DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Balık Türleri Tanımlama Sistemi, belirli bir örnekte bulunan balık türlerini tanımlamak için basit, hızlı ve doğru DNA tabanlı bir yöntemdir. Balık örnekleri, nükleik asitleri çözeltiye salmak için proteinaz K ile muamele edilir. Balık genomik DNA'sı daha sonra izole edilir ve tüm balık genomlarında bulunan dizilere bağlanan primerler kullanılarak PCR amplifiye edilir.

PCR ürünleri daha sonra üç farklı restriksiyon enzimi ile sindirilir ve Agilent 2100 biyoanalizöründe çözülür. Sindirim reaksiyonlarında üretilen parça uzunlukları, kısıtlama parçası uzunluk polimorfizmi veya RFLP model eşleştirme yazılımı kullanılarak balık türlerini belirlemek için kullanılabilir. Merhaba, ben Agilent Technologies'den Rachel Formosa.

Bugün size DNA tabanlı balık türlerinin tanımlanması için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedür, taze, dondurulmuş, kıyılmış, pişirilmiş, kurutulmuş veya başka bir şekilde işlenmiş numunelerde bulunan balık türlerini tanımlamanıza izin veren bir tarama yöntemidir. Ve bu bir iş gününden daha kısa sürede gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü, deniz ürünleri endüstrisi için çok önemli olan deniz ürünlerinin gerçekliğini incelemek için kullanıyoruz, çünkü ikame ve yanlış etiketleme önemli ekonomik, çevresel ve gıda güvenliği sonuçlarına yol açabilir. Ayrıca, balık türlerini görsel tanımlama ve diğer geleneksel yöntemlerle belirlemek özellikle zor olabilir. Bir balık işlendikten sonra, DNA testi çok daha doğru ve güvenilir bir sonuç verir.

Öyleyse başlayalım. Her balığa 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine 1.5 mililitre mikro santrifüj tüplerine her çiğ veya pişmiş balık dokusu örneğinden 10 ila 1000 miligram yerleştirerek DNA ekstraksiyonu için örnekler hazırlamaya başlayın. 220 mikrolitre taze hazırlanmış proteinaz kutu çözeltisinden numune alın ve yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sindirilmemiş dokuları peletlemek için inkübasyon santrifüjünü takiben tüpleri 14.000 G'de üç ila beş dakika boyunca 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, her bir süpernatanın 150 mikrolitresini dikkatlice 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın, altta sindirilmemiş maddelerden ve üstte bulunan yağlı maddelerden kaçının. Süpernatan şimdi genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılacak.

Her numuneye 500 mikrolitre nükleik asit bağlama tamponu ekleyerek genomik DNA ekstraksiyonuna başlayın. Bu, toplam numune hacmini 650 mikrolitreye getirecektir. Numuneyi homojen hale gelene kadar vorteksleyin.

Daha sonra, her bir numuneyi, kitte verilen iki mililitrelik hazne tüplerinden birine yerleştirilmiş bir DNA bağlayıcı döndürme kabına aktarın. Tüpün kapağını sıkma kabının üstüne oturtun. DNA'yı spin cup matrisine yüklemek için numuneleri 14.000 Gs'de bir dakika döndürün.

Santrifüjlemeden sonra, döndürme kaplarını çıkarın, süzüntüyü atın ve kapları tekrar hazne tüplerine yerleştirin. 500 mikrolitre bir x yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri kapatın ve santrifüjlemeden sonra tekrar santrifüjleyin.

Süzüntüyü atın ve tekrar sıkma kaplarını hazne tüplerine geri yerleştirin. Şimdi 500 mikrolitre% 80 etanol ekleyin. Tüpü kapatın ve bir dakika boyunca 14.000 Gs'de döndürün.

Üçüncü yıkamadan sonra etanol yıkamasını iki kez daha tekrarlayın% 80 etanol içinde, filtratları atın. Hazne tüplerindeki sıkma kaplarını değiştirin ve bu sefer fiber matrisi kurutmak için iki dakika döndürün. Şimdi sıkma kaplarını 1,5 mililitrelik toplama tüplerine aktarın.

Her bir spin fincanına doğrudan fincanın içindeki fiber matrisin üzerine 100 mikrolitre evrim tamponu ekleyin. Daha sonra toplama tüpü kapaklarını döndürme kaplarına takın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneleri bir dakika boyunca maksimum hızda döndürün.

Ardından, döndürme kabını atın ve tüpleri kapatın. DNA konsantrasyonları ölçülürse, mikrolitre başına beş nanogram ile mikrolitre başına 500 nanogram arasında değişen konsantrasyonlar beklenir. DNA artık uzun süreli depolama için bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir, DNA'yı eksi 20 veya eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.

