DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Balık Türü Tanımlama Sistemi, belirli bir örnekte bulunan balık türlerini tanımlamak için kullanılan basit, hızlı ve doğru bir DNA tabanlı yöntemdir. Nükleik asitlerin çözeltiye salınması için balık örnekleri proteinaz K ile işlenir. Ardından balık genomik DNA'sı izole edilir ve tüm balık genomlarında bulunan dizilere bağlanan primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.

PCR ürünleri daha sonra üç farklı restriksiyon enzimi ile sindirilir ve Agilent 2100 bioanalyzer cihazında çözünürlüğe ayrılır. Sindirim reaksiyonları sonucunda oluşan fragman uzunlukları, restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi veya RFLP patern eşleştirme yazılımı kullanılarak balık türünün belirlenmesinde kullanılabilir. Merhaba, ben Agilent Technologies'den Rachel Formosa.

Bugün size DNA tabanlı balık türü tanımlama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedür; taze, dondurulmuş, kıyılmış, pişirilmiş, kurutulmuş veya başka şekilde işlenmiş örneklerde bulunan balık türlerini belirlemenizi sağlayan bir tarama yöntemidir. Ve bu işlem, bir iş gününden daha kısa bir sürede tamamlanabilir.

Bu prosedürü, deniz ürünleri endüstrisi için büyük önem taşıyan ve ürün değişimi ile hatalı etiketlemenin önemli ekonomik, çevresel ve gıda güvenliği sonuçları doğurabileceği deniz ürünleri özgünlüğünü incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca, balık türlerini görsel tanımlama ve diğer geleneksel yöntemlerle belirlemek özellikle zor olabilir. Balık işlendikten sonra, DNA testi çok daha doğru ve güvenilir bir sonuç sağlar.

Öyleyse başlayalım. Her bir balık için 10 ila 1000 miligram çiğ veya pişmiş balık dokusu örneğini 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirerek DNA ekstraksiyonu için örnekleri hazırlamaya başlayın. Her örneğe 220 mikrolitre taze hazırlanmış proteinaz K çözeltisi ekleyin ve pipetle yukarı aşağı hareketlerle karıştırın.

Tüpleri 65 °C'de 10 dakika inkübe edin, ardından sindirilmemiş dokuları çöktürmek için 14.000 G'de üç ila beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra, dipteki sindirilmemiş materyalleri ve üstteki yağlı materyalleri almamaya dikkat ederek, her bir süpernatanttan 150 µL'yi yeni bir 1,5 mL tüpe dikkatle aktarın. Süpernatant artık genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılacaktır.

Her bir örneğe 500 µL nükleik asit bağlama tamponu ekleyerek genomik DNA ekstraksiyonuna başlayın. Bu işlem, toplam örnek hacmini 650 µL'ye çıkaracaktır. Örnek, homojen hale gelene kadar vortekslenmelidir.

Ardından, her örneği kit içerisinde sağlanan iki mililitrelik taşıyıcı tüplerden birine yerleştirilmiş olan bir DNA bağlama spin kupuna aktarın. Tüpün kapağını spin kupasının üzerine bastırarak kapatın. DNA'yı spin kupu matrisine yüklemek için örnekleri 14, 000 Gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra spin kaplarını çıkarın, filtratı atın ve kapları tekrar reseptör tüplerine yerleştirin. 500 microliter bir x yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Tüplerin kapaklarını kapatın ve santrifüj işlemini tekrarlayın.

Filtratı atın ve spin kaplarını tekrar reseptör tüplerine yerleştirin. Şimdi 500 µL %80 ethanol ekleyin. Tüpün kapağını kapatın ve bir dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjleyin.

Üçüncü yıkamadan sonra %80 etanol ile etanol yıkamasını iki kez daha tekrarlayın, süzüntüleri atın. Spin kaplarını reseptör tüplerine yerleştirin ve bu kez fiber matrisi kurutmak için iki dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi spin kaplarını 1,5 mililitrelik toplama tüplerine aktarın.

Her bir spin kupındaki fiber matrisin üzerine doğrudan 100 µL elüsyon tamponu ekleyin. Ardından toplama tüpü kapaklarını spin kuplarına takın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, örnekleri bir dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.

Ardından, santrifüj başlığını atın ve tüpleri kapatın. DNA konsantrasyonları ölçüldüğünde, mikrolitre başına beş nanogram ile mikrolitre başına 500 nanogram arasında konsantrasyonlar beklenir. DNA artık dört °C'de bir aya kadar saklanabilir; uzun süreli saklama için DNA'yı -20 veya -80 °C'ye yerleştirin.

P-C-R-R-F-L-P reaktif kitinde sağlanan primerler ve reaktifleri kullanarak PCR gerçekleştirin. Beraberindeki yazılı protokole göre, PCR işlemi sırasında pozitif kontrol ve şablon kontrolü (no template control) dahil olmak üzere her örneğin çift kopya (duplicate) olarak çalıştırılması önerilir. DTE E one, HAE three ve NL three ile sindirimler için; 1,5 µL steril distile su, 0,5 µL 10 x enzim tamponu ve 0,5 µL 10 x enzimi sırasıyla birleştirerek restriksiyon enzimi master karışımlarını hazırlayın.

