Name: DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin, Agilent balık türü tanımlama sistemiyle DNA tabanlı balık türlerini belirleme yöntemini. PCR amplifikasyonu ve RFLP analizi kullanarak deniz ürünleri otantikliğini hızlı ve doğru şekilde test edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agilent Stratagene Ürünler Bölümü <ul><li> Harini Ravi </li><li> Natalia Novorodovskaya </li><li> Sağlam Basehore </li><li> Jeff Braman </li><li> Rachel Formosa </li><li> Ronda Allen </li><li> Rajesh Bagga </li><li> Derek Salonu </li><li> Sarah Jandle </li><li> Danielle Huffman </li></ul> Agilent Laboratuvarları <ul><li> Robert Kincaid </li><li> Mary McBride </li></ul> Agilent Avrupa <ul><li> Nigel Skinner </li><li> Jürgen Schneider </li><li> Stephen Mueller </li><li> Martin Kratzmeier </li></ul> Chipping BRI <ul><li> Steve Garrett </li></ul>

1: DNA Ekstraksiyon Balık Örnekleri hazırlayın <ol><li> Test edilecek her balık örnek için tek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 10 mg ve 1 g (çiğ ya da pişmiş) arasında ağırlığında balık dokusunun bir parçası koyun. Aşağıdaki resimde örnek büyüklüğüne göre bir çiğ balık örneği ağırlığını tahmin etmek için bir kılavuz olarak kullanın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Balık Örneklerinin Kitle Tahminleri Örneklem Büyüklüğü geçerli. </li><li> 65 Pre-sıcak Proteinaz K Sindirim Tampon ° C'de bir inkübatör veya su banyosunda 5 dakika. </li><li> Proteinaz K Proteinaz K Sindirim Tampon ve Proteinaz K örnek başına 20 ul 200 ul birleştirerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Not: Her kullanımdan önce Proteinaz K taze bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 220 balık örnek her 1.5 ml tüp Proteinaz K çözüm ul ekleyin. Tüpler 65 ° C'de bir inkübatör veya su banyosunda 10 dakika. </li><li> Pelet herhangi bir sindirilmemiş dokuların xg 14.000 3 5 dakika için bir mikrosantrifüj tüpler Spin. </li><li> 1.5 ml taze bir tüpe her süpernatant 150 ul aktarın. Sindirilmemiş, tüp ya da tüpün üst kısmında görülebilir herhangi bir yağlı madde alt herhangi bir malzeme transferi kaçının. Süpernatant Bu borular örnekleri hangi genomik DNA çıkartılacaktır. </li></ol> 2: Genomik DNA ayıklayın <ol><li> Steril bir konteyner (polipropilen tüp ya da cam şişe),% 90 sulfolane 320 ul ve Nükleik Asit Bağlama Buffer numune başına 170 ul birleştirerek sulfolane ve Nükleik Asit Cilt Tampon çalışan bir solüsyon hazırlanır. Bu karışımı bir sonraki 4 hafta içinde incelemek için planladığınız gibi birçok örnekleri işlemek için yeterli miktarda hazırlamak isteyebilirsiniz. Bu karışım, oda sıcaklığında 30 gün kadar saklanabilir . Depolama sırasında karışımı ışığa maruz bırakmaktan kaçının. </li><li> Her balık örnek sulfolane / Ciltleme Tampon karışımı (Yukarıda 1. adımda hazırlanan) 490 ul ekleyin. Vortex veya pipetlemeyin homojenize kadar art arda örnek. Bu karışımı Ayrıca her numunenin toplam hacmi 640 ul getirecektir. </li><li> Her numune, 2 ml priz tüp içinde oturan (sağlanan) ve spin fincan üstüne tüpün kapağı ek bileşenini bir DNA Cilt Spin Kupası aktarın. </li><li> Spin fincan matris üzerine DNA yüklemek için 1 dakika 14.000 xg'de için mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra 500 1x Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ul ekleyin ve tüp kap. </li><li> 1 dakika 14.000 xg'de mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra% 80 etanol 500 ul eklemek ve tüp kap. </li><li> 1 dakika 14.000 xg'de mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> 500 ul% 80 etanol ile toplam 3 yıkama için adım 7 ve 8 iki kez daha tekrarlayın. </li><li> % 80 etanol içinde üçüncü bir yıkamadan sonra, kaldırmak ve spin bardak korumak ve filtratlar atın . Priz tüpler spin bardak değiştirin ve kuru fiber matris 14.000 xg'de 2 dakika boyunca mikrosantrifüj döndürün. </li><li> 1.5-m1 toplama tüpleri spin bardak aktarın. 100 ul Elüsyon Tampon her spin fincan fincan içinde doğrudan fiber matris üzerine ekleyin. Toplama tüplerin kapakları spin bardak üzerine çekin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1 dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüj örnekleri Spin. </li><li> Saflaştırılmış DNA mikrosantrifüj tüp Elüsyon Tampon. Spin fincan atın ve tüpler kap. DNA, bir ay kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama için, DNA saklamak 20 ° C veya 80 ° C. </li><li> İsterseniz, bir spektrofotometre, DNA örneklerinin konsantrasyonu ölçmek. </li></ol> Genomik DNA ekstraksiyonu protokolü genellikle 5 ng / ul 500 ng / ml arasında değişen bir konsantrasyon ile örnek verir. PCR-RFLP protokolü DNA örnekleri ile 0.05 ng / ul ng / ml 2000 yılına kadar her yerde değişen kuyulardan çalışır. 3: PCR Reaksiyonlar ayarlayın <ol><li> DNA stoku 8 ul steril, DNaz-su 32 ul ile birleştirerek bir pozitif kontrol somon DNA 50 ng / ul seyreltme hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. Seyreltilmiş numune 4 ° C 'de ileride kullanmak üzere saklanabilir. </li><li> Sırasına göre aşağıdaki tabloda bileşenleri birleştirerek reaksiyonlar hazırlayın. Belirtilen miktarlar kadar ölçekleme tarafından aynı anda çalıştırmak olacaktır PCR reaksiyonları için tek bir reaktif karışımı hazırlayıntablosu. Test DNA örnekleri yanı sıra, pozitif bir kontrol reaksiyonu ve herhangi bir şablon kontrol reaksiyon içerir. Yinelenen PCR reaksiyonları her test DNA örneği için hazırlanması tavsiye edilir. Tüm reaksiyon artı bir reaksiyon hacim fazlalığı için yeterli reaktif karışımı hazırlayın. 