P-C-R-R-F-L-P reaktif kitinde sağlanan primerleri ve reaktifleri kullanarak PCR gerçekleştirin. Ekteki yazılı protokole göre, PCR çalışırken pozitif anti no şablon kontrolü de dahil olmak üzere her numunenin iki kez çalıştırılması önerilir. Aşağıdaki bileşenleri sırayla birleştirerek DTE E, bir, HAE, üç ve NL üç ile sindirimasyonlar için kısıtlama enzimi ana karışımları hazırlayın: 1.5 mikrolitre steril damıtılmış su, 0.5 mikrolitre 10 x enzim tamponu ve 0.5 mikrolitre 10 x enzim

Tüm numuneler için yeterli artı bir reaksiyon hacmi, fazla fourex üç reaktif karışımı hazırlayın. Daha sonra, numune ve enzim adı ile etiketlenmiş her bir reaksiyon tüpüne 2.5 mikrolitre dağıtın. PCR tamamlandıktan sonra, numuneleri termal döngüleyiciden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Bu reaksiyon için üç kısıtlama sindirim tüpünün her birine her bir PCR ürününden 2.5 mikrolitre ekleyin. DDE bir, HAE üç ve NLA üç. Sonraki girdap.

Sindirimi kısaca santrifüjleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha uygunsa, sindirimler gece boyunca da inkübe edilebilir. Sindirimi takiben, reaksiyonları 65 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra reaksiyonu ve girdabı sonlandırmak için her tüpe bir mikrolitre 60 milimolar EDTA ekleyin. Agilent biyoanalizör reaktif kitini kullanarak, kısıtlama sindirimini kit kılavuzuna göre A DNA çipinin kuyularına hazırlayın ve yükleyin. Her numune için, üç özet de aynı çipe yüklenmelidir.

Ardından çipi girdaplayın ve makineye yükleyin. Çalıştırma bittikten sonra tahlil bağlamına gidin ve çip özeti sekmesini seçin. Numune adı alanına, test DNA numuneleri için balık türünü tanımlamak üzere çipin 12 kuyusunun tümü için bir numune adı girin.

Dosyaya tıklayarak RFLP kod çözücü programını başlatın. Ardından XAD dosyasını açın. Açık iletişim kutusu açılacaktır.

Şimdi kullanılan DNA çipi için XAD dosyasını seçin. Ve çipe yüklenen örneklerin bir listesini görmek için aç'a tıklayın. İlk DNA örneğine karşılık gelen üç özeti seçin.

Enzim sütununun altında, minimum tepe yüksekliği etiketli alanda kullanılan kısıtlama enzimlerini alt işaretleyicinin yüzdesi olarak belirtin. Gerekirse varsayılan değer %10'dur. Bu değer, elektroferogramdaki spesifik olmayan gürültüden kaynaklanan tepe noktalarını atmak için gözden kaçan veya yükseltilen küçük tepe noktalarını belirlemek için düşürülebilir.

Minimum tepe yüksekliği değerinde herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra yeniden entegre et'i tıklayın. Şimdi diyalog kutusunun altındaki calc'ı tıklayın. Biyoanalizör çalışmasından elde edilen parça uzunluğu verileri, yazılım alanlarını dolduracaktır.

Ardından, ekranın sol üst köşesindeki puan açılır listesinde zar'ı seçin. Balık numunesi tek bir balık türünden veya karışımından oluşuyorsa, numune bir karışımdan oluşuyorsa, ekranın alt kısmındaki tablo birleşik skor listesi olarak etiketlenmiştir. En iyi tür, üç sindirim reaksiyonunun sonuçlarına göre eşleşir.

Bir puana sahip mükemmel eşleşmeler yeşil renkle vurgulanır. Yakın maçlar ekranın üst kısmında sarı renkle vurgulanır. Daha düşük kesme değeri, analizde kullanılan minimum parça boyutunu belirtir ve eşleşme toleransı değeri, bir parçanın eşleşme olarak kabul edilmesi için tahmin edilen parçaya ne kadar yakın olması gerektiğini belirler.

Gösterilen değer varsayılan ayarlardır ve ayarlanabilir. Uçta kalan DNA örneklerinin analizi için bu adımları tekrarlayın. Dört farklı balık türünden alınan DNA örnekleri, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak izole edildi, çoğaltıldı ve sindirildi.

Kısıtlama sindirim örneklerini gösteren bir biyoanalizör jeli, Agilent Bioanalyzer ve RFLP kod çözücü kullanılarak burada gösterilmektedir. Burada balığı tanımlamak için yazılım bükme kalıpları kullanılır. İlk örnek doğru bir şekilde alabalık, ikincisi ton balığı, üçüncüsü kaya toprağı olarak tanımlanır.

Ve son örnek belirli morina balığı olarak. Size az önce agilent'in P-C-R-R-F-L-P yöntemini kullanarak DNA tabanlı balık türü tanımlamasını nasıl yapacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, yöntem çok hassas olduğu için numunelerin çapraz kontaminasyonunu önlemek önemlidir.

İşte bu kadar. Artık numunelerinizde bulunan balık türlerini hızlı, kolay ve doğru bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı biliyorsunuz. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.