Tüm numuneler artı bir reaksiyon hacmi kadar, fazla miktarda fourex three re ajan karışımı hazırlayın. Ardından, numune ve enzim adı ile etiketlenmiş her bir reaksiyon tüpüne 2,5 µL dağıtın. PCR tamamlandığında, numuneleri termal döngüleyiciden çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.

Her bir PCR ürününden 2,5 µL'yi, o reaksiyona ait üç kısıtlama sindirim tüpünün her birine ekleyin. DDE bir HAE üç ve NLA üç. Ardından vortekslenmesini sağlayın.

Sindirimleri kısaca santrifüjleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Daha uygunsa, sindirimler gece boyu da inkübe edilebilir. Sindirim işleminin ardından, reaksiyonları 65 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için her tüpe 1 µL 60 mM EDTA ekleyin ve vortexleyin. Agilent bioanalyzer reaktif kitini kullanarak, restriksiyon sindirim ürünlerini kit kılavuzuna uygun olarak bir DNA çipinin kuyucuklarına hazırlayın ve yükleyin. Her örnek için, her üç sindirim ürünü de aynı çipe yüklenmelidir.

Ardından çipi vorteksleyin ve cihaza yerleştirin. Çalışma tamamlandıktan sonra analiz bağlamına gidin ve çip özet sekmesini seçin. Örnek adı alanına, test DNA örnekleri için balık türlerini tanımlamak amacıyla çipteki 12 kuyucuğun tamamı için bir örnek adı girin.

Dosyaya tıklayarak RFLP çözücü programını başlatın. Ardından XAD dosyasını açın. Açma iletişim kutusu açılacaktır.

Şimdi kullanılan DNA çipi için XAD dosyasını seçin. Çipe yüklenen örneklerin listesini görmek için aça tıklayın. İlk DNA örneğine karşılık gelen üç digesti seçin.

Enzim sütunu altında, "min peak height as percent of lower marker" (alt markörün yüzde olarak minimum pik yüksekliği) olarak etiketlenen alana kullanılan restriksiyona enzimlerini belirtin. Varsayılan değer, gerekirse %10'dur. Bu değer, gözden kaçan küçük pikleri tanımlamak için düşürülebilir veya elektroferogramdaki spesifik olmayan gürültüden kaynaklanan pikleri elemek için yükseltilebilir.

Minimum pik yüksekliği değerinde herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra reintegrate seçeneğine tıklayın. Şimdi diyalog kutusunun altındaki calc düğmesine tıklayın. Bioanalyzer çalışmasından elde edilen fragman uzunluğu verileri yazılım alanlarını dolduracaktır.

Ardından ekranın sol üst köşesindeki skor açılır listesinden dice seçeneğini seçin. Balık örneği tek bir balık türünden veya bir karışımdan oluşuyorsa ya da örneğin bir karışım içerme ihtimali varsa, ekranın alt kısmında yer alan birleşik skor listesi başlıklı tabloya bakın. En iyi tür eşleşmeleri, her üç sindirim reaksiyonunun sonuçlarına göre belirlenir.

Bir puanla mükemmel eşleşmeler yeşil ile vurgulanmıştır. Yakın eşleşmeler ekranın üst kısmında sarı ile vurgulanmıştır. Alt kesme değeri, analizde kullanılan minimum fragman boyutunu belirtir ve eşleşme tolerans değeri, bir fragmanın eşleşme olarak kabul edilmesi için öngörülen fragman uzunluğuna ne kadar yakın olması gerektiğini belirler.

Gösterilen değerler varsayılan ayarlardır ve ayarlanabilir. Uçtaki kalan DNA örneklerinin analizi için bu adımları tekrarlayın. Dört farklı balık türünden alınan DNA örnekleri, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak izole edilmiş, amplifiye edilmiş ve sindirilmiştir.

Agilent Bioanalyzer ve RFLP dekoderi kullanılarak hazırlanan, restriksiyon digest örneklerini gösteren bir bioanalyzer jeli burada sunulmuştur. Balıkların tanımlanması için yazılımdaki bükülme paternleri kullanılmıştır. İlk örnek doğru bir şekilde alabalık, ikincisi ton balığı ve üçüncüsü kaya toprağı olarak tanımlanmıştır.

Ve son örnek olarak spesifik kod. Agilent'in P-C-R-R-F-L-P yöntemini kullanarak DNA tabanlı balık türü tanımlamasının nasıl yapılacağını size göstermiş olduk. Yöntem çok hassas olduğu için, bu prosedürü uygularken örneklerin çapraz kontaminasyonuna karşı dikkatli olmak önemlidir.

İşte böyle. Artık örneklerinizde bulunan balık türlerini hızlı, kolay ve doğru bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı biliyorsunuz. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.