5 test DNA örnekleri varsa test reaksiyonlarının çiftleri dahil Örneğin, 8 reaksiyon (5 test reaksiyonlarının, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü, ve 1 fazla) veya 13 reaksiyonlar için yeterli reaktif karışımı hazırlamak (10 yinelenen test reaksiyonlar, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü ve 1 fazla). PCR Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Volume 1 Reaksiyon </td><td> Cilt 5 Reaksiyonlar </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 9 ul </td><td> 45 ul </td></tr><tr><td> 2x PCR Master Mix </td><td> 12.5 ul </td><td> 62.5 ul </td></tr><tr><td> Primer Mix </td><td> 2.5 ul </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 24 ul </td><td> 120 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vorteks reaktif karışımı, daha sonra her bir ince duvarlı PCR reaksiyon tüpü 24 ul dağıtmak. </li><li> 1 ul sulandırılmış pozitif kontrol DNA pozitif kontrol reaksiyon tüpüne ekleyin. Test örneği tüplere, test DNA örneği 1 ul ekleyin. No-şablon kontrol reaksiyon için, DNA yerine 1 ul DNaz ücretsiz su ekleyin. Çapraz bulaşmayı önlemek için, her DNA örneği için taze bir pipetlemeyin ucu kullanın. Örnek ekledikten sonra, tüpün içeriğini hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme reaksiyon karışımı. </li><li> Tüpler kısaca karıştırılır ve santrifüjlenir reaksiyon tüpleri, vorteks tüpleri Cap. </li></ol> 4: PCR Protokolü çalıştırın <ol><li> Termal cycler reaksiyonlar yerleştirin ve aşağıda gösterilen PCR programı çalıştırın. PCR Bisiklete binme Protokolü <table border="1"><tbody><tr><td> Bölüm </td><td> Çevrimleri sayısı </td><td> Sıcaklık </td><td> Süre </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 95 ° C </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 95 ° C 50 ° C 72 ° C </td><td> 30 saniye 30 saniye 30 saniye </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 72 ° C </td><td> 7 dakika </td></tr></tbody></table></li></ol> 5: Enzimler Kısıtlama Digest PCR Ürünler <ol><li> Etiket 0.5 ml tüp ya da kısıtlama sindirmek reaksiyonlar için kullanılmak üzere 0.2 ml şerit tüpler. DdeI, HaeIII ve NlaIII: Her PCR reaksiyon üç farklı restriksiyon enzimleri ile sindirilir. Bu nedenle, her PCR reaksiyonu, PCR örnek adı ve restriksiyon enzimi adı ile üç ayrı tüpler etiketi. </li><li> Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek DdeI sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm DdeI sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. PCR işlemi tamamlandıktan sonra, PCR reaksiyonları, RFLP (RFLP) analizi için restriksiyon enzimleri ile tedavi edilir. DdeI Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x DdeI enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri DdeI için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek HaeIII sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm HaeIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. HaeIII Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x HaeIII enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri HaeIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Reaktif karışımı hazırlayın.Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek NlaIII sindirimler her bileşen katları kullanarak tüm NlaIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. NlaIII Sindirim Reaktif Karışımı <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> dH 2 O, steril </td><td> 1.5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII Tampon </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x NlaIII enzim </td><td> 0.5 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri NlaIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. </li><li> Her sindirim tepki için, etiketli tüpler için uygun PCR ürününün 2.5 ul ekleyin. Tüm test PCR reaksiyonlarının yanı sıra pozitif kontrol reaksiyon üç restriksiyon enzimleri ile sindirilir gerekir. </li><li> Vorteks sindirim reaksiyonları ve ardından kısa bir süre tüpler santrifüj. </li><li> 37 ° C'de 2 saat boyunca tüm sindirim reaksiyonları inkübe edin. Bu inkübasyon termal cycler yapılabilir. İsterseniz, reaksiyonlar 37 ° C gece bırakılabilir. </li><li> 65 ° C'de 15 dakika süreyle reaksiyonlar aktarın. Bu adım, termal cycler yapılabilir. </li><li> Her reaksiyon ve vorteks 60 mM EDTA (kit ile birlikte verilen) 1 ul ekleyin. </li></ol> 6: kısıtlama sindirmek desen analiz <ol><li> Jel boya karışımı hazırlayın, DNA çip çip emişli istasyonu yer ve DNA çip üzerine karışımı yük. </li><li> Pipetleyin 5 merdiven sembolü olan ve her birinin içine çip üzerinde 12 örnek kuyuların işaretlenmiş içine DNA marker ul. DNA göstergesi yeşil kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti içinde sağlanır . </li><li> Iyi bir merdiven sembolü ile işaretlenmiş içine DNA merdiveni pipetleyin 1 ul. DNA merdiveni, sarı-kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti sağlanmaktadır. </li><li> DNA örneklerinin her biri için, aşağıdaki şekilde yönergelere göre çip üzerinde 12 örnek kuyulardan biri haline her bir kısıtlama sindirimi reaksiyon pipetlemeyin 1 ul. Bu yaklaşımı kullanarak, kuyular 1-3, pozitif kontrol örneği için 3 sindirim reaksiyonlar için, kuyular 4-6 test örneği 2 3 sindirim reaksiyonlar için test örneği 1, 7-9 kuyuları için 3 sindirim reaksiyonlar için, ve test örneği, sindirim sırasında üretilen parçası uzunlukları belirlemek için Agilent 2100 Bioanalyzer üzerinde kısıtlama sindirimi reaksiyonlar 3.Analyze 3 sindirim reaksiyonlar için kuyular 10-12. Agilent DNA 1000 Kit Rehberi Bioanalyzer laboratuar yongaları çalıştırmak için tam talimatlar vardır. Kısa bir protokol rahatınız için aşağıda verilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Çip üzerinde Örnekleri Örgütü. Kullanılmayan kuyu içine az 4 DNA örnekleri, su pipetlemeyin 1 ul varsa. 