolü kullanılarak uygun bir maya suşuna transforme edilir.

Transforme edilmiş maya plakada büyüdüğünde, suşun tek bir kolonisini seçin ve beş mililitre lösin içermeyen SD ortamına inoküle edin. Sıvı besiyerlerini 30 °C'de gece boyunca inkübe edin; kültür gece boyunca büyüyüp doygunluğa ulaştıktan sonra, hücreleri 700 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın; herhangi bir ticari mini prep kiti kullanarak hücre peletinden yem plazmit DNA'sını izole edin.

Başlangıç resüspansiyonundan sonra peletle beraber 0.5 millimolar soda kireç cam boncukların küçük bir hacimde yeterli maya hücresi lizisini sağlamak amacıyla, standart protokole bir modifikasyon ekleyerek uygulayın ve beş dakika boyunca şiddetli şekilde vorteksleyin. Ardından ticari protokole normal şekilde devam edin. İzole edilen maya DNA'sını, plazmit propagasyonu için uygun, mikrogram DNA başına en az 1 × 10⁷ hücre transformasyon verimliliğine sahip kimyasal olarak kompetan bir e coli suşuna transforme edin.

Transforme edilmiş e coli'den plazmit DNA'sı izole edildikten sonra, kullanmadan önce dizileme yaparak yem plazmitinin doğru şekilde oluşturulduğunu doğrulayın. Yem proteinlerinin maya membranına doğru şekilde yerleştiğinden emin olmak için yem suşları analiz edilmelidir. Yerleşim, floresan mikroskobu kullanılarak belirlenir. Yem etiket dizisine bir YFP molekülünün eklenmesi, canlı hücrelerin doğrudan görüntülenmesine olanak tanır ve imy'de yaygın olarak kullanılır.

Alternatif olarak, yemin uygun lokalizasyonu belirlendikten sonra, etiketin Lex A veya VP 16 bileşenlerine karşı antikor kullanan standart bir immünofloresans yaklaşımı uygulanabilir. Yemin kendi kendini aktive etmediğinden, yani raporlayıcı sistemi tek başına veya etkileşime girmeyen av proteininin varlığında aktive etmediğinden emin olmak gerekir; yemin kendi kendini aktive etmediğini doğrulamak için N-U-B-G-I testini kullanıyoruz. Bu testte.

Yem, etkileşime giren pozitif ve etkileşime girmeyen negatif kontrol avları ile transforme edilir ve ardından her bir transformanın farklı dilüsyonları uygun selektif besiyerlerine damlatılır. Yemin, Y2H'de kullanıma uygun olabilmesi için pozitif kontrol varlığında selektif besiyerinde büyümesi ve negatif kontrol varlığında büyümemesi gerekir. Yem valide edildikten sonra, yemi içeren Y2H raporlayıcı suşu, protein-protein etkileşimlerini taramak amacıyla ilgili bir av kütüphanesi ile transforme edilebilir.

Bu büyük ölçekli maya transformasyonuna başlamak için, yem proteinini içeren myth reporter suşunun tek bir kolonisini beş mililitre lösin içermeyen SD ortamına inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Gece boyu büyütülen kültürü 200 mililitre lösin içermeyen SD ortamına seyreltin ve OD 600 değeri 0,6 ile 0,7 arasına ulaşana kadar 30 °C'de çalkalamalı olarak inkübe edin. Hedef OD 600 değerine ulaşıldığında, 200 mililitrelik kültürü dört adet 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpüne paylaştırın ve hücreleri santrifüjleme yoluyla hasat edin.

Pelletleri steril çift distile su ve lityum asetat trissy DTA çözeltisi ile yıkadıktan sonra, her bir pelleti dört adet 15 mililitrelik vidalı santrifüj tüpünün her birinde 600 mikrolitre lityum asetat trissy DTA çözeltisi içerisinde süspanse ederiz. Yeniden süspanse edilen 600 mikrolitre hücreye 2,5 mililitre PEG lityum asetat çözeltisi, 100 mikrolitre somon spermi DNA çözeltisi ve yedi mikrogram prey kütüphanesi DNA'sı ekleyin. Tam karışmayı sağlamak için tüpleri bir dakika boyunca vorteksleyin ve ardından 30 derece Celsius sıcaklıktaki su banyosunda 45 dakika inkübe edin.

45 dakikalık inkübasyondan sonra her 15 dakikada bir kısa süreliğine karıştırın. Her tüpe 160 µL dimetil sülfoksit veya DMSO ekleyin ve tüpleri tersyüz ederek hemen karıştırın. 42 °C'lik su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin.