4 DNA örnekleri daha fazla varsa, birden fazla çip çalıştırmanız gerekecektir. Her çip üzerinde pozitif kontrol örneği çalıştırmak için gerekli olduğunu unutmayın. </li><li> 2400 devirde 60 saniye IKA vorteks karıştırıcı ve vorteks adaptör çip yatay yerleştirin. </li><li> Agilent 2100 Bioanalyzer içine çip takın ve çip çalıştırmak başlatmak. Aracı kapsamında gelen ham sinyalleri görüntülenir. Vadede bittikten sonra, zirveleri tepe ayarları bulmak algoritma kullanarak tüm örnekler için tanımlanır. Algoritma, gerçek bir zirve algılamak için başarısız oldu düşünüyorsanız, algoritma pik tanımlamanıza olanak sağlar bir değer Yükseklik Eşik set düşürebilir . </li><li> Testi bağlamda gidin ve Chip Özet sekmesini seçin. Örnek Adı alanında, aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, çip üzerinde tüm 12 kuyu için bir örnek adı girin. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Chip Özet Tab Adı Entry örnek. </li></ol> 7: RFLP Maçlar kullanarak test örneği türlerin tanımlanması Agilent yazılımı uygulama RFLP Decoder sindirim reaksiyonlarda üretilen parçası uzunlukları dayalı test DNA örnekleri için balık türlerini tanımlamak için kullanılır. Pozitif Kontrol Kısıtlama Enzim Beklenen Ürün Boyutu (bp) DdeI 117 Tablo 7 Beklenen DNA Fragment Boyutları , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 talimatları burada sağlanan RFLP Maçlar varsayılan analiz ayarları kullanabilirsiniz. Yazılım işletim ve ekran yorumlama hakkında ayrıntılı bilgi için yazılım yardım sistemi bakın. <ol><li> RFLP Decoder programı başlatın. </li><li> Dosya&gt; Aç&gt; Dosya XAD tıklayın. Aç iletişim kutusu will açmak. </li><li> Restriksiyon sindirimi reaksiyonlar dahil DNA çip için XAD dosyayı seçin. Aç seçeneğini tıklatın. Çip üzerinde yüklenen örnekleri listeleyen bir iletişim kutusu açılacaktır. </li><li> Bir DNA örneği karşılık gelen üç sindirim reaksiyonlar seçin ve açılan Enzim sütununun altında menüleri kullanarak her bir örnek için uygun bir restriksiyon enzimi belirtin. Aşağıdaki şekilde, Enzim sütun, DNA Sample 1 doldurulacak olmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Her Sample Kısıtlama Enzim belirtme. </li><li> Düşük marker "% min pik yüksekliği etiketli alanında, varsayılan değeri% 10.0. Gerekirse, kaçırılan küçük doruklarına tanımlamak için bu değer indirdi ya da non-spesifik gürültü kaynaklanan doruklarına atmak için kaldırdı olabilir Elektroferogram. min pik yüksekliği değeri için herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra Yeniden Entegre tıklayın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Asgari tepe yüksekliği atama. </li><li> Kireç iletişim kutusunun altındaki tıklayın. Bioanalyzer vadede elde edilen parça uzunluk verileri yazılım alanları doldurmak. </li><li> Ekranın sol üst köşesindeki skor açılan listesinde, veri analizi için uygun bir algoritma seçin . Analiz edilen balık numunesi tek bir balık türü oluşuyorsa puanı açılan listesinde Zar (Nei Li) seçin. Karışım seçin örnekleri türlerinin bir karışımı oluşabilir. Ekranın alt kısmında tablo etiketli kombine skoru her üç sindirim reaksiyonlar sonuçlarına göre en iyi türlerin eşleşen listeler. Türün adının yanı sıra ortak adı (aşağıya bakın) tabloda yer almaktadır. Mükemmel maçları (1 puan ile) yeşil vurgulanır. Sarı vurgulanır eşleşir yakın olarak kabul edilir. Bu türler için FishBase web sayfası getirmek için bir tür adı üzerine çift tıklatın. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Türlerin tanımlanması Sindirim dayanarak. </li><li> Ekranın üst kısmında alt kesim ve maç tolerans alanları, en iyi türlerin maçın skorunu geliştirmek için varsayılan ayarları. Düşük kesme değeri alanında belirlenen uzunluğundan daha kısa olan herhangi bir parçaları atmak için kullanılır . Maç tolerans değeri bir parçası uzunluğu dikkate alınması gereken bir maç tahmin parçası ne kadar yakın olmalıdır belirler. </li><li> Bu aynı yonga üzerinde alındı, geri kalan DNA örnekleri için 4 ile 8 arasındaki adımları tekrarlayın. </li></ol> 8: Temsilcilik Sonuçları: 4 farklı balık türlerinin kısıtlama sindirimi örnekleri ile bir Bioanlyzer jel bir görüntü aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Pozitif DNA örneği için beklenen sonuçlar aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7. Kısıtlama sindirmek reaksiyon örnekleri Bioanalyzer jel görüntüsü. Her jel şeritli bu tepki olarak kullanılan restriksiyon enzimi ile etiketlenir. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları.

<ol><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li>
<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis%3A+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li>
<li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li>
<li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species%5BTitle%5D)+AND+%22FSA+Final+Report+Q01069%22%5BJournal%5D)">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Agilent Technologies tarafından istihdam edilmektedir.

Biz deniz ürünleri balık türlerinin belirlenmesi için DNA tabanlı, basit, hızlı ve doğru bir tarama yöntemi göstermektedir. Bu güçlü yöntem az bir iş günü içinde tekrarlanabilir ve kesin sonuçlar sağlar ve aerodinamik protokolleri ve basit kurulum nedeniyle ticari test tesislerinde uygulanabilir. Deneysel olarak elde edilen balık türleri profilleri genişletilebilir bir veritabanı ile RFLP Dekoder yazılımı kullanılarak analiz nesnel veri üretimi ile karakterizedir. Rutin uygulanması ile, bu test yöntemi, deniz ürünleri mislabeling önlemek ve hükümet düzenlemelerine uyum için uygun doğru kayıtlarının tutulması yardımcı potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer (çip hazırlama istasyonu ve IKA vorteks karıştırıcı ile birlikte)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer dizüstü bilgisayarı &amp;amp; Uzman Yazılımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2953CA</td><td>G2950CA - masaüstü bilgisayar &amp;amp; Uzman Yazılımı</td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kiti (parça no 5067-1504)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>PCR Şerit Tüpler</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>PCR Şerit Kapaklar</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyucuklu Çalışma Rafı</td><td>Agilent Technologies</td><td>410094</td><td></td></tr><tr><td>Balık Türleri Tanımlama Sistemi DNA İzolasyon Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>İletişim</td><td></td></tr><tr><td>Balık Türleri Tanımlama Sistemi PCR-RFLP Reaktif Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>İletişim</td><td></td></tr><tr><td>RFLP Matcher Yazılımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>İletişim</td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol, 200 proof (USP kalite veya eşdeğeri)</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Steril, nükleaz içermeyen su</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyiciler</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>65 dereceye ayarlanmış inkübatör veya su banyosu&amp;#x00B0;C</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Steril cam şişe veya polipropilen tüp (örneğin 14 ml BD Falcon polipropilen)</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>yuvarlak tabanlı tüpler veya 50 ml'lik BD Falcon polipropilen konik tüpler)</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 1,5 ml</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml tüp rafı</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr></tbody></table>