Isı şoku tamamlandığında, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve yeniden süspanse edin. Peletlerin her birini üç mililitre 2X YPAD içerisinde süspanse edin. Tüm örnekleri tek bir 50 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüpünde birleştirin.

Hücrelerin toparlanması için hücreleri 30 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini, resüspande edilmiş hücrelerin 100 µL'sini kullanarak 4,9 mL steril %0,9 sodyum klorür içerisinde yeniden süspande edin. Steril %0,9 sodyum klorür ile 10x'ten 10.000x'e kadar on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın; 100x ve 1000x dilüsyonların 100 µL'sini selektif besiyerine ekleyin ve 30 °C'de iki ila üç gün boyunca inkübe edin.

Bu plakalar kontrol görevi görür ve transformasyon verimliliğini eşit şekilde hesaplamak için kullanılır. Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin geri kalan 4,8 mililitresini bölün, 150 milimetrelik büyük plakalara ekim yapın ve 30 °C'de üç ila dört gün inkübe edin. Koloniler büyüdüğünde, her biri potansiyel etkileşimli yem-av çifti içeren hücreleri temsil eden tekil kolonileri 100 µL %0,9 sodyum klorür içinde yeniden süspanse edin ve 5 µL'lik alikotları XG içeren seçici besiyerine ekerek sadece iki ila dört gün boyunca büyümeye bırakın.

Güçlü büyüme gösteren ve mavi renkli olan koloniler ileri analizler için seçilir. Pozitif maya kolonilerinden plazmitler izole edilip dizilendikten sonra, ön etkileşim listesini oluşturmak için tüm dizileme verileri derlenir ve analiz edilir. Bu etkileşimleri yeniden kontrol etmek için yem bağımlılık testi uygulanır.

Bu testte, tanımlanan etkileşimcileri eksprese eden tüm av plazmitleri, orijinal yem suşuna ve tek bir transmembran domainin CUB Lex ve bir VP 16 etiketiyle birleştirildiği kontrol yapay yem suşuna geri transforme edilir; bu transformasyonlardan elde edilen tek koloniler 100 µL steril çift distile su içerisinde yeniden süspande edilir ve uygun seçici besiyeri artı X sc üzerine 5 µL'lik hacimlerde damlatılır. İdeal olarak, her av için birden fazla transformant seçilmeli ve hem orijinal yem hem de yapay yem aynı plak üzerine damlatılmalıdır. Plakalar 30 °C'de iki ila dört gün inkübe edilir; yapay yem taşıyan ve raporlayıcı sistemin aktivasyonuna neden olan mayalar "promiscuous" (ayrım gözetmeksizin etkileşen) olarak kabul edilir ve ilgili spesifik av, etkileşimciler listesinden çıkarılır.

İlgilenilen yem ile avın bulunduğu mayalarda büyüme ve mavi renklenme görülürken, yapay yemle yapılan deneylerde bu durumun görülmemesi, spesifik bir etkileşimin gerçekleştiğini doğrular. Ancak, avı ve ilgilenilen yemi taşıyan mayalar büyüme göstermiyorsa.

Bu av, etkileşimciler listesinden çıkarılır. Geriye kalan avlar, mitoz taramasında tanımlanan etkileşimcilerin tam listesini oluşturur. Mitoz prosedürü tamamlandığında, bir etkileşim ana haritasına sahip olacaksınız.

Bu, araştırmacının vaka bazlı olarak belirlenen spesifik çalışmalar kullanarak daha ayrıyla analiz etmesi gereken aday etkileşimlerin bir koleksiyonunu temsil eder. Her birinin biyolojik önemini değerlendirmek için, ilgilenilen bir proteinin etkileşim ortaklarını belirlemek amacıyla membran E iki hibrit veya myth prosedürünün nasıl yürütüleceğini az önce gösterdik. Myth prosedürünü gerçekleştirirken, ilgilenilen proteininizin N ve/veya C terminusünün hücrenin sitozolünde yer aldığını doğrulamak ve etiketleme stratejinizi buna göre tasarlamak önemlidir.

Ek olarak, yem suşlarınızın yemi uygun şekilde eksprese ettiğini ve yemin doğru şekilde lokalize olduğunu dikkatle değerlendirmek önemlidir. Ayrıca, tarama koşullarının belirlenmesine yardımcı olduğu için NUB GI Kontrol testini gerçekleştirmek önemlidir. Son olarak, myth kullanarak tespit ettiğiniz tüm etkileşimleri bağımsız olarak doğruladığınızdan emin olun.

Bu basit adımları takip etmek, mit prosedüründen mümkün olan en iyi sonuçları almanızı sağlayacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.