dna tabanlı balık türleri tanımlama protokolü

DNA-based Fish Species Identification Protocol

Biz, taze ve işlenmiş deniz ürünleri örnekleri mevcut balık türleri belirlemek için DNA tabanlı, hızlı, basit ve doğru bir tarama yöntemi geliştirdik. Bu çok yönlü bir yöntem Agilent 2100 Bioanalyzer giderilmiş ve RFLP desen eşleştirme yazılımı kullanarak doğru türe uygun olabilir parçasının kalıplarını üretmek için RFLP (RFLP) analizi takip balık numunelerinde çıkarılan genomik DNA, PCR kullanmaktadır. Balık tanımlama yöntemi balık örneklerinden DNA izole etmek için basit, güvenilir, spin kolon tabanlı protokol kullanır. Örnekleri çözüm içine nükleik asitlerin serbest proteinaz K ile tedavi edilir. Sonra bağlayıcı tampon örnek askıya alınması ve silika bazlı bir fiber matris içeren bir mikro-spin fincan üzerine yükleme DNA izole edilmiştir. Fiber matris örnek bağlama nükleik asitler. Immobilize nükleik asitler kirleri çıkarmak için yıkanır ve toplam nihai hacmi 100 ul DNA kurtarılır. İzole edilen DNA, tüm balıklar genomlarındaki bulundu dizileri bağlamak sağlanan primerleri ile PCR için hazır. PCR ürünleri daha sonra üç farklı restriksiyon enzimleri ile sindirilir ve Agilent 2100 Bioanalyzer çözümlenir. Sindirim reaksiyonlarda üretilen parçası uzunlukları ticari ilgili balık türlerinin deneysel olarak elde edilen RFLP desenler içeren bir veritabanı yazılımı ile eşleşen RFLP desen kullanarak, DNA örneği hazırlanan balık türlerini belirlemek için kullanılabilir.

Bu yayın Agilent Balık Türleri Tanımlama Sistemi, DNA ayıklanması ve, PCR ve RFLP analizi yapan bir balık türü tanımlamak için nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Taze ve işlenmiş deniz ürünü örneklerinde bulunan balık türlerini tanımlamak için hızlı, basit ve doğru bir DNA tabanlı tarama yöntemi geliştirdik. ...

Balık Türü Tanımlama Sistemi, belirli bir örnekte bulunan balık türlerini tanımlamak için kullanılan basit, hızlı ve doğru bir DNA tabanlı yöntemdir. Nükleik asitlerin çözeltiye salınması için balık örnekleri proteinaz K ile işlenir. Ardından balık genomik DNA'sı izole edilir ve tüm balık genomlarında bulunan dizilere bağlanan primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.PCR ürünleri daha sonra üç farklı restriksiyon enzimi ile sindirilir ve Agilent 2100 bioanalyzer cihazında çözünürlüğe ayrılır. Sindirim reaksiyonları sonucunda oluşan fragman uzunlukları, restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi veya RFLP patern eşleştirme yazılımı kullanılarak balık türünün belirlenmesinde kullanılabilir. Merhaba, ben Agilent Technologies'den Rachel Formosa.Bugün size DNA tabanlı balık türü tanımlama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedür; taze, dondurulmuş, kıyılmış, pişirilmiş, kurutulmuş veya başka şekilde işlenmiş örneklerde bulunan balık türlerini belirlemenizi sağlayan bir tarama yöntemidir. Ve bu işlem, bir iş gününden daha kısa bir sürede tamamlanabilir.Bu prosedürü, deniz ürünleri endüstrisi için büyük önem taşıyan ve ürün değişimi ile hatalı etiketlemenin önemli ekonomik, çevresel ve gıda güvenliği sonuçları doğurabileceği deniz ürünleri özgünlüğünü incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca, balık türlerini görsel tanımlama ve diğer geleneksel yöntemlerle belirlemek özellikle zor olabilir. Balık işlendikten sonra, DNA testi çok daha doğru ve güvenilir bir sonuç sağlar.Öyleyse başlayalım. Her bir balık için 10 ila 1000 miligram çiğ veya pişmiş balık dokusu örneğini 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirerek DNA ekstraksiyonu için örnekleri hazırlamaya başlayın. Her örneğe 220 mikrolitre taze hazırlanmış proteinaz K çözeltisi ekleyin ve pipetle yukarı aşağı hareketlerle karıştırın.Tüpleri 65 °C'de 10 dakika inkübe edin, ardından sindirilmemiş dokuları çöktürmek için 14.000 G'de üç ila beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra, dipteki sindirilmemiş materyalleri ve üstteki yağlı materyalleri almamaya dikkat ederek, her bir süpernatanttan 150 µL'yi yeni bir 1,5 mL tüpe dikkatle aktarın. Süpernatant artık genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılacaktır.Her bir örneğe 500 µL nükleik asit bağlama tamponu ekleyerek genomik DNA ekstraksiyonuna başlayın. Bu işlem, toplam örnek hacmini 650 µL'ye çıkaracaktır. Örnek, homojen hale gelene kadar vortekslenmelidir.Ardından, her örneği kit içerisinde sağlanan iki mililitrelik taşıyıcı tüplerden birine yerleştirilmiş olan bir DNA bağlama spin kupuna aktarın. Tüpün kapağını spin kupasının üzerine bastırarak kapatın. DNA'yı spin kupu matrisine yüklemek için örnekleri 14, 000 Gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra spin kaplarını çıkarın, filtratı atın ve kapları tekrar reseptör tüplerine yerleştirin. 500 microliter bir x yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Tüplerin kapaklarını kapatın ve santrifüj işlemini tekrarlayın.Filtratı atın ve spin kaplarını tekrar reseptör tüplerine yerleştirin. Şimdi 500 µL %80 ethanol ekleyin. Tüpün kapağını kapatın ve bir dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjleyin.Üçüncü yıkamadan sonra %80 etanol ile etanol yıkamasını iki kez daha tekrarlayın, süzüntüleri atın. Spin kaplarını reseptör tüplerine yerleştirin ve bu kez fiber matrisi kurutmak için iki dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi spin kaplarını 1,5 mililitrelik toplama tüplerine aktarın.Her bir spin kupındaki fiber matrisin üzerine doğrudan 100 µL elüsyon tamponu ekleyin. Ardından toplama tüpü kapaklarını spin kuplarına takın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, örnekleri bir dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.Ardından, santrifüj başlığını atın ve tüpleri kapatın. DNA konsantrasyonları ölçüldüğünde, mikrolitre başına beş nanogram ile mikrolitre başına 500 nanogram arasında konsantrasyonlar beklenir. DNA artık dört °C'de bir aya kadar saklanabilir; uzun süreli saklama için DNA'yı -20 veya -80 °C'ye yerleştirin.P-C-R-R-F-L-P reaktif kitinde sağlanan primerler ve reaktifleri kullanarak PCR gerçekleştirin. Beraberindeki yazılı protokole göre, PCR işlemi sırasında pozitif kontrol ve şablon kontrolü (no template control) dahil olmak üzere her örneğin çift kopya (duplicate) olarak çalıştırılması önerilir. DTE E one, HAE three ve NL three ile sindirimler için; 1,5 µL steril distile su, 0,5 µL 10 x enzim tamponu ve 0,5 µL 10 x enzimi sırasıyla birleştirerek restriksiyon enzimi master karışımlarını hazırlayın.Tüm numuneler artı bir reaksiyon hacmi kadar, fazla miktarda fourex three re ajan karışımı hazırlayın. Ardından, numune ve enzim adı ile etiketlenmiş her bir reaksiyon tüpüne 2,5 µL dağıtın. PCR tamamlandığında, numuneleri termal döngüleyiciden çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.Her bir PCR ürününden 2,5 µL'yi, o reaksiyona ait üç kısıtlama sindirim tüpünün her birine ekleyin. DDE bir HAE üç ve NLA üç. Ardından vortekslenmesini sağlayın.Sindirimleri kısaca santrifüjleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Daha uygunsa, sindirimler gece boyu da inkübe edilebilir. Sindirim işleminin ardından, reaksiyonları 65 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, reaksiyonu durdurmak için her tüpe 1 µL 60 mM EDTA ekleyin ve vortexleyin. Agilent bioanalyzer reaktif kitini kullanarak, restriksiyon sindirim ürünlerini kit kılavuzuna uygun olarak bir DNA çipinin kuyucuklarına hazırlayın ve yükleyin. Her örnek için, her üç sindirim ürünü de aynı çipe yüklenmelidir.Ardından çipi vorteksleyin ve cihaza yerleştirin. Çalışma tamamlandıktan sonra analiz bağlamına gidin ve çip özet sekmesini seçin. Örnek adı alanına, test DNA örnekleri için balık türlerini tanımlamak amacıyla çipteki 12 kuyucuğun tamamı için bir örnek adı girin.Dosyaya tıklayarak RFLP çözücü programını başlatın. Ardından XAD dosyasını açın. Açma iletişim kutusu açılacaktır.Şimdi kullanılan DNA çipi için XAD dosyasını seçin. Çipe yüklenen örneklerin listesini görmek için aça tıklayın. İlk DNA örneğine karşılık gelen üç digesti seçin.Enzim sütunu altında, "min peak height as percent of lower marker" (alt markörün yüzde olarak minimum pik yüksekliği) olarak etiketlenen alana kullanılan restriksiyona enzimlerini belirtin. Varsayılan değer, gerekirse %10'dur. Bu değer, gözden kaçan küçük pikleri tanımlamak için düşürülebilir veya elektroferogramdaki spesifik olmayan gürültüden kaynaklanan pikleri elemek için yükseltilebilir.Minimum pik yüksekliği değerinde herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra reintegrate seçeneğine tıklayın. Şimdi diyalog kutusunun altındaki calc düğmesine tıklayın. Bioanalyzer çalışmasından elde edilen fragman uzunluğu verileri yazılım alanlarını dolduracaktır.Ardından ekranın sol üst köşesindeki skor açılır listesinden dice seçeneğini seçin. Balık örneği tek bir balık türünden veya bir karışımdan oluşuyorsa ya da örneğin bir karışım içerme ihtimali varsa, ekranın alt kısmında yer alan birleşik skor listesi başlıklı tabloya bakın. En iyi tür eşleşmeleri, her üç sindirim reaksiyonunun sonuçlarına göre belirlenir.Bir puanla mükemmel eşleşmeler yeşil ile vurgulanmıştır. Yakın eşleşmeler ekranın üst kısmında sarı ile vurgulanmıştır. Alt kesme değeri, analizde kullanılan minimum fragman boyutunu belirtir ve eşleşme tolerans değeri, bir fragmanın eşleşme olarak kabul edilmesi için öngörülen fragman uzunluğuna ne kadar yakın olması gerektiğini belirler.Gösterilen değerler varsayılan ayarlardır ve ayarlanabilir. Uçtaki kalan DNA örneklerinin analizi için bu adımları tekrarlayın. Dört farklı balık türünden alınan DNA örnekleri, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak izole edilmiş, amplifiye edilmiş ve sindirilmiştir.Agilent Bioanalyzer ve RFLP dekoderi kullanılarak hazırlanan, restriksiyon digest örneklerini gösteren bir bioanalyzer jeli burada sunulmuştur. Balıkların tanımlanması için yazılımdaki bükülme paternleri kullanılmıştır. İlk örnek doğru bir şekilde alabalık, ikincisi ton balığı ve üçüncüsü kaya toprağı olarak tanımlanmıştır.Ve son örnek olarak spesifik kod. Agilent'in P-C-R-R-F-L-P yöntemini kullanarak DNA tabanlı balık türü tanımlamasının nasıl yapılacağını size göstermiş olduk. Yöntem çok hassas olduğu için, bu prosedürü uygularken örneklerin çapraz kontaminasyonuna karşı dikkatli olmak önemlidir.İşte böyle. Artık örneklerinizde bulunan balık türlerini hızlı, kolay ve doğru bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı biliyorsunuz. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

dna-based-fish-species-identification-protocol

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Su örneklerinin bir filtre kartuşu ile filtrelenmesi ve filtreyi çıkarmak için muhafazayı kesmek zorunda kalmadan çevresel DNA'nın (eDNA) çıkarılması için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, balıklardan alınan eDNA'yı metabarkodlama için geliştirilmiştir, ancak diğer organizmalardan alınan eDNA'ya da uygulanabilir.

Filtrasyon Su Örnekleri ve Çevre DNA Ekstraksiyon için bir Filtre Kartuşu Kullanımı

En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Laboratuvar muhafazasını turkuaz ev ve verimli bir şekilde standart Zebra balığı özellikleri için kullanılan aynı altyapı istihdam Merkezi su filtrasyon sistemi, bireysel balık binlerce yükseltmek killifish ölçeklendirilecektir. Burada verimli killifish bakım izin standart yordamların listesini ayrıntılı.

Laboratuvar konut, turkuaz Killifish (Nothobranchius furzeri) için bir iletişim kuralı

Yabani balıklar sağlık sucul ekosistem sağlığı bir göstergesi olarak kullanılabilir. Nekropsi-esaslı balık sağlık değerlendirmeler belgeleri görünür lezyonlar veya anormallikleri, doku mikroskobik değerlendirme, gen ekspresyonu ve diğer daha ayrıntılı toplamak için fırsat yanı sıra durum endeksi hesaplamak için kullanılan veri sağlamak analizleri.

Vahşi balık Nekropsi tabanlı sağlık değerlendirmesi

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

Bu çalışma, zebrafish larvalarında yüz yapısındaki değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım (tpsDigs2, MorphoJ ve PAST) kullanılarak kraniofasiyal kıkırdak şeklinin nicelendirilmesine yönelik bir protokolü tanımlar.

Şekil Morfometrik Analizleri: Zebrafish'te Kraniofasiyal Şekil Nicelesi için Analiz Yazılımı Araç Kutusu

Öğrenin, Agilent balık türü tanımlama sistemiyle DNA tabanlı balık türlerini belirleme yöntemini. PCR amplifikasyonu ve RFLP analizi kullanarak deniz ürünleri otantikliğini hızlı ve doğru şekilde test edin.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Daha fazla video